Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لبرنامج حماية الأبحاث البشرية في UCSD (181180).
1. التعريفي endoderm نهائي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (اليوم 1 - 3)
<ol><li>عامل نمو ذوبان ببطء خفضت (GFR) الطابق السفلي غشاء (BM) مصفوفة المتوسطة على الجليد 30 دق...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

يعتمد التمايز الناجح لأجهزة الرئة الكاملة ثلاثية الأبعاد (WLO) على بروتوكول متعدد الخطوات لمدة 6 أسابيع مع الاهتمام بالتفاصيل ، بما في ذلك وقت التعرض لعوامل النمو والجزيئات الصغيرة ، والكثافة الخلوية بعد التمرير ، ونوعية hiPSCs. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، راجع الجدول 2. يجب أن تكون hiPS...

الرئة هي معقدة، غير متجانسة، الجهاز الديناميكي الذي يتطور في ست مراحل متميزة - الجنينية، الزائفة، القناني، saccular، الحويصلات، والنضج الأوعية الدموية الدقيقة1،2. تحدث المرحلتان الأخيرتان قبل الولادة وبعدها في النمو البشري بينما تحدث المراحل الأربع الأولى حصريا أثناء نمو الجنين ما لم تحدث الولادة المبتسرة3. تبدأ المرحلة الجنينية في طبقة جرثومة الجلد وتنتهي ببراعم القصبة الهوائية والرئة الناشئة. يحدث تطور الرئة جزئيا عن طريق الإشارة بين الخلايا الظهارية والخلايا الظهارية4. هذه التفاعلات تؤدي إلى تفريع الرئة، والانتشار، وتحديد المصير الخلوي والتمايز الخلوي للرئة النامية. تنقسم الرئة إلى مناطق إجراء (القصبة الهوائية إلى الشعب الهوائية الطرفية) ومناطق الجهاز التنفسي (القصبات الهوائية التنفسية إلى الحويصلات الهوائية). كل منطقة تحتوي على أنواع فريدة من الخلايا الظهارية; بما في ذلك القاعدية، إفراز، ciliated، فرشاة، الغدد الصماء العصبية، والخلايا الأيونية في مجرى الهواء إجراء5، تليها الخلايا السنفية النوع الأول والثاني في ظهارة الجهاز التنفسي6. الكثير لا يزال غير معروف حول تطوير والاستجابة لإصابة أنواع الخلايا المختلفة. تمكن نماذج الأعضاء الرئوية المشتقة من iPSC من دراسة الآليات التي تدفع نمو الرئة البشرية ، وآثار الطفرات الوراثية على الوظيفة الرئوية ، واستجابة كل من الظهارة والميسينشيم للعوامل المعدية دون الحاجة إلى أنسجة الرئة البشرية الأولية.
علامات المقابلة لمختلف مراحل التمايز الجنيني وتشمل CXCR4، cKit، FOXA2، وS SOX17 لاندوديرم نهائي (DE)7، FOXA2، TBX1، وS SOX2 لاندوديرم الأمامية (AFE)8، وNKX2-1 لخلايا السلف الرئة في وقت مبكر9. في تطور الرئة الجنينية ، يقسم الرغوت إلى المريء الظهري والرغامى البطنية. براعم الرئتين اليمنى واليسارية تظهر كما اثنين من النعومات المستقلة حول bud10 القصبة الهوائية. أثناء المورفوجين المتفرع ، ينتج الميسنشيم المحيط بالظهارة أنسجة مرنة وعضلات ناعمة وغضاريف وvasculature11. التفاعل بين الظهارة والميسينشيم ضروري لتطور الرئة الطبيعي. وهذا يشمل إفراز FGF1012 من قبل mesenchyme وSHH13 التي تنتجها ظهارة.
هنا، ونحن نصف بروتوكول للتمايز الموجه من hiPSCs إلى ثلاثي الأبعاد (3D) الأجهزة الرئوية كلها (WLO). في حين أن هناك نهج مماثلة التي تتضمن عزل خلايا السلف الرئة عن طريق الفرز في مرحلة LPC لجعل الأجهزة العضوية مثل السنفية 14,15 (البعيدة) أو organoids airway16 (قريبة) ، أو توليد الفيرويدات الأمامية البطنية لجعل أعضاء الرئة البشرية التي تعبر عن الخلايا الحويصلة الهوائية وعلامات الميسنشيمال وبراعم تلميح ، قوة هذه الطريقة هي إدراج كل من أنواع الخلايا الظهارية الرئوية والخلية الظهارية mesenchymal لنمط وتنسيق مورفوجينيسيس متفرعة الرئة، والنضج، والتوسع في المختبر.
يستخدم هذا البروتوكول جزيئات صغيرة وعوامل نمو لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات من خلال بطانة الرحم النهائية ، واندوديرم الأمامي ، وخلايا سلف الرئة. ثم يتم حث هذه الخلايا في 3D الأجهزة الرئوية الكاملة من خلال خطوات النمو الهامة، بما في ذلك المتفرعة والنضج. 10- يرد موجز بروتوكول التمايز في الشكل 1 أ مع صور تمثيلية من التمايز بين الاندوديرمال والأعضاء تظهر في الشكل 1ب. الشكل 1c،d تظهر تفاصيل التعبير الجيني للتمايز إندوديرمال، فضلا عن التعبير الجيني لكل من المجموعات القريبة والبعدية من الخلايا الظهارية الرئة بعد الانتهاء من التمايز.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

كان من الصعب دراسة نمو الرئة البشرية والمرض بسبب عدم وجود نظم نموذجية ذات صلة بيولوجيا في المختبر . يمكن تمييز الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSCs) بشكل تدريجي إلى أعضاء رئوية متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، مصنوعة من مجموعات خلايا ظهارية ونسينشيمالية. نحن تلخيص الإشارات التنموية الجنينية من خلال إدخال زمنيا مجموعة متنوعة من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوليد بكفاءة endoderm نهائي، الأمامية الأمامية الاندوديرم، وبعد ذلك خلايا السلف الرئة. ثم يتم تضمين هذه الخلايا في عامل النمو خفضت (GFR) الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط، مما يسمح لهم لتطوير عفويا إلى organoids الرئة 3D استجابة لعوامل النمو الخارجية. تخضع هذه الأعضاء الرئوية الكاملة (WLO) لمراحل نمو الرئة المبكرة بما في ذلك مورفوجينيسيس المتفرع والنضج بعد التعرض للديكساميثازون والتضخيم الدوري والإيزوبوتيلكانثين. تمتلك WLOs خلايا ظهارية مجرى الهواء تعبر عن علامات KRT5 (القاعدية) وSCGB3A2 (النادي) وMUC5AC (الكؤوس) وكذلك الخلايا الظهارية السنفية التي تعبر عن HOPX (النوع السنفي الأول) وSP-C (النوع الثاني من السنفية). الخلايا الميسينشيمالية موجودة أيضا، بما في ذلك أكتين العضلات الملساء (SMA)، ومستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية A (PDGFRα). يمكن الحفاظ على WLOs المشتقة من iPSC في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد لعدة أشهر ويمكن فرزها لعلامات السطح لتنقية مجموعة خلايا محددة. ويمكن أيضا استخدام WLOs iPSC المستمدة لدراسة نمو الرئة البشرية، بما في ذلك الإشارات بين ظهارة الرئة وmesenchyme، لنموذج الطفرات الوراثية على وظيفة خلايا الرئة البشرية والتنمية، وتحديد السمية الخلوية للعوامل المعدية.

24 ساعة بعد الطلاء، اليوم 1، يجب أن تكون iPSCs التقاء 50٪-90٪. في اليوم الثاني، يجب أن يكون التقاء DE 90٪-95٪. أثناء تحريض DE ، من الشائع ملاحظة موت الخلايا بشكل كبير في اليوم 4 ولكن الخلايا المرفقة ستحتفظ مورفولوجيا حصاة مدمجة (الشكل 2ب). وقف التفريق إذا كانت غالبية الخلايا الملتصقة فصل...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

ويصف المقال خطوة الحكمة الموجهة التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى الأجهزة الرئوية الكاملة ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على كل من خلايا الرئة الظهارية القريبة والقاصية جنبا إلى جنب مع mesenchyme.

جيل من 3D الجهازيات الرئة الكاملة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لنمذجة البيولوجيا التنموية الرئة والمرض

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

يستخدم هذا البروتوكول الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لتمييزها إلى خلايا الرئة من أجل نموذج أمراض الرئة البشرية والتنمية في طبق. هذا البروتوكول مهم لأنه من الصعب الحصول على أنسجة الرئة البشرية الأولية وزراعة. المزايا الرئيسية للتمييز بين خلايا الرئة والخلايا الجذعية متعددة القدرات هو أن يكون لها إمدادات مستمرة من خلايا الرئة محددة لدراسة نمو الرئة البشرية والمرض.ويمكن الحفاظ على هذه الخلايا في زراعة الخلايا لفترات طويلة من الزمن، ويمكن أن تكون cryopreserved للتطبيقات في المستقبل، ويمكن التلاعب وراثيا لدراسة الطفرات الجينية. إثبات الإجراء سيكون راشيل ماكفيكار، مرشحة لنيل درجة الدكتوراه من مختبري. قبل بدء التجربة، إذابة ببطء عامل نمو خفضت، أو GFR، الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة على الجليد، وتمييعه في حجم متساو من DMEM F12 الباردة.ضع نصائح P1000 في الثلاجة للاسترخاء قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بتغليف كل بئر من لوحة بئر 12 مع 500 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي GFR 50٪ المتوسطة ، وإزالة أي خليط متوسط وفقاعات فائضة من الآبار. ضع لوحات البئر فوق الثلج الرطب أو الثلاجة عند أربع درجات مئوية لتعيينها لمدة 20 دقيقة، ثم قم بتحريك الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.عندما تصل PSEs عالية التقاء 70٪، إضافة 10 ميكرومولار روك المانع Y27632 إلى الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان متعدد القدرات، والانتظار ساعة قبل الانفصال. يستنشق وسائل الإعلام، وغسل الخلايا مرة واحدة مع PVS. فصل IPSCs بإضافة 500 ميكرولتر من مفرزة الخلية المتوسطة لكل بئر، واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.بعد الحضانة، إضافة 500 ميكرولتر من الخلايا الجذعية تمرير المتوسطة لكل بئر. خلايا ماصة بلطف باستخدام تلميح P1000 للحصول على تعليق خلية واحدة. ثم نقل الخلايا المشتتة في أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 300 مرة G.Following الطرد المركزي، يستنشق المتوسطة، وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام mTeSR زائد تكملها مع 10 مثبط روك ميكرومولار.بعد عد الخلايا، إضافة مرتين 10 إلى IPSCs الخامس إلى كل بئر من 12 جيدا GFR لوحة مغلفة المتوسطة، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، يستنشق mTeSR Plus قبل إضافة endoderm نهائي، أو DE، وسائط التعريفي. في اليومين الثاني والثلاثة، قم بتغيير وسائط تعريف DE.في اليوم الرابع، ابدأ تحريض AFE باستبدال وسائط DE التعريفية بوسط القاعدي الخالي من المصل. قم بتغيير متوسط AFE يوميا لمدة ثلاثة أيام قبل تحليل كفاءة AFE في نهاية اليوم السادس. في اليوم السابع، إذابة GFR الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة المتوسطة على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق.في وقت واحد، والمضي قدما مع الرئة سلف التمايز الخلية عن طريق التجسس وسائل الإعلام AFE وغسل الآبار مع PVS. إضافة ملليلتر واحد من محلول مفرزة الخلية إلى البئر واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، أضف ملليلتر واحد من وسائل الإرواء إلى الآبار التي تحتوي على محلول مفرزة الخلية.الحفاظ على الخلايا والمجاميع عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. تأكد من إزاحة جميع الخلايا، ولكن لنقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي بمعدل 300 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في وسائل الإعلام التعريفي LPC.عد الخلايا، وإضافة 2.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى 100 ميكرولتر من البارد GFR مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة، وتخلط جيدا. ضع قطرة في بئر من طبق من 12 بئرا واحتضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسائط LPC لكل بئر ، مما يضمن أن الانخفاض المتوسط مغمور بالكامل واحتضانه بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.في اليوم الثامن، تغيير LPC المتوسطة لإزالة مثبط ROCK Y27632. استمر في تغيير الوسائط كل يومين وحلل كفاءة LPC في نهاية اليوم 16. في اليوم 17، اغسل الآبار وأضف 500 ميكرولتر من ميكروغرامين لكل ملليلتر.ماصة خليط ديسباس مع ماصة P1000 واحتضان لمدة 15 دقيقة، ثم ماصة الخليط واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى. بعد الحضانة، أضف ملليلتر واحد من وسائط التبريد إلى التفكيك الذي يحتوي على آبار، ونقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية. الطرد المركزي وإعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من PVS المبردة، ثم كرر الطرد المركزي.ثم إعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من الخلية مفرزة المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة، ثم إضافة حجم متساو من وسائل الإعلام التبريد والطرد المركزي مرة أخرى. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام التبريد و 10 ميكرومولار روك المانع Y27632.إجراء عدد خلايا لحساب حجم المطلوبة للحصول على ثماني مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. ثم aliquot المطلوبة حجم المجاميع الخلية LPC في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الصغيرة، والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 300 مرة G.Remove supernatant الزائدة دون إثارة بيليه الخلية، وترك 10 ميكرولتر من الوسائط المتبقية. Resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من البارد GFR مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسط ونقل الخلايا إلى إدراج غشاء ثقافة الخلية.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من 3D organoid التعريفي المتوسطة إلى غرفة القاعدية من إدراج، واستبداله مع المتوسطة الطازجة كل يومين لمدة ستة أيام. في اليوم 23، قم بتبديل المتوسط إلى متوسط التفريع ثلاثي الأبعاد، ثم قم بتغيير الوسط كل يومين لمدة ستة أيام.في اليوم 29، قم بالتغيير إلى متوسط نضوج ثلاثي الأبعاد، ومواصلة استبدال الوسط كل يومين للأيام الستة التالية. في اليوم الرابع من تحريض DE ، تعرض الخلايا المرفقة مورفولوجيا مرصوفة بالحصى مدمجة. وأعرب عن علامات endoderm نهائي CXCR4 وS SOX17 مضافا مع نواة، مما يؤكد التمايز endodermal.تم تأكيد تحريض فورجوت الأمامي في اليوم السابع مع مورفولوجيا تظهر خلايا مضغوطة بإحكام أكثر ، وعلامات FOXA2 و SOX2 مضافة مع النواة. تم تأكيد توليد خلايا سلف الرئة ثلاثية الأبعاد مع كرويدات ثلاثية الأبعاد ، والتعبير الداخلي عن NKX2-1 GFP في خط خلية المراسل. بعد ثلاثة أسابيع من التمايز إلى أعضاء الرئة بأكملها ، تم تحليل علامات الرئة عن طريق الكيمياء المناعية.علامات لتفرع مورفوجينيسيس SOX2 و SOX9 مضافا إليها نواة لوحظ في organoids. تم الكشف بنجاح عن علامات الرئة القريبة P63 و KRT5 ، وكلاهما علامات الخلايا القاعدية ، جنبا إلى جنب مع SCGB3A2 ، وهو علامة لخلايا النادي. علامات الرئة البعيدة المستحثة برو SPC وعلامات SPB لخلايا Alveolar النوع الثاني.وعلامات هوبإكس من خلايا النوع الأول الحويصلات. بالإضافة إلى ذلك، تم التعبير عن NKX2-1 وZO1 مضافا إليها النوى. علامات خلايا الرئة Mesenchyme PGFR ألفا، علامة للخلايا الليفية، وأعرب المشترك مع SOX9، يمثل mesenchyme البعيدة.كما أعرب عن فيمنتين وتشتت في جميع أنحاء الرئة. بعد هذا الإجراء ، يمكن استثمار أعضاء الرئة مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا البطانية والمناعية. يحدث تطور الرئة والمرض عن طريق الإشارة بين مجموعات الخلايا الظهارية والنسنشية ، ولكن أيضا من الخلايا البطانية وال الضامة.نظام نموذج أنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد وثيق الصلة سريريا لدراسة الأمراض البشرية والعلاجات.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة-المحفزة عن طريق Synoviocytes الخلايا الليفية مثل المعزولة من المفاصل من التهاب المفاصل الروماتويدي المرضى

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من سرطان الجلد البشري الخلايا اللمفاوية-التسلل الورم

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

جيل من التكامل خالية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى عن طريق Episomal المتجهات

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

تشكيل بيليه غضروفي من الخلايا الجذعية المحفزة المستمدة من الدم الحبلية

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

ظهرت مفصص الجزئي: نموذج جراحية لتجديد الكبد مورفولوجك

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

النمذجة سليكون متشابك مع 3D كوكولتوريس أستروسيتيس والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

الجيش الملكي النيبالي على إعادة برمجة الليفية الأولية البشرية داخل الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...