Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Denne undersøgelse protokol blev godkendt af Institutional Review Board af UCSD's Human Research Protections Program (181180).
1. Endelig endoderm induktion fra inducerede pluripotente stamceller (Dag 1 - 3)
<ol><li>Langsomt optø vækstfaktor reduceret (GFR)-kælder membran (BM) matrix medium på is 30 minutter før brug. I kold DMEM/F12 fortyndes GFR BM matrixmediet 1:1, således at det udgør 50% af dette medium. Placer P1000 pipettespidser i fryseren for at køle af før brug.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

Den vellykkede differentiering af 3D hele lungeorganoider (WLO) er afhængig af en flertrins, 6-ugers protokol med sans for detaljer, herunder tidspunktet for eksponering for vækstfaktorer og små molekyler, cellulær tæthed efter passaging og kvaliteten af hiPSCs. Du kan finde fejlfinding i tabel 2. hiPSC'er bør være ca. 70%-80% sammenflydende, med mindre end 5% spontan differentiering før dissociation. Denne protokol kræver "mTeSR plus" medium; men almindeligt "mTeSR" medium er også blevet brugt...

Lungen er et kompliceret, heterogent, dynamisk organ, der udvikler sig i seks forskellige stadier - embryonale, pseudoglandære, kanalkulære, sakkalære, alveolær, og mikrovaskulær modning1,2. De to sidstnævnte faser forekommer før og postnatalt i menneskets udvikling, mens de første fire faser udelukkende forekommer under fostrets udvikling, medmindre der forekommer for tidlig fødsel3. Den embryonale fase begynder i endodermalt kimlag og afsluttes med den spirende luftrør og lungeknopper. Lungeudvikling sker til dels via signalering mellem epitel og mesenkymale celler4. Disse interaktioner resulterer i lunge forgrening, spredning, cellulær skæbne bestemmelse og cellulære differentiering af den udviklende lunge. Lungen er opdelt i ledende zoner (luftrør til terminalen bronkier) og luftvejeszoner (respiratoriske bronkier til alveoler). Hver zone indeholder entydige epitelcelletyper. herunder basal, sekretorisk, cilieret, børste, neuroendokrine og ionocytceller i de ledende luftveje5, efterfulgt af alveolær type I og II-celler i respiratorisk epitel6. Meget er stadig ukendt om udviklingen og reaktionen på skade af de forskellige celletyper. iPSC afledte lungeorganoid modeller muliggøre undersøgelse af mekanismer, der driver menneskelige lunge udvikling, virkningerne af genetiske mutationer på lungefunktion, og reaktionen af både epitel og mesenchyme til infektiøse stoffer uden behov for primære menneskelige lungevæv.
Markører svarende til de forskellige stadier af embryonal differentiering omfatter CXCR4, cKit, FOXA2, og SOX17 for endelige endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1, og SOX2 for forreste foregut endoderm (AFE)8, og NKX2-1 for tidlige lunge stamfader celler9. I embryonale lunge udvikling, foregut opdeler i dorsale spiserøret og ventral luftrør. Knopperne i højre og venstre lunger fremstår som to uafhængige outpouchings omkring tracheal bud10. Under forgrening morfogenese, mesenchyme omkring epitel producerer elastisk væv, glat muskel, brusk, og vaskulatur11. Samspillet mellem epitel og mesenchyme er afgørende for normal lungeudvikling. Dette omfatter udskillelsen af FGF1012 af mesenchyme og SHH13 produceret af epitelet.
Her beskriver vi en protokol for den målrettede differentiering af hiPSCs i tredimensionelle (3D) hele lungeorganoider (WLO). Mens der er lignende tilgange, der omfatter isolering af lunge stamfader celler via sortering på LPC fase for at gøre alveolær-lignende14,15 (distal) organoider eller luftveje16 (proksimale) organoider, eller generere ventral-anterior foregut spheroids at gøre menneskelige lunge organoider udtrykke alveolær-celle og mesenkymal markører og bud tip stamfader organoider17 , styrken af denne metode er inddragelsen af både lunge epitel og mesenkymal celletyper til mønster og orkestrere lunge forgrening morfogenese, modning, og ekspansion in vitro.
Denne protokol bruger små molekyler og vækstfaktorer til at lede differentiering af pluripotente stamceller gennem endelige endoderm, forreste foregut endoderm, og lunge stamfader celler. Disse celler er derefter induceret i 3D hele lungeorganoider gennem vigtige udviklingsmæssige trin, herunder forgrening og modning. Sammenfatningen af differentieringsprotokollen er vist i figur 1a med repræsentative lysbilleder af endodermal og organoiddifferentiering vist i figur 1b. Figur 1c,d viser genekspression detaljer om endodermal differentiering samt genekspression af både de proksimale og distale populationer af lungeepilele celler efter at have afsluttet differentiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Menneskets lungeudvikling og sygdom har været vanskelig at studere på grund af manglen på biologisk relevante in vitro-modelsystemer . Human induceret pluripotente stamceller (hiPSCs) kan differentieres trinvist i 3D multicellulære lungeorganoider, lavet af både epitel og mesenkymale cellepopulationer. Vi generobrer embryonale udviklingssignaler ved tidsmæssigt at introducere en række vækstfaktorer og små molekyler til effektivt at generere endelige endoderm, forreste foregut endoderm og efterfølgende lunge stamfaderceller. Disse celler er derefter indlejret i vækstfaktor reduceret (GFR)-kælder membran matrix medium, så de spontant kan udvikle sig til 3D lungeorganoider som reaktion på eksterne vækstfaktorer. Hele disse lungeorganoider (WLO) gennemgår tidlige lungeudviklingsfaser, herunder forgrening af morfogenese og modning efter eksponering for dexamethason, cyklisk AMP og isobutylxanthine. WLOs besidder luftvejs epitelceller, der udtrykker markørerNE KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) og MUC5AC (pokal) samt alveolær epitelceller, der udtrykker HOPX (alveolær type I) og SP-C (alveolær type II). Mesenkymale celler er også til stede, herunder glat muskel actin (SMA), og blodplade-afledt vækstfaktor receptor A (PDGFRα). iPSC afledte WLOs kan opretholdes i 3D-kulturforhold i mange måneder og kan sorteres for overflademarkører for at rense en bestemt cellepopulation. iPSC afledte WLOs kan også udnyttes til at studere menneskets lunge udvikling, herunder signalering mellem lunge epitel og mesenchyme, at modellere genetiske mutationer på human lungecellefunktion og udvikling, og at bestemme cytotoksiciteten af infektiøs midler.

24 timer efter plating, dag 1, bør iPSCs være 50%-90% sammenløb. På dag 2 skal DE være 90%-95% sammenflyttet. Under DE induktion er det almindeligt at observere betydelig celledød på dag 4, men vedhæftede celler bevarer en kompakt brostensbelagt morfologi (Figur 2b). Ophør differentiering, hvis de fleste klæbende celler løsner sig og overvejer at forkorte eksponeringen for DE-medier med aktivin A med 6-12 timer. Under AFE induktion, celledød er minimal, og cellerne forbliver klæ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Artiklen beskriver trin klog rettet differentiering af inducerede pluripotente stamceller til tre-dimensionelle hele lungeorganoider, der indeholder både proksimale og distale epitel lungeceller sammen med mesenchyme.

Generation af 3D hele lungeorganoider fra inducerede pluripotente stamceller til modellering af lungeudviklingsbiologi og sygdom

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Denne protokol bruger inducerede pluripotente stamceller til at differentiere dem til lungeceller for at modellere human lungesygdom og udvikling i en skål. Denne protokol er betydelig, fordi det er svært at opnå og kultur primære menneskelige lungevæv. De vigtigste fordele ved at differentiere lungeceller fra pluripotente stamceller er at have en konstant forsyning af specifikke lungeceller til at studere menneskets lungeudvikling og sygdom.Disse celler kan opretholdes i cellekultur i lange perioder, kan kryopreserveret til fremtidige anvendelser og kan genetisk manipuleres til at studere genmutationer. Det vil være Rachel McVicar, en ph.d.-kandidat fra mit laboratorium. Før du starter eksperimentet, langsomt optø en vækstfaktor reduceret, eller GFR, kælder membran matrix medium på is, og fortynde det i en tilsvarende mængde af kolde DMEM F12.Placer P1000 tips i fryseren til afkøling før brug. Dernæst belægge hver brønd af en 12 brønd plade med 500 mikroliter af 50% GFR kælder membran matrix medium, og fjerne eventuelle overskydende medium blanding og bobler fra brønde. Placer brøndpladerne oven på våd is eller køleskab ved fire grader Celsius for at indstille i 20 minutter, og flyt derefter pladen til 37 grader Celsius inkubatoren natten over.Når høje primærenheder når 70% sammenløb, tilsættes 10 mikromolar ROCK-hæmmer Y27632 til menneskeskabte pluripotente stamceller og vent en time før dissociation. Aspirere medierne, og vask cellerne én gang med PVS. Dissociate IPSCs ved at tilføje 500 mikroliter af celle løsrivelse medium per brønd, og inkubere i 20 minutter ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxid inkubator.Efter inkubationen tilsættes 500 mikroliter stamcellepasning medium pr. Brønd. Rør forsigtigt celler ved hjælp af en P1000-spids for at opnå en enkelt celleaffjedring. Overfør derefter de dissocierede celler til et 15 milliliterrør og centrifuge i fem minutter ved 300 gange G.Efter centrifugering, aspirer mediet og genbruger cellepillen med en milliliter mTeSR Plus-medier suppleret med 10 mikromolar ROCK-hæmmer.Efter at have talt cellerne, tilsæt to gange 10 til den femte IPSCs til hver brønd af en 12 godt GFR medium belagt plade, og inkubere natten over ved 37 grader Celsius. På den næste dag, aspirere mTeSR Plus før du tilføjer endelige endoderm, eller DE, induktion medier. På dag to og tre, ændre DE induktion medier.På dag fire, begynde AFE induktion ved at erstatte DE induktion medier med serum-fri basal medium. Skift AFE medium dagligt i tre dage, før du analyserer AFE effektivitet i slutningen af dag seks. På dag syv optøs GFR kældermembranmatrix medium på is til senere brug.Samtidig fortsætte med lunge stamfader celle differentiering ved at aspirere AFE medier og vaske brønde med PVS. Tilsæt en milliliter celleløsning til brønden og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Efter inkubation tilsættes en milliliter af slukkende medier til brøndene, der indeholder celleløsning.Hold celler som aggregater ved forsigtigt at pipetter op og ned. Sørg for, at alle celler er løsnet, men for at overføre dem til en 15 milliliter konisk rør til centrifugering ved 300 gange G i fem minutter. Fjern supernatant og resuspend celle pellet i LPC induktion medier.Tæl cellerne, og tilsæt 2,5 gange 10 til de femte celler til 100 mikroliter af kold GFR kældermembran matrix medium, og bland godt. Placer en dråbe i en brønd af en 12-brønds plade og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter. Derefter skal du tilføje en milliliter LPC-medier pr. Brønd, hvilket sikrer, at mediumfaldet er fuldt nedsænket og inkuberer natten over ved 37 grader Celsius.På dag otte skal du skifte LPC-medium for at fjerne ROCK-hæmmeren Y27632. Fortsæt med at ændre medierne hver anden dag og analysere LPC effektivitet i slutningen af dag 16. På dag 17, vaske brønde og tilføje 500 mikroliter af to mikrogram per milliliter dispase.Pipette dispase blandingen med en P1000 pipette og inkubere i 15 minutter, derefter pipette blandingen og inkubere i yderligere 15 minutter. Efter inkubation tilsættes en milliliter af de slukkende medier til dispase indeholdende brønde, og overfør cellerne til koniske rør. Centrifuge og resuspend pellet i en milliliter af kølet PVS, derefter gentage centrifugering.Derefter genbruges pellet i en milliliter celleudnyttelse medium. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 12 minutter, og tilsæt derefter et lige så volumen af slukkende medier og centrifuge igen. Resuspend pellet i en milliliter af quenching medier og 10 mikromolar ROCK hæmmer Y27632.Udfør et celletal for at beregne den mængde, der er nødvendig for at opnå otte gange 10 til de fjerde celler pr. Brønd. Derefter aliquot krævede volumen af LPC celle aggregater i 1,5 milliliter mikro centrifuge rør, og centrifuge i fem minutter ved 300 gange G.Remove overskydende supernatant uden at ophidse celle pellet, forlader 10 mikroliter af resterende medier. Resuspend celle pellet i 200 mikroliter af kolde GFR kælder membran matrix medium og overføre cellerne til celle kultur membran skær.Inkuber ved 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter. Efter inkubation tilsættes en milliliter 3D organoidinduktionsmedium til indsatsens basolaterale kammer og erstattes med frisk medium hver anden dag i seks dage. På dag 23 skal du skifte medium til 3D-forgreningsmedium og derefter skifte mediet hver anden dag i seks dage.På dag 29 skal du skifte til 3D-modningsmedium og fortsætte med at udskifte mediet hver anden dag i de næste seks dage. På dag fire af DE induktion, vedhæftede celler viser en kompakt brosten morfologi. De endelige endoderm markører CXCR4 og SOX17 overlejret med kerner blev udtrykt, bekræfter endodermal differentiering.Forreste foregut induktion blev bekræftet på dag syv med morfologi viser mere stramt komprimerede celler, og markører FOXA2 og SOX2 overlejret med kerner. Generationen af 3D lunge stamfader celler blev bekræftet med 3D spheroids, og endogene udtryk for NKX2-1 GFP i en reporter celle linje. Efter en tre ugers differentiering i hele lungeorganoider blev lungemarkørerne analyseret af immuncytokemi.Markører for forgrening morfogenese SOX2 og SOX9 overlejret af kerner blev observeret i organoider. Proksimale lungemarkører P63 og KRT5, begge markører for basalceller, blev med succes opdaget sammen med SCGB3A2, som er en markør for klubceller. Distale lungemarkører inducerede Pro SPC- og SPB-markører for Alveolær type II-celler.Og HOPX markører af Alveolar Type I celler. Derudover blev NKX2-1 og ZO1 udtrykt overlejret med kerner. Mesenchyme lungecelle markører PGFR Alpha, en markør for fibroblaster, co-udtrykt med SOX9, repræsenterede distal mesenchyme.Vimentin blev også udtrykt og blev spredt i hele lungen. Efter denne procedure, lungeorganoider kan investeres med induceret pluripotente stamcelle afledte endotel- og immunceller. Lungeudvikling og sygdom opstår ved et signal mellem epitel- og mesenkymale cellepopulationer, men også fra endotelceller og makrofager.Et 3D lungevævsmodelsystem er klinisk relevant for at studere sygdomme og terapier hos mennesker.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generation af induceret-pluripotente stamceller Brug fibroblastlignende synoviocytter Isoleret fra leddene på leddegigt patienter

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation af induceret pluripotente stamceller fra human melanoma Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induceret Pluripotente Stem Cell Generation fra Blood Cells Brug Sendai Virus og Centrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation af Integration-fri induceret pluripotente stamceller fra humane perifere mononucleære blodceller Brug episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsdannelse fra ledningsblod-afledte inducerede pluripotente stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Delvis dråbeformede Hepatectomy: En kirurgisk Model for morfologiske lever regenerering

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptic dataloger modellering med 3D Cocultures astrocytter og neuroner fra humane pluripotente stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserede omprogrammering af menneskelige primære fibroblaster til induceret pluripotente stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af 3D hud Organoid fra ledningen blod-afledte induceret pluripotente stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...