Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Ce protocole d’étude a été approuvé par l’Institutional Review Board du Human Research Protections Program de l’UCSD (181180).
1. Induction définitive de l’endoderme à partir de cellules souches pluripotentes induites (Jour 1 - 3)
<ol><li>Décongeler lentement le facteur de croissance réduit (DFG)-milieu de la matrice de membrane basale (BM) sur la glace 30 minutes avant l’utilisation. Dans le mélange DMEM/F12 froid, diluer le milieu de matrice GFR BM 1:1 de telle sorte qu?...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

La différenciation réussie des organoïdes pulmonaires entiers (WLO) 3D repose sur un protocole en plusieurs étapes de 6 semaines avec une attention aux détails, y compris le temps d’exposition aux facteurs de croissance et aux petites molécules, la densité cellulaire après le passage et la qualité des hiPSC. Pour le dépannage, reportez-vous au Tableau 2. Les csahah doivent être confluents à environ 70 % à 80 %, avec moins de 5 % de différenciation spontanée avant la dissociation. Ce prot...

Le poumon est un organe compliqué, hétérogène et dynamique qui se développe en six stades distincts - maturation embryonnaire, pseudoglandulaire, canaliculaire, sacculaire, alvéolaire et microvasculaire1,2. Les deux dernières phases se produisent avant et après la naissance dans le développement humain, tandis que les quatre premières étapes se produisent exclusivement pendant le développement du fœtus, à moins qu’une naissance prématurée ne se produise3. La phase embryonnaire commence dans la couche germinale endodermique et se termine par le bourgeonnement de la trachée et des bourgeons pulmonaires. Le développement pulmonaire se produit en partie par signalisation entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses4. Ces interactions entraînent la ramification pulmonaire, la prolifération, la détermination du devenir cellulaire et la différenciation cellulaire du poumon en développement. Le poumon est divisé en zones conductrices (trachée aux bronchioles terminales) et zones respiratoires (bronchioles respiratoires aux alvéoles). Chaque zone contient des types uniques de cellules épithéliales; y compris les cellules basales, sécrétoires, ciliées, de brosse, neuroendocrines et ionocytaires dans les voies respiratoires conductrices5, suivies des cellules alvéolaires de type I et II dans l’épithélium respiratoire6. On ignore encore beaucoup de choses sur le développement et la réponse aux blessures des différents types de cellules. Les modèles d’organoïdes pulmonaires dérivés de la CSPi permettent d’étudier les mécanismes qui stimulent le développement pulmonaire humain, les effets des mutations génétiques sur la fonction pulmonaire et la réponse de l’épithélium et du mésenchyme aux agents infectieux sans avoir besoin de tissu pulmonaire humain primaire.
Les marqueurs correspondant aux différents stades de la différenciation embryonnaire comprennent CXCR4, cKit, FOXA2 et SOX17 pour l’endoderme définitif (DE)7, FOXA2, TBX1 et SOX2 pour l’endoderme antérieur de l’intestin antérieur (AFE)8, et NKX2-1 pour les cellules progénitrices pulmonaires précoces9. Dans le développement pulmonaire embryonnaire, l’intestin antérieur se divise en œsophage dorsal et trachée ventrale. Les bourgeons des poumons droit et gauche apparaissent comme deux outpouchings indépendants autour du bourgeon trachéal10. Au cours de la morphogenèse ramifiée, le mésenchyme entourant l’épithélium produit du tissu élastique, du muscle lisse, du cartilage et du système vasculaire11. L’interaction entre l’épithélium et le mésenchyme est essentielle au développement normal des poumons. Cela inclut la sécrétion de FGF1012 par le mésenchyme et de SHH13 produit par l’épithélium.
Ici, nous décrivons un protocole pour la différenciation dirigée des hiPSC en organoïdes pulmonaires entiers (WLO) tridimensionnels (3D). Bien qu’il existe des approches similaires qui intègrent l’isolement des cellules progénitrices pulmonaires par tri au stade LPC pour fabriquer des organoïdes alvéolaires14,15 (distaux) ou des organoïdes des voies respiratoires16 (proximaux), ou génèrent des sphéroïdes ventraux-antérieurs de l’intestin antérieur pour fabriquer des organoïdes pulmonaires humains exprimant des marqueurs alvéolaires et mésenchymateux et des organoïdes progénitrices de la pointe des bourgeons17 , la force de cette méthode est l’inclusion des deux types de cellules épithéliales et mésenchymateuses pulmonaires pour modéliser et orchestrer la morphogenèse, la maturation et l’expansion des ramifications pulmonaires in vitro.
Ce protocole utilise de petites molécules et des facteurs de croissance pour diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes à travers l’endoderme définitif, l’endoderme de l’intestin antérieur et les cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite induites en organoïdes pulmonaires entiers 3D à travers des étapes de développement importantes, y compris la ramification et la maturation. Le résumé du protocole de différenciation est illustré à la figure 1a avec des images représentatives en champ clair de la différenciation endodermique et organoïde illustrées à la figure 1b. La figure 1c,d montre les détails de l’expression génique de la différenciation endodermique ainsi que l’expression génique des populations proximales et distales des cellules épithéliales pulmonaires après avoir terminé la différenciation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Le développement et la maladie pulmonaires humaines ont été difficiles à étudier en raison de l’absence de systèmes modèles in vitro biologiquement pertinents. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) peuvent être différenciées progressivement en organoïdes pulmonaires multicellulaires 3D, constitués à la fois de populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses. Nous récapitulons les signaux de développement embryonnaire en introduisant temporellement une variété de facteurs de croissance et de petites molécules pour générer efficacement un endoderme définitif, un endoderme de l’intestin antérieur et, par conséquent, des cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite intégrées dans un milieu de matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (DFG), ce qui leur permet de se développer spontanément en organoïdes pulmonaires 3D en réponse à des facteurs de croissance externes. Ces organoïdes pulmonaires entiers (WLO) subissent des stades précoces de développement pulmonaire, y compris une morphogenèse ramifiée et une maturation après exposition à la dexaméthasone, à l’AMP cyclique et à l’isobutylxanthine. Les WHO possèdent des cellules épithéliales des voies respiratoires exprimant les marqueurs KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) et MUC5AC (gobelet) ainsi que des cellules épithéliales alvéolaires exprimant HOPX (type alvéolaire I) et SP-C (type alvéolaire II). Des cellules mésenchymateuses sont également présentes, notamment de l’actine musculaire lisse (SMA) et du récepteur A du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα). Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent être maintenus dans des conditions de culture 3D pendant de nombreux mois et peuvent être triés pour les marqueurs de surface afin de purifier une population cellulaire spécifique. Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent également être utilisés pour étudier le développement pulmonaire humain, y compris la signalisation entre l’épithélium pulmonaire et le mésenchyme, pour modéliser les mutations génétiques sur la fonction et le développement des cellules pulmonaires humaines et pour déterminer la cytotoxicité des agents infectieux.

24 heures après le placage, jour 1, les CSPi doivent être confluents à 50% à 90%. Le jour 2, DE devrait être confluent à 90% à 95%. Au cours de l’induction de DE, il est courant d’observer une mort cellulaire importante au jour 4, mais les cellules attachées conserveront une morphologie pavée compacte (Figure 2b). Arrêter la différenciation si la majorité des cellules adhérentes se détachent et envisager de raccourcir l’exposition aux milieux DE avec l’activine A de 6 ?...

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Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

L’article décrit la différenciation dirigée par étapes des cellules souches pluripotentes induites en organoïdes pulmonaires entiers tridimensionnels contenant à la fois des cellules pulmonaires épithéliales proximales et distales ainsi que du mésenchyme.

Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Ce protocole utilise des cellules souches pluripotentes induites pour les différencier en cellules pulmonaires afin de modéliser la maladie pulmonaire humaine et son développement dans une boîte. Ce protocole est important car il est difficile d’obtenir et de cultiver du tissu pulmonaire humain primaire. Les principaux avantages de différencier les cellules pulmonaires des cellules souches pluripotentes sont d’avoir un approvisionnement constant en cellules pulmonaires spécifiques pour étudier le développement et la maladie pulmonaires humaines.Ces cellules peuvent être maintenues en culture cellulaire pendant de longues périodes, peuvent être cryoconservées pour de futures applications et peuvent être génétiquement manipulées pour étudier les mutations génétiques. Rachel McVicar, une candidate au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Avant de commencer l’expérience, décongelez lentement un milieu de matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit, ou DFG, sur de la glace et diluez-le dans un volume égal de DMEM F12 froid.Placez les embouts P1000 au congélateur pour les refroidir avant utilisation. Ensuite, recouvrez chaque puits d’une plaque de 12 puits avec 500 microlitres du milieu de matrice de membrane basale à 50% GFR et éliminez tout mélange de milieu et les bulles en excès des puits. Placez les plaques de puits sur de la glace humide ou un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pour les régler pendant 20 minutes, puis déplacez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Lorsque les EPS atteignent 70 % de confluence, ajoutez 10 micromolaires inhibiteur de ROCK Y27632 aux cellules souches pluripotentes induites par l’homme et attendez une heure avant la dissociation. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec PVS. Dissocier les IPSC en ajoutant 500 microlitres de milieu de détachement cellulaire par puits, et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone.Après l’incubation, ajouter 500 microlitres de milieu de passage de cellules souches par puits. Pipettez doucement les cellules à l’aide d’une pointe P1000 pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférez ensuite les cellules dissociées dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-les pendant cinq minutes à 300 fois G.Après centrifugation, aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de milieu mTeSR Plus complété par un inhibiteur de ROCK 10 micromolaires.Après avoir compté les cellules, ajoutez deux fois 10 aux cinquièmes IPSC à chaque puits d’une plaque recouverte de GFR de 12 puits et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez le mTeSR Plus avant d’ajouter un milieu d’induction endodermique définitif, ou DE. Les deuxième et troisième jours, changez le support d’induction DE.Le quatrième jour, commencez l’induction de l’AFE en remplaçant le milieu d’induction DE par un milieu basal sans sérum. Changez quotidiennement le support AFE pendant trois jours avant d’analyser l’efficacité AFE à la fin du sixième jour. Le septième jour, décongelez le milieu de la matrice de membrane basale GFR sur la glace pour une utilisation ultérieure.Simultanément, procéder à la différenciation des cellules progénitrices pulmonaires en aspirant le milieu AFE et en lavant les puits avec PVS. Ajouter un millilitre de solution de détachement cellulaire au puits et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter un millilitre de milieu de trempe aux puits contenant une solution de détachement cellulaire.Gardez les cellules sous forme d’agrégats en pipetant doucement de haut en bas. Assurez-vous que toutes les cellules sont délogées, mais pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation à 300 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans un milieu d’induction LPC.Comptez les cellules, ajoutez 2,5 fois 10 aux cinquièmes cellules à 100 microlitres de milieu de matrice de membrane basale GFR froid, et mélangez bien. Placer une gouttelette dans un puits d’une plaque de 12 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de média LPC par puits, en veillant à ce que la goutte moyenne soit complètement submergée et incubée pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le huitième jour, changez le milieu LPC pour éliminer l’inhibiteur de ROCK Y27632. Continuez à changer les médias tous les deux jours et analysez l’efficacité du LPC à la fin du jour 16. Le jour 17, lavez les puits et ajoutez 500 microlitres de deux microgrammes par millilitre de dispase.Pipette le mélange de dispase avec une pipette P1000 et incuber pendant 15 minutes, puis pipette le mélange et incuber pendant encore 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre du milieu de trempe aux puits contenant de la dispase et transférez les cellules dans des tubes coniques. Centrifugez et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de PVS réfrigéré, puis répétez la centrifugation.Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de détachement cellulaire. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes, puis ajouter un volume égal de milieu de trempe et centrifuger à nouveau. Remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de trempe et 10 micromolaires inhibiteur de ROCK Y27632.Effectuez un comptage de cellules pour calculer le volume nécessaire pour obtenir huit fois 10 à la quatrième cellule par puits. Ensuite, aliquote a nécessité le volume d’agrégats de cellules LPC dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, et centrifugez pendant cinq minutes à 300 fois G.Éliminez l’excès de surnageant sans agiter la pastille de cellule, laissant 10 microlitres de milieu résiduel. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de milieu de matrice de membrane basale GFR froid et transférer les cellules dans des inserts de membrane de culture cellulaire.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de milieu d’induction organoïde 3D à la chambre basolatérale de l’insert et remplacez-le par un milieu frais tous les deux jours pendant six jours. Le jour 23, passez le support au milieu de ramification 3D, puis changez le support tous les deux jours pendant six jours.Le jour 29, passez au milieu de maturation 3D et continuez à remplacer le milieu tous les deux jours pendant les six jours suivants. Le quatrième jour de l’induction DE, les cellules attachées présentent une morphologie pavée compacte. Les marqueurs endodermiques définitifs CXCR4 et SOX17 superposés à des noyaux ont été exprimés, confirmant la différenciation endodermique.L’induction de l’intestin antérieur a été confirmée le septième jour avec la morphologie montrant des cellules plus étroitement compactées, et les marqueurs FOXA2 et SOX2 superposés avec des noyaux. La génération de cellules progénitrices pulmonaires 3D a été confirmée avec des sphéroïdes 3D et l’expression endogène de NKX2-1 GFP dans une lignée cellulaire rapporteure. Après une différenciation de trois semaines en organoïdes pulmonaires entiers, les marqueurs pulmonaires ont été analysés par immunocytochimie.Des marqueurs de morphogenèse ramifiée SOX2 et SOX9 superposés par des noyaux ont été observés dans les organoïdes. Les marqueurs pulmonaires proximaux P63 et KRT5, tous deux marqueurs des cellules basales, ont été détectés avec succès avec SCGB3A2, qui est un marqueur pour les cellules de club. Les marqueurs pulmonaires distaux ont induit des marqueurs Pro SPC et SPB pour les cellules alvéolaires de type II.Et les marqueurs HOPX des cellules alvéolaires de type I. De plus, NKX2-1 et ZO1 ont été exprimés superposés avec des noyaux. Les marqueurs de cellules pulmonaires de mésenchyme PGFR Alpha, un marqueur pour les fibroblastes, co-exprimé avec SOX9, représentaient le mésenchyme distal.Vimentin a également été exprimé et a été dispersé dans tout le poumon. Suite à cette procédure, les organoïdes pulmonaires peuvent être investis avec des cellules endothéliales et immunitaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites. Le développement pulmonaire et la maladie se produisent par une signalisation entre les populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses, mais aussi à partir de cellules endothéliales et de macrophages.Un système de modèle de tissu pulmonaire 3D est cliniquement pertinent pour étudier les maladies humaines et les thérapies.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Une hépatectomie partielle lobulaire : Un modèle chirurgical pour la régénération du foie morphologique

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Base d’ARN reprogrammation des fibroblastes humains de primaires sur les cellules souches pluripotentes induites

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...