Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) unterstützt.

Dieses Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Human Research Protections Program der UCSD (181180) genehmigt.
1. Definitive Endoderm-Induktion aus induzierten pluripotenten Stammzellen (Tag 1 - 3)
<ol><li>Langsames Auftauen des Wachstumsfaktors reduziert (GFR)-Basalmembran (BM) Matrixmedium auf Eis 30 Minuten vor Gebrauch. In kaltem DMEM/F12-Gemisch das GFR BM-Matrixmedium 1:1 so verdünnen, dass es 50% dieses Mediums ausmacht. Legen Sie die P1000-Pipettenspitzen in den Ge...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

Die erfolgreiche Differenzierung von 3D-Ganzlungenorganoiden (WLO) beruht auf einem mehrstufigen, 6-wöchigen Protokoll mit Liebe zum Detail, einschließlich der Zeit der Exposition gegenüber Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, der Zelldichte nach dem Passieren und der Qualität der hiPS-Zellen. Informationen zur Problembehandlung finden Sie in Tabelle 2. hiPS-Zellen sollten etwa 70%-80% konfluent sein, mit weniger als 5% spontaner Differenzierung vor der Dissoziation. Dieses Protokoll erfordert d...

Die Lunge ist ein kompliziertes, heterogenes, dynamisches Organ, das sich in sechs verschiedenen Stadien entwickelt - embryonaler, pseudoglandulärer, kanalikulärer, sackulärer, alveolärer und mikrovaskulärer Reifung1,2. Die beiden letztgenannten Phasen treten prä- und postnatal in der menschlichen Entwicklung auf, während die ersten vier Phasen ausschließlich während der fetalen Entwicklung auftreten, es sei denn, es tritt eine Frühgeburt auf3. Die embryonale Phase beginnt in der endodermalen Keimschicht und endet mit dem Austrieb der Luftröhre und der Lungenknospen. Die Lungenentwicklung erfolgt zum Teil über die Signalübertragung zwischen den Epithel- und Mesenchymzellen4. Diese Wechselwirkungen führen zu Lungenverzweigung, Proliferation, Bestimmung des zellulären Schicksals und zellulärer Differenzierung der sich entwickelnden Lunge. Die Lunge ist in leitende Zonen (Luftröhre zu den terminalen Bronchiolen) und Atemzonen (respiratorische Bronchiolen zu den Alveolen) unterteilt. Jede Zone enthält einzigartige Epithelzelltypen; einschließlich basaler, sekretorischer, flimmerförmiger, Bürsten-, neuroendokriner und Ionozytenzellen im leitenden Atemweg5, gefolgt von alveolären Typ-I- und -II-Zellen im respiratorischen Epithel6. Über die Entstehung und Reaktion auf Verletzungen der verschiedenen Zelltypen ist noch viel unbekannt. iPSC-abgeleitete Lungenorganoidmodelle ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung der menschlichen Lunge vorantreiben, der Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Lungenfunktion und der Reaktion sowohl des Epithels als auch des Mesenchyms auf Infektionserreger, ohne dass primäres menschliches Lungengewebe erforderlich ist.
Zu den Markern, die den verschiedenen Stadien der embryonalen Differenzierung entsprechen, gehören CXCR4, cKit, FOXA2 und SOX17 für das definitive Endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 und SOX2 für das vordere Vorderdarmendoderm (AFE)8 und NKX2-1 für frühe Lungenvorläuferzellen9. Bei der embryonalen Lungenentwicklung teilt sich der Vorderdarm in die dorsale Speiseröhre und die ventrale Luftröhre. Die Knospen der rechten und linken Lunge erscheinen als zwei unabhängige Ausscheidungen um die Trachealknospe10. Während der Verzweigung der Morphogenese produziert das Mesenchym, das das Epithel umgibt, elastisches Gewebe, glatte Muskulatur, Knorpel und Gefäßkulatur11. Die Wechselwirkung zwischen Epithel und Mesenchym ist essentiell für eine normale Lungenentwicklung. Dazu gehört die Sekretion von FGF1012 durch das Mesenchym und SHH13, das vom Epithel produziert wird.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gerichteten Differenzierung von hiPS-Zellen in dreidimensionale (3D) ganze Lungenorganoide (WLO). Während es ähnliche Ansätze gibt, die die Isolierung von Lungenvorläuferzellen durch Sortierung im LPC-Stadium beinhalten, um alveolär-ähnliche 14,15 (distale) Organoide oder Atemwege16 (proximale) Organoide herzustellen oder ventral-anteriore Vorderdarm-Sphäroide zu erzeugen, um menschliche Lungenorganoide herzustellen, die alveoläre Zell- und mesenchymale Marker und Knospenspitzen-Vorläuferorganoide exprimieren17 Die Stärke dieser Methode ist die Einbeziehung sowohl von Lungenepithel- als auch von mesenchymalen Zelltypen, um die Morphogenese, Reifung und Expansion der Lunge in vitro zu strukturieren und zu orchestrieren.
Dieses Protokoll verwendet kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch definitive Endoderm-, vordere Vorderdarm-Endoderm- und Lungenvorläuferzellen zu steuern. Diese Zellen werden dann durch wichtige Entwicklungsschritte, einschließlich Verzweigung und Reifung, in 3D-Ganze Lungenorganoide induziert. Die Zusammenfassung des Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1a mit repräsentativen Hellfeldbildern der endodermalen und organoiden Differenzierung in Abbildung 1b dargestellt. Abbildung 1c,d zeigt die Genexpressionsdetails der endodermalen Differenzierung sowie die Genexpression sowohl der proximalen als auch der distalen Populationen von Lungenepithelzellen nach Abschluss der Differenzierung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Die Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Lunge war aufgrund des Mangels an biologisch relevanten In-vitro-Modellsystemen schwer zu untersuchen. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) können schrittweise in mehrzellige 3D-Lungenorganoide differenziert werden, die sowohl aus epithelialen als auch aus mesenchymalen Zellpopulationen bestehen. Wir rekapitulieren embryonale Entwicklungssignale, indem wir zeitlich eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen einführen, um effizient definitive Endoderm-, anteriore Vorderdarm-Endoderm- und anschließend Lungen-Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese Zellen werden dann in ein wachstumsfaktorreduziertes (GFR)-Basalmembranmatrixmedium eingebettet, so dass sie sich als Reaktion auf externe Wachstumsfaktoren spontan zu 3D-Lungenorganoiden entwickeln können. Diese ganzen Lungenorganoide (WLO) durchlaufen frühe Entwicklungsstadien der Lunge, einschließlich verzweigter Morphogenese und Reifung nach Exposition gegenüber Dexamethason, zyklischem AMP und Isobutylxanthin. WLOs besitzen Atemwegsepithelzellen, die die Marker KRT5 (basal), SCGB3A2 (Club) und MUC5AC (Kelch) exprimieren, sowie alveoläre Epithelzellen, die HOPX (alveolarer Typ I) und SP-C (alveolarer Typ II) exprimieren. Mesenchymalzellen sind ebenfalls vorhanden, einschließlich Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und des von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors A (PDGFRα). iPSC-abgeleitete WLOs können unter 3D-Kulturbedingungen für viele Monate aufbewahrt und nach Oberflächenmarkern sortiert werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu reinigen. iPSC-abgeleitete WLOs können auch verwendet werden, um die menschliche Lungenentwicklung zu untersuchen, einschließlich der Signalübertragung zwischen dem Lungenepithel und dem Mesenchym, um genetische Mutationen auf die Funktion und Entwicklung menschlicher Lungenzellen zu modellieren und die Zytotoxizität von Infektionserregern zu bestimmen.

24 Stunden nach dem Plattieren, Tag 1, sollten iPS-Zellen 50% -90% konfluent sein. An Tag 2 sollte DE zu 90%-95% konfluent sein. Während der DE-Induktion ist es üblich, am Tag 4 einen signifikanten Zelltod zu beobachten, aber die angeschlossenen Zellen behalten eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie bei (Abbildung 2b). Brechen Sie die Differenzierung ab, wenn sich die Mehrheit der adhärenten Zellen löst, und erwägen Sie, die Exposition gegenüber DE-Medien mit Activin A um 6-12 h zu...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Der Artikel beschreibt die schrittweise gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu dreidimensionalen ganzen Lungenorganoiden, die sowohl proximale als auch distale epitheliale Lungenzellen zusammen mit Mesenchym enthalten.

Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Dieses Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzellen, um sie in Lungenzellen zu differenzieren, um menschliche Lungenerkrankungen und -entwicklungen in einer Schale zu modellieren. Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es schwierig ist, primäres menschliches Lungengewebe zu erhalten und zu kultivieren. Der Hauptvorteil der Unterscheidung von Lungenzellen von pluripotenten Stammzellen besteht darin, eine konstante Versorgung mit spezifischen Lungenzellen zu haben, um die Entwicklung und Krankheit der menschlichen Lunge zu untersuchen.Diese Zellen können über lange Zeiträume in Zellkultur gehalten werden, können für zukünftige Anwendungen kryokonserviert werden und können genetisch manipuliert werden, um Genmutationen zu untersuchen. Das Verfahren wird Rachel McVicar, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, tauen Sie langsam ein Wachstumsfaktor-reduziertes oder GFR-Basalmembranmatrixmedium auf Eis auf und verdünnen Sie es in einem gleichen Volumen von kaltem DMEM F12.Legen Sie die P1000-Spitzen vor gebrauchsfertig in den Gefrierschrank, um sie zu kühlen. Als nächstes beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 Mikrolitern des 50% GFR-Basalmembranmatrixmediums und entfernen Sie überschüssige Mediumsmischungen und Blasen aus den Vertiefungen. Legen Sie die Brunnenplatten auf Nasseis oder einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius, um sie für 20 Minuten einzustellen, und bewegen Sie die Platte dann über Nacht in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.Wenn hohe PSEs 70% Konfluenz erreichen, fügen Sie 10 mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632 zu human induzierten pluripotenten Stammzellen hinzu und warten Sie eine Stunde vor der Dissoziation. Saugen Sie die Medien ab und waschen Sie die Zellen einmal mit PVS. Dissoziieren Sie IPSCs durch Zugabe von 500 Mikrolitern Zellablösungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.Nach der Inkubation 500 Mikroliter Stammzell-Passaging-Medium pro Vertiefung hinzufügen. Pipettieren Sie zellen vorsichtig mit einer P1000-Spitze, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten. Dann übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 mal G.Nach der Zentrifugation saugen Sie das Medium ab und resuspenieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter mTeSR Plus-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren.Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, fügen Sie zweimal 10 zu den fünften IPSCs zu jeder Vertiefung einer 12-Well-GFR-Medium-beschichteten Platte hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie das mTeSR Plus, bevor Sie definitive Endoderm- oder DE-Induktionsmedien hinzufügen. Wechseln Sie an den Tagen zwei und drei die DE-Induktionsmedien.Beginnen Sie am vierten Tag mit der AFE-Induktion, indem Sie DE-Induktionsmedien durch serumfreies Basalmedium ersetzen. Wechseln Sie das AFE-Medium drei Tage lang täglich, bevor Sie die AFE-Effizienz am Ende des sechsten Tages analysieren. Am siebten Tag das GFR-Basalmembran-Matrix-Medium auf Eis zur späteren Verwendung auftauen.Fahren Sie gleichzeitig mit der Differenzierung der Lungenvorläuferzellen fort, indem Sie die AFE-Medien ansaugen und die Vertiefungen mit PVS waschen. Einen Milliliter Zellablösung in den Brunnen geben und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter Abschreckmedium in die Wells geben, die Zellablösung enthalten.Halten Sie Zellen als Aggregate, indem Sie vorsichtig nach oben und unten pipettieren. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen entfernt sind, aber um sie fünf Minuten lang in ein konisches 15-Milliliter-Rohr zur Zentrifugation bei 300 mal G zu übertragen. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in LPC-Induktionsmedien.Zählen Sie die Zellen und fügen Sie 2,5 mal 10 zu den fünften Zellen zu 100 Mikrolitern kaltem GFR-Basalmembranmatrixmedium hinzu und mischen Sie gut. Legen Sie einen Tropfen in einen Brunnen einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter LPC-Medien pro Vertiefung hinzu, um sicherzustellen, dass der mittlere Tropfen vollständig eingetaucht ist und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wird.Wechseln Sie am achten Tag das LPC-Medium, um den ROCK-Inhibitor Y27632 zu entfernen. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag und analysieren Sie die LPC-Effizienz am Ende von Tag 16. Waschen Sie am Tag 17 die Wells und fügen Sie 500 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter dispase hinzu.Die Dispase-Mischung mit einer P1000-Pipette pipettieren und 15 Minuten inkubieren, dann die Mischung pipettieren und weitere 15 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter des Abschreckmediums in die Dispaese geben, die Vertiefungen enthält, und die Zellen in konische Röhrchen überführen. Zentrifugieren und resuspenieren Sie das Pellet in einem Milliliter gekühltem PVS und wiederholen Sie dann die Zentrifugation.Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Zellablösungsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 12 Minuten, fügen Sie dann eine gleiche Menge Abschreckmittel hinzu und zentrifugieren Sie erneut. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Abschreckmedium und 10 mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632.Führen Sie eine Zellzählung durch, um das Volumen zu berechnen, das benötigt wird, um acht mal 10 bis zur vierten Zelle pro Vertiefung zu erhalten. Dann benötigte aliquot Volumen von LPC-Zellaggregaten in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für fünf Minuten bei 300 mal G.Entfernen Sie überschüssigen Überstand, ohne das Zellpellet zu rühren, und lassen Sie 10 Mikroliter Restmedien zurück. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter kaltes GFR-Basalmembranmatrixmedium und übertragen Sie die Zellen auf Zellkulturmembraneinsätze.Bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter 3D-Organoid-Induktionsmedium in die basolaterale Kammer des Einsatzes geben und sechs Tage lang jeden zweiten Tag durch frisches Medium ersetzen. Schalten Sie am 23. Tag das Medium auf das 3D-Verzweigungsmedium um und wechseln Sie dann sechs Tage lang jeden zweiten Tag das Medium.Wechseln Sie am 29. Tag zum 3D-Reifungsmedium und ersetzen Sie das Medium in den nächsten sechs Tagen jeden zweiten Tag. Am vierten Tag der DE-Induktion zeigen die angeschlossenen Zellen eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie. Die definitiven Endodermmarker CXCR4 und SOX17, die mit Kernen überlagert waren, wurden exprimiert, was die endodermale Differenzierung bestätigte.Die vordere Vorderdarminduktion wurde am siebten Tag bestätigt, wobei die Morphologie enger verdichtete Zellen zeigte und die Marker FOXA2 und SOX2 mit Kernen überlagert waren. Die Erzeugung von 3D-Lungenvorläuferzellen wurde mit 3D-Sphäroiden und der endogenen Expression von NKX2-1 GFP in einer Reporterzelllinie bestätigt. Nach einer dreiwöchigen Differenzierung in ganze Lungenorganoide wurden die Lungenmarker immunzytochemisch analysiert.Marker für die verzweigte Morphogenese SOX2 und SOX9, die von Kernen überlagert werden, wurden in den Organoiden beobachtet. Die proximalen Lungenmarker P63 und KRT5, beides Marker von Basalzellen, wurden zusammen mit SCGB3A2, einem Marker für Clubzellen, erfolgreich nachgewiesen. Distale Lungenmarker induzierten Pro SPC- und SPB-Marker für alveoläre Typ-II-Zellen.Und HOPX-Marker von alveolären Typ-I-Zellen. Zusätzlich wurden NKX2-1 und ZO1 mit Kernen überlagert exprimiert. Die Mesenchyme-Lungenzellmarker PGFR Alpha, ein Marker für Fibroblasten, koexprimiert mit SOX9, repräsentierten distales Mesenchym.Vimentin wurde ebenfalls exprimiert und in der Lunge verteilt. Nach diesem Verfahren können die Lungenorganoide mit induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothel- und Immunzellen investiert werden. Lungenentwicklung und -erkrankung erfolgt durch eine Signalübertragung zwischen den epithelialen und mesenchymalen Zellpopulationen, aber auch von Endothelzellen und Makrophagen.Ein 3D-Lungengewebemodellsystem ist klinisch relevant für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Therapeutika.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...