Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של תוכנית הגנות המחקר האנושי של UCSD (181180).
1. אינדוקציה אנדודרמית מוחלטת מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (יום 1 - 3)
<ol><li>לאט לאט להפשיר גורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף ממברנה (BM) מטריצה בינונית על קרח 30 דקות לפני השימוש. ב DMEM / F12 קר, תערובת, ?...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

ההבחנה המוצלחת של אורגנוידים של ריאות שלמים תלת-ממדיים (WLO) מסתמכת על פרוטוקול רב-שלבי בן 6 שבועות עם תשומת לב לפרטים, כולל זמן חשיפה לגורמי גדילה ומולקולות קטנות, צפיפות תאית לאחר המעבר ואיכות hiPSCs. לפתרון בעיות, ראה טבלה 2. hiPSCs צריך להיות כ 70%-80% confluent, עם פחות מ 5% בידול ספונטני לפני ני?...

הריאה היא איבר מסובך, הטרוגני ודינמי המתפתח בשישה שלבים נפרדים - התבגרות עוברית, פסאודו-לנדולרית, תעלה, סקוקולרית, מכתשית ומיקרו-וסקולרית1,2. שני השלבים האחרונים מתרחשים לפני ולאחר הלידה בהתפתחות האנושית בעוד ארבעת השלבים הראשונים מתרחשים אך ורק במהלך התפתחות העובר אלא אם כן מתרחשת לידה מוקדמת3. השלב העוברי מתחיל בשכבת הנבט האנדיודרמלי ומסתיים עם ניצני קנה הנשימה וניצני הריאות. התפתחות הריאות מתרחשת בחלקה באמצעות איתות בין התאים האפיתל והמנשימלי4. אינטראקציות אלה גורמות להסתעפות ריאות, התפשטות, קביעת גורל תאי ובידול תאי של הריאה המתפתחת. הריאה מחולקת לאזורי ניצוח (קנה הנשימה לספונכיולים סופניים) ולאזורי נשימה (ברונכיולים נשימתיים אל הנפתים). כל אזור מכיל סוגי תאי אפיתל ייחודיים; כולל תאי בסיס, הפרשה, סילציה, מברשת, נוירואנדוקרינית, ויונוציטים בדרכי הנשימה מוליך5, ואחריו תאי I ו- II מכתשיים באפיתל הנשימה6. הרבה עדיין לא ידוע על ההתפתחות והתגובה לפגיעה של סוגי התאים השונים. מודלים אורגנויד ריאות נגזר iPSC לאפשר מחקר של מנגנונים המניעים את התפתחות הריאות האנושיות, את ההשפעות של מוטציות גנטיות על תפקוד הריאות, ואת התגובה של האפיתל ואת mesenchyme לסוכנים זיהומיים ללא צורך ברקמת ריאה אנושית ראשונית.
סמנים המתאימים לשלבים השונים של בידול עוברי כוללים CXCR4, cKit, FOXA2 ו- SOX17 עבור אנדודרם סופי (DE)7, FOXA2, TBX1 ו- SOX2 עבור אנדודרם נוקב מראש (AFE)8, ו- NKX2-1 עבור תאי אב ריאה מוקדמים9. בהתפתחות הריאות העובריות, הניטור מתחלק לוושט הגחון ולקמה הגחוני. ניצני הריאות הימניות והשמאליות מופיעים כשתי ריאות עצמאיות סביב ניצן קנה הנשימה10. במהלך הסתעפות מורפוגנזה, mesenchyme המקיף את האפיתל מייצר רקמה אלסטית, שריר חלק, סחוס, vasculature11. האינטראקציה בין האפיתל למנשים חיונית להתפתחות תקינה של הריאות. זה כולל את הפרשת FGF1012 על ידי mesenchyme ו SHH13 המיוצר על ידי האפיתל.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידול מכוון של hiPSCs לאורגנואידים תלת ממדיים (3D) ריאות שלמות (WLO). אמנם ישנן גישות דומות המשלבות בידוד של תאי אב ריאה באמצעות מיון בשלב LPC כדי להפוך אורגנוידים דמויי כתשית 14,15 (דיסטליים) או אורגנוידים (פרוקסימליים), או ליצור פרונואידים foregut גחוני-קדמוני כדי להפוך אורגנוידים ריאות אנושיים מבטאים תאי מצוחקים וסמנים mesenchymal ו organoids אב ניצן קצה17 כוחה של שיטה זו הוא הכללת סוגי תאי אפיתל ריאות ומזנכימליים לתבנית ולתזמר מורפוגנזה מסועפת ריאות, התבגרות והתרחבות במבחנה.,
פרוטוקול זה משתמש במולקולות קטנות וגורמי גדילה כדי לכוון את ההבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות אנדודרם מוחלט, אנדודרם חיצוני, ותאי צאצא ריאות. תאים אלה מושרים לאחר מכן לתוך אורגנוידים ריאות שלמות 3D באמצעות צעדים התפתחותיים חשובים, כולל הסתעפות והתבגרות. סיכום פרוטוקול הבידול מוצג באיור 1a עם תמונות ייצוגיות של בידול אנדודרמלי ואורגנויד המוצג באיור 1b. איור 1c,d להראות את פרטי ביטוי הגן של בידול אנדודרמלי, כמו גם את ביטוי הגן של אוכלוסיות פרוקסימליות ודיסטליות של תאי אפיתל ריאות לאחר השלמת ההבחנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

התפתחות ריאות אנושיות ומחלות כבר קשה ללמוד בשל היעדר רלוונטי ביולוגית במערכות מודל במבחנה . תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs) ניתן להבדיל צעד לתוך organoids ריאות רב תאיים 3D, עשוי הן אוכלוסיות אפיתל ותאים mesenchymal. אנו מסכמים רמזים התפתחותיים עובריים על ידי החדרה זמנית של מגוון גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי ליצור ביעילות אנדודרם סופי, אנדודרם חותם מראש, ולאחר מכן תאי אב ריאה. תאים אלה מוטמעים לאחר מכן בגורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף מטריצת ממברנה מדיום, המאפשר להם להתפתח באופן ספונטני לתוך organoids ריאות 3D בתגובה לגורמי גדילה חיצוניים. אלה אורגנוידים ריאות שלם (WLO) לעבור שלבים התפתחותיים ריאות מוקדם כולל מורפוגנזה המסתעפת והתבגרות לאחר חשיפה דקסמתזון, AMP מחזורי ואיזובוטילקסנתין. WLOs מחזיקים בתאי אפיתל דרכי הנשימה המבטאים את הסמנים KRT5 (בזאל), SCGB3A2 (מועדון) ו- MUC5AC (גביע) כמו גם תאי אפיתל מכתשיים המבטאים HOPX (סוג מכתשי I) ו- SP-C (סוג מכתשי II). תאים mesenchymal נוכחים גם, כולל אקטין שריר חלק (SMA), קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם A (PDGFRα). ניתן לשמור על WLOs נגזר iPSC בתנאי תרבות תלת-ממדית במשך חודשים רבים וניתן למיין עבור סמני שטח כדי לטהר אוכלוסיית תאים ספציפית. ניתן להשתמש ב-WLOs שמקורם ב-iPSC גם כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, כולל איתות בין אפיתל הריאות למזנשים, כדי לדגמן מוטציות גנטיות על תפקוד והתפתחות תאי הריאה האנושיים, ולקבוע את הציטוקסיות של חומרים מדביקים.

24 שעות לאחר ה ציפוי, יום 1, iPSCs צריך להיות 50%-90% מפגש. ביום 2, DE צריך להיות 90%-95% confluent. במהלך אינדוקציה של DE, מקובל לצפות במוות תאים משמעותי ביום 4, אך תאים מחוברים ישמרו על מורפולוגיה קומפקטית מרוצפת אבן (איור 2b). הפסק את הבידול אם רוב התאים החסידים מתנתקים ושוקל לקצר את החשיפה למדי...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

המאמר מתאר הבחנה מכוונת צעד של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים לאורגנואידים תלת ממדיים שלמים של ריאות המכילים תאי ריאה אפיתל פרוקסימליים ודיסטליים יחד עם מזנכיים.

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

פרוטוקול זה משתמש בתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים כדי להבדיל אותם לתאי ריאה על מנת לדגמן מחלת ריאות אנושית והתפתחות בצלחת. פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה קשה להשיג ותרבות רקמת ריאה אנושית ראשונית. היתרונות העיקריים של הבחנה בין תאי ריאה מתאי גזע פלוריפוטנטים הוא אספקה מתמדת של תאי ריאה ספציפיים כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות ומחלות.תאים אלה יכולים להישמר בתרבית התאים לפרקי זמן ארוכים, ניתן להקריע עבור יישומים עתידיים, וניתן לתמרן אותם גנטית כדי לחקור מוטציות גנטיות. תוכיח את ההליך תהיה רייצ'ל מקוויקר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. לפני תחילת הניסוי, להפשיר לאט גורם גדילה מופחת, או GFR, מטריצת קרום מרתף מדיום על קרח, לדלל אותו בנפח שווה של DMEM F12 קר.מכניסים טיפים P1000 למקפיא לצינון לפני השימוש. לאחר מכן, מצפים כל באר של צלחת 12 באר עם 500 microliters של 50% GFR מטריצת ממברנה מרתף מדיום, ולהסיר כל תערובת בינונית עודף בועות מן הבארות. מניחים את צלחות הבאר על גבי קרח רטוב או מקרר בארבע מעלות צלזיוס כדי להגדיר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את הצלחת לחממה 37 מעלות צלזיוס לילה.כאשר PSEs גבוה להגיע 70% השפעה, להוסיף 10 מעכבי סלע micromolar Y27632 לתאי גזע פלוריפוטנטים המושרה אנושי, ולחכות שעה לפני הניתוק. שאף את המדיה, ולשטוף את התאים פעם אחת עם PVS. נתק IPSCs על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של ניתוק תאים בינוני לבאר, ודגר במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה, להוסיף 500 microliters של תאי גזע עובר מדיום לבאר. צנרת בעדינות תאים באמצעות קצה P1000 כדי לקבל השעיה תא אחד. לאחר מכן להעביר את התאים מנותקים לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.Following צנטריפוגה, לשאוף את המדיום, ולנצל מחדש את גלולה התא עם מיליליטר אחד של mTeSR פלוס מדיה בתוספת עם 10 מעכבי ROCK micromolar.לאחר ספירת התאים, הוסף פעמיים 10 ל- IPSCs החמישי לכל באר של צלחת מצופה בינונית GFR 12 היטב, ודגרה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שאף את mTeSR פלוס לפני הוספת אנדודרם מוחלט, או DE, אינדוקציה מדיה. בימים שניים ושלוש, לשנות את התקשורת אינדוקציה DE.ביום הרביעי, התחילו באינדוקציה של AFE על ידי החלפת מדיית אינדוקציה של DE במדיום בזאלי נטול סרום. שנה את AFE מדיום מדי יום למשך שלושה ימים לפני ניתוח יעילות AFE בסוף היום השישי. ביום השביעי, להפשיר מטריצת קרום מרתף GFR בינוני על קרח לשימוש מאוחר יותר.בו זמנית, להמשיך עם בידול תא ריאות על ידי שאיפה של מדיה AFE ושטיפת בארות עם PVS. מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון ניתוק התא לבאר ודגר במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של מדיה מרווה לבארות המכילות פתרון ניתוק תאים.שמור על התאים כצברגים על-ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. ודא שכל התאים מנותקים, אבל להעברתם לצינור חרוטי 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. הסר supernatant ו resuspend גלולה התא במדיה אינדוקציה LPC.לספור את התאים, ולהוסיף 2.5 כפול 10 לתאים החמישיים ל 100 microliters של מטריצת מרתף GFR קר מדיום, ולערבב היטב. מניחים טיפה לתוך באר של צלחת 12 טוב ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה LPC לכל טוב, להבטיח כי הירידה הבינונית הוא שקוע לחלוטין דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.ביום השמיני, לשנות LPC בינוני כדי להסיר מעכב רוק Y27632. המשך לשנות את המדיה כל יומיים ולנתח את יעילות LPC בסוף היום ה-16. ביום 17, לשטוף בארות ולהוסיף 500 microliters של שני מיקרוגרם למיליליטר dispase.פיפטה את תערובת dispase עם פיפטה P1000 ודגרה במשך 15 דקות, ולאחר מכן pipette את התערובת ודגורה במשך 15 דקות נוספות. לאחר הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה מרווה ל dispase המכיל בארות, ולהעביר את התאים לתוך צינורות חרוט. צנטריפוגה ו resuspend הכדור במיליליטר אחד של PVS צונן, ולאחר מכן לחזור על הצנטריפוגה.ואז resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיום ניתוק התא. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של מדיה מרווה צנטריפוגה שוב. Resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיה מרווה ומעכב 10 מיקרומולר רוק Y27632.בצע ספירת תאים כדי לחשב את אמצעי האחסון הדרוש כדי להשיג שמונה כפול 10 לתאים הרביעיים בכל באר. ואז aliquot נדרש נפח של אגרגטים תא LPC לתוך 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגות מיקרו, וצנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.הסר עודף supernatant מבלי להסעיר את גלולה התא, משאיר 10 microliters של מדיה שיורית. resuspend גלולה התא ב 200 microliters של מטריצת קרום מרתף GFR קר מדיום ולהעביר את התאים לתוספות קרום תרבית התא.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה אורגנויד תלת-ממדי לתא הבסולטרלי של ההוספה, והחליפו אותו במדיום טרי כל יומיים במשך שישה ימים. ביום 23, לעבור את המדיום להסתעפות 3D, ולאחר מכן לשנות את המדיום כל יומיים במשך שישה ימים.ביום 29, עבור למדיום התבגרות תלת-ממדי, והמשיך להחליף את המדיום כל יומיים במשך ששת הימים הבאים. ביום הרביעי של אינדוקציה DE, תאים מחוברים להציג מורפולוגיה מרוצפת אבן קומפקטית. סמני אנדודרם סופיים CXCR4 ו SOX17 מצופה גרעין התבטא, המאשר בידול אנדודרמלי.אינדוקציה מראש מראש אושרה ביום השביעי עם המורפולוגיה מראה תאים דחוסים יותר, ואת הסמנים FOXA2 ו SOX2 על גבי גרעינים. הדור של תאי ריאה תלת-ממדיים אושר עם כדורי תלת-ממד, והביטוי האנדוגני של NKX2-1 GFP בקו תא עיתונאי. לאחר שלושה שבועות של בידול לאורגנואידים של ריאות שלמות, סמני הריאות נותחו על ידי אימונוציטוכימיה.סמנים עבור הסתעפות morphogenesis SOX2 ו SOX9 על גבי גרעינים נצפתה באורגנוידים. סמני ריאות פרוקסימליים P63 ו KRT5, שניהם סמנים של תאי בזאלי, זוהו בהצלחה יחד עם SCGB3A2, המהווה סמן לתאי מועדון. סמני ריאות דיסטליים המושרה סמני Pro SPC ו- SPB עבור תאי סוג II של כיפתנים.וסמני HOPX של תאי סוג משופת I. בנוסף, NKX2-1 ו- ZO1 התבטאו בגרעין. סמני תאי הריאה של Mesenchyme PGFR Alpha, סמן לפיברובלסטים, שבא לידי ביטוי בשיתוף עם SOX9, ייצגו מזנשים דיסטליים.וימנטין התבטא גם הוא ופוזר בכל הריאה. לאחר הליך זה, אורגנוידים ריאות ניתן להשקיע עם תאי גזע פלוריפוטנט המושרה המושרה אנדותל ותאי מערכת החיסון. התפתחות ריאות ומחלות מתרחשות על ידי איתות בין אוכלוסיות התאים האפיתל והמנשימאלי, אך גם מתאי אנדותל ומקרופות.מערכת מודל רקמת ריאה תלת-ממדית רלוונטית קלינית לחקר מחלות האדם וטיפולים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...