Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Questo protocollo di studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del programma di protezione della ricerca umana dell'UCSD (181180).
1. Induzione definitiva dell'endoderma da cellule staminali pluripotenti indotte (Giorno 1 - 3)
<ol><li>Scongelare lentamente il fattore di crescita ridotto (GFR) -membrana basale (BM) mezzo di matrice su ghiaccio 30 minuti prima dell'uso. In miscela DMEM/F12 a freddo, diluire il mezzo della matrice GFR BM 1:1 in modo tale che costituisca il 50% d...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. 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A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. 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H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

Il successo della differenziazione degli organoidi polmonari interi 3D (WLO) si basa su un protocollo multi-step di 6 settimane con attenzione ai dettagli, incluso il tempo di esposizione a fattori di crescita e piccole molecole, la densità cellulare dopo il passaggio e la qualità delle hiPSC. Per la risoluzione dei problemi, vedere la Tabella 2. Le hiPSC dovrebbero essere confluenti per circa il 70%-80%, con meno del 5% di differenziazione spontanea prima della dissociazione. Questo protocollo richied...

Il polmone è un organo complicato, eterogeneo e dinamico che si sviluppa in sei fasi distinte: maturazione embrionale, pseudoghiandolare, canalicolare, sacculare, alveolare e microvascolare1,2. Le ultime due fasi si verificano prima e dopo la nascita nello sviluppo umano, mentre le prime quattro fasi si verificano esclusivamente durante lo sviluppo fetale, a meno che non si verifichi la nascita pretermine3. La fase embrionale inizia nello strato germinale endodermico e si conclude con il germogliamento della trachea e delle gemme polmonari. Lo sviluppo polmonare avviene in parte attraverso la segnalazione tra le cellule epiteliali e mesenchimali4. Queste interazioni provocano la ramificazione polmonare, la proliferazione, la determinazione del destino cellulare e la differenziazione cellulare del polmone in via di sviluppo. Il polmone è diviso in zone conduttrici (trachea ai bronchioli terminali) e zone respiratorie (bronchioli respiratori agli alveoli). Ogni zona contiene tipi di cellule epiteliali uniche; comprese le cellule basali, secretorie, ciliate, a pennello, neuroendocrine e ionocitarie nelle vie aeree conduttrici5, seguite da cellule alveolari di tipo I e II nell'epitelio respiratorio6. Molto è ancora sconosciuto sullo sviluppo e la risposta alle lesioni dei vari tipi di cellule. I modelli di organoidi polmonari derivati da iPSC consentono lo studio dei meccanismi che guidano lo sviluppo del polmone umano, gli effetti delle mutazioni genetiche sulla funzione polmonare e la risposta sia dell'epitelio che del mesenchima agli agenti infettivi senza la necessità di tessuto polmonare umano primario.
I marcatori corrispondenti ai vari stadi della differenziazione embrionale includono CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 per l'endoderma definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 e SOX2 per l'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE)8 e NKX2-1 per le prime cellule progenitrici polmonari9. Nello sviluppo polmonare embrionale, l'intestino anteriore si divide nell'esofago dorsale e nella trachea ventrale. Le gemme dei polmoni destro e sinistro appaiono come due outpouching indipendenti attorno al germoglio tracheale10. Durante la morfogenesi ramificata, il mesenchima che circonda l'epitelio produce tessuto elastico, muscolatura liscia, cartilagine e vascolarizzazione11. L'interazione tra l'epitelio e il mesenchima è essenziale per il normale sviluppo polmonare. Ciò include la secrezione di FGF1012 da parte del mesenchima e SHH13 prodotto dall'epitelio.
Qui, descriviamo un protocollo per la differenziazione diretta delle hiPSC in organoidi polmonari interi tridimensionali (3D) (WLO). Mentre ci sono approcci simili che incorporano l'isolamento delle cellule progenitrici polmonari tramite smistamento allo stadio LPC per produrre organoidi alveolari14,15 (distali) o organoidi delle vie aeree16 (prossimali), o generare sferoidi ventrali-anteriori del foregut per produrre organoidi polmonari umani che esprimono marcatori alveolari e mesenchimali e organoidi progenitori della punta delle gemme17 , il punto di forza di questo metodo è l'inclusione di entrambi i tipi di cellule epiteliali e mesenchimali polmonari per modellare e orchestrare la morfogenesi, la maturazione e l'espansione della ramificazione polmonare in vitro.
Questo protocollo utilizza piccole molecole e fattori di crescita per dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti attraverso l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi indotte in organoidi polmonari interi 3D attraverso importanti fasi di sviluppo, tra cui la ramificazione e la maturazione. Il riassunto del protocollo di differenziazione è mostrato nella Figura 1a con immagini rappresentative in campo luminoso della differenziazione endodermica e organoide mostrata nella Figura 1b. La Figura 1c,d mostra i dettagli dell'espressione genica della differenziazione endodermica e l'espressione genica di entrambe le popolazioni prossimali e distali delle cellule epiteliali polmonari dopo aver completato la differenziazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Lo sviluppo e la malattia polmonare umana sono stati difficili da studiare a causa della mancanza di sistemi modello in vitro biologicamente rilevanti. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) possono essere differenziate gradualmente in organoidi polmonari multicellulari 3D, costituiti da popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali. Ricapitoliamo i segnali di sviluppo embrionale introducendo temporalmente una varietà di fattori di crescita e piccole molecole per generare in modo efficiente l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e successivamente le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi incorporate nel mezzo della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto (GFR), consentendo loro di svilupparsi spontaneamente in organoidi polmonari 3D in risposta a fattori di crescita esterni. Questi organoidi polmonari interi (WLO) subiscono fasi iniziali di sviluppo polmonare tra cui morfogenesi ramificata e maturazione dopo l'esposizione a desametasone, AMP ciclico e isobutilxantina. I WLO possiedono cellule epiteliali delle vie aeree che esprimono i marcatori KRT5 (basale), SCGB3A2 (club) e MUC5AC (calice) e cellule epiteliali alveolari che esprimono HOPX (tipo alveolare I) e SP-C (tipo alveolare II). Sono presenti anche cellule mesenchimali, tra cui l'actina della muscolatura liscia (SMA) e il recettore A del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα). I WLO derivati da iPSC possono essere mantenuti in condizioni di coltura 3D per molti mesi e possono essere ordinati per i marcatori di superficie per purificare una specifica popolazione cellulare. I LLO derivati da iPSC possono anche essere utilizzati per studiare lo sviluppo polmonare umano, compresa la segnalazione tra l'epitelio polmonare e il mesenchima, per modellare mutazioni genetiche sulla funzione e lo sviluppo delle cellule polmonari umane e per determinare la citotossicità degli agenti infettivi.

24 ore dopo la placcatura, giorno 1, le iPSC dovrebbero essere confluenti al 50% -90%. Il giorno 2, DE dovrebbe essere confluente al 90% -95%. Durante l'induzione de, è comune osservare una significativa morte cellulare il giorno 4, ma le cellule attaccate manterranno una morfologia compatta di ciottoli (Figura 2b). Interrompere la differenziazione se la maggior parte delle cellule aderenti si stacca e considera di abbreviare l'esposizione ai mezzi DE con activina A di 6-12 ore. Durante l'i...

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Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

L'articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Questo protocollo utilizza cellule staminali pluripotenti indotte per differenziarle in cellule polmonari al fine di modellare la malattia polmonare umana e lo sviluppo in un piatto. Questo protocollo è significativo perché è difficile ottenere e coltivare tessuto polmonare umano primario. I principali vantaggi di differenziare le cellule polmonari dalle cellule staminali pluripotenti è quello di avere un apporto costante di cellule polmonari specifiche per studiare lo sviluppo e la malattia polmonare umana.Queste cellule possono essere mantenute in coltura cellulare per lunghi periodi di tempo, possono essere crioconservate per applicazioni future e possono essere geneticamente manipolate per studiare le mutazioni geniche. A dimostrare la procedura sarà Rachel McVicar, dottoranda del mio laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, scongelare lentamente un fattore di crescita ridotto, o GFR, mezzo della matrice della membrana basale sul ghiaccio e diluirlo in un volume uguale di DMEM F12 freddo.Posizionare le punte P1000 nel congelatore per raffreddare prima dell'uso. Quindi, rivestire ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 500 microlitri del mezzo a matrice di membrana basale 50% GFR e rimuovere qualsiasi miscela di mezzo in eccesso e bolle dai pozzetti. Posizionare le piastre del pozzo sopra il ghiaccio bagnato o un frigorifero a quattro gradi Celsius per impostare per 20 minuti, quindi spostare la piastra sull'incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte.Quando i PSE elevati raggiungono il 70% di confluenza, aggiungere 10 inibitori ROCK micromolari Y27632 alle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e attendere un'ora prima della dissociazione. Aspirare il fluido e lavare le celle una volta con PVS. Dissociare le IPSC aggiungendo 500 microlitri di mezzo di distacco cellulare per pozzetto e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%.Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo di passaggio delle cellule staminali per pozzetto. Pipettare delicatamente le celle utilizzando una punta P1000 per ottenere una sospensione a cella singola. Quindi trasferire le cellule dissociate in un tubo da 15 millilitri e centrifuga per cinque minuti a 300 volte G.Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo e risospesciare il pellet cellulare con un millilitro di mTeSR Plus media integrato con 10 inibitori ROCK micromolari.Dopo aver contato le cellule, aggiungere due volte 10 alla quinta IPSC a ciascun pozzetto di una piastra a rivestimento medio GFR a 12 pozzetti e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare mTeSR Plus prima di aggiungere un supporto di induzione definitivo dell'endoderma o DE. Nei giorni due e tre, cambiare il supporto di induzione DE.Il quarto giorno, iniziare l'induzione AFE sostituendo il mezzo di induzione DE con mezzo basale privo di siero. Cambiare il mezzo AFE ogni giorno per tre giorni prima di analizzare l'efficienza AFE alla fine del sesto giorno. Il settimo giorno, scongelare il mezzo della matrice della membrana basale GFR sul ghiaccio per un uso successivo.Contemporaneamente, procedere con la differenziazione delle cellule progenitrici polmonari aspirando i mezzi AFE e lavando i pozzetti con PVS. Aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare al pozzo e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzi di tempra alla soluzione di distacco cellulare contenente Wells.Mantenere le cellule come aggregati pipettando delicatamente su e giù. Assicurarsi che tutte le cellule siano spostate, ma per trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione a 300 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare nel mezzo di induzione LPC.Contare le cellule e aggiungere 2,5 volte 10 alla quinta cella a 100 microlitri di mezzo a matrice di membrana basale GFR fredda e mescolare bene. Posizionare una goccia in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di fluidi LPC per pozzetto, assicurandosi che la goccia media sia completamente sommersa e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.L'ottavo giorno, cambiare il mezzo LPC per rimuovere l'inibitore ROCK Y27632. Continua a cambiare i media a giorni alterni e analizza l'efficienza LPC alla fine del giorno 16. Il giorno 17, lavare i pozzetti e aggiungere 500 microlitri di due microgrammi per millilitro dispase.Pipettare la miscela dispase con una pipetta P1000 e incubare per 15 minuti, quindi pipettare la miscela e incubare per altri 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro del mezzo di tempra ai pozzetti contenenti dispase e trasferire le cellule in tubi conici. Centrifugare e risospese il pellet in un millilitro di PVS refrigerato, quindi ripetere la centrifugazione.Quindi risospesare il pellet in un millilitro di mezzo di distacco cellulare. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 12 minuti, quindi aggiungere un volume uguale di mezzi di tempra e centrifugare di nuovo. Risospesciare il pellet in un millilitro di mezzi di tempra e 10 micromolari inibitore ROCK Y27632.Eseguire un conteggio delle celle per calcolare il volume necessario per ottenere otto volte 10 alle quarte celle per pozzetto. Quindi aliquota richiesta volume di aggregati di celle LPC in tubi micro centrifuga da 1,5 millilitri e centrifuga per cinque minuti a 300 volte G.Rimuovere il surnatante in eccesso senza agitare il pellet cellulare, lasciando 10 microlitri di mezzo residuo. Risospesso il pellet cellulare in 200 microlitri di mezzo a membrana basale GFR fredda e trasferire le cellule agli inserti della membrana di coltura cellulare.Incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzo di induzione organoide 3D alla camera basolaterale dell'inserto e sostituirlo con un mezzo fresco a giorni alterni per sei giorni. Il giorno 23, passa il mezzo al mezzo di ramificazione 3D, quindi cambia il mezzo a giorni alterni per sei giorni.Il giorno 29, passa al mezzo di maturazione 3D e continua a sostituire il mezzo a giorni alterni per i prossimi sei giorni. Il quarto giorno di induzione DE, le cellule attaccate mostrano una morfologia compatta di ciottoli. I marcatori endodermici definitivi CXCR4 e SOX17 sovrapposti ai nuclei sono stati espressi, confermando la differenziazione endodermica.L'induzione del foregut anteriore è stata confermata il settimo giorno con la morfologia che mostra cellule più strettamente compattate e i marcatori FOXA2 e SOX2 sovrapposti ai nuclei. La generazione di cellule progenitrici polmonari 3D è stata confermata con sferoidi 3D e l'espressione endogena di NKX2-1 GFP in una linea cellulare reporter. Dopo una differenziazione di tre settimane in organoidi polmonari interi, i marcatori polmonari sono stati analizzati mediante immunocitochimica.Negli organoidi sono stati osservati marcatori per la morfogenesi ramificata SOX2 e SOX9 sovrapposti da nuclei. I marcatori polmonari prossimali P63 e KRT5, entrambi marcatori di cellule basali, sono stati rilevati con successo insieme a SCGB3A2, che è un marcatore per le cellule club. I marcatori polmonari distali hanno indotto marcatori Pro SPC e SPB per cellule alveolari di tipo II.E marcatori HOPX di cellule alveolari di tipo I. Inoltre, NKX2-1 e ZO1 sono stati espressi sovrapposti a nuclei. I marcatori delle cellule polmonari mesenchima PGFR Alpha, un marcatore per i fibroblasti, co-espresso con SOX9, rappresentavano il mesenchima distale.Anche la vimentina è stata espressa ed è stata dispersa in tutto il polmone. Seguendo questa procedura, gli organoidi polmonari possono essere investiti con cellule staminali pluripotenti indotte derivate da cellule staminali endoteliali e immuni. Lo sviluppo e la malattia polmonare si verificano mediante una segnalazione tra le popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali, ma anche da cellule endoteliali e macrofagi.Un sistema di modelli di tessuto polmonare 3D è clinicamente rilevante per studiare malattie e terapie umane.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell&#39;artrite reumatoide pazienti

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Epatectomia parziale lobulare: Un modello chirurgico per rigenerazione epatica morfologica

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...