Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

이 연구는 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에 의해 지원 되었다 (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

이 연구 프로토콜은 UCSD의 인간 연구 보호 프로그램 (181180)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 유도 만능 줄기 세포에서 최종 엔도드름 유도 (1 일 - 3)
<ol><li>천천히 해동 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 (BM) 매트릭스 배지 얼음에 30 분 전에 사용하기 전에. 감기 DMEM/F12에서, 혼합물은, GFR BM 매트릭스 배지를 희석시켜 이 매체의 50%를 구성한다. P1000 파이펫 팁을 냉동실?...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

3D 전체 폐 오르가노이드 (WLO)의 성공적인 분화는 성장 인자와 소분자에 노출되는 시간, 패세후 세포 밀도 및 hiPSC의 품질을 포함하여 세부 사항에주의를 기울여 다단계 6 주 프로토콜에 의존합니다. 문제 해결의 경우 표 2를 참조하십시오. hiPSC는 약 70%-80%의 컨할 수 있어야 하며, 해리 전에 5% 미만의 자발적인 분화를 해야 합니다. 이 프로토콜은 "mTeSR 플러스"매체를 요구합니다. 그러나,...

폐는 배아, 의사, 캐날리큘러, 충류, 및 미세 혈관 성숙1,2 - 6 개의 별개의 단계에서 발전하는 복잡하고 이질적이며 역동적 인 기관입니다. 후자의 두 단계는 조산이 발생하지 않는 한 태아 발달 중에 독점적으로 발생하는 반면, 인간 발달에서 산후적으로 발생합니다3. 배아 단계는 내피 세균 층에서 시작하여 기관및 폐 싹의 신진으로 끝납니다. 폐 발달은 상피 세포와 중간엽 세포 4 사이의 신호를 통해 부분적으로 발생합니다. 이러한 상호 작용은 폐 분지, 증식, 세포 운명 결정 및 발전 폐의 세포 분화를 초래합니다. 폐는 전도 영역(말기 기관으로의 기관) 및 호흡기 영역(폐포에 대한 호흡기 기관지)으로 나뉩니다. 각 영역은 독특한 상피 세포 유형을 포함; 기저, 분비, 모양, 브러시, 신경 내분비 및 이오노세포 세포를 실시하는 기도55, 호흡 상피에서 폐포형 I 및 II 세포가 뒤따른다. 많은 개발 및 다양 한 세포 유형의 부상에 대 한 응답에 대 한 아직 알 수 없습니다. iPSC 유래 폐 오르가노이드 모델은 인간의 폐 발달을 유도하는 메커니즘, 폐 기능에 대한 유전 적 돌연변이의 효과 및 1 차적인 인간 폐 조직에 대한 필요없이 전염성 요원에 대한 상피 및 메센키메 의 반응을 가능하게합니다.
배아 분화의 다양한 단계에 대응하는 마커는 CXCR4, cKit, FOXA2 및 SOX17을 위한 최종 엔도드름(DE)7, FOXA2, TBX1 및 SOX2를 위한 전방 전방 배구 내분방(AFE)8, 및 초기 폐선세포에 대한 NKX2-1을 포함한다. 배아 폐 발달에서, 전장은 등쪽 식도와 복부 기관으로 분할합니다. 오른쪽과 왼쪽 폐의 싹은 기관 bud10 주위에 두 개의 독립적 인 외설로 나타납니다. 형태 발생을 분기하는 동안 상피를 둘러싼 중간 근막은 탄성 조직, 부드러운 근육, 연골 및 혈관11을 생성합니다. 상피와 메센키메 사이의 상호 작용은 정상적인 폐 발달에 필수적입니다. 여기에는 FGF1012의 분비성 및 상피에 의해 생성된 SHH13이 포함됩니다.
여기서, 우리는 hiPSC의 지시된 분화에 대한 프로토콜을 3차원(3D) 전체 폐 오르가노이드(WLO)로 기술한다. LPC 단계에서 분류를 통해 폐 전구 세포의 절연을 통합하여 폐포-유사 14,15(distal) 오르가노이드 또는 기도를 만드는 유사한 접근법이 있지만, 16(근접) 오르가노이드, 또는 폐포 세포와 중간엽 마커 및 버드 팁 선조 오르가노이드를 발현하는 인간 폐 오르가노이드를 만들기 위해 복부 전방 전구 스페로이드를 생성합니다17 , 이 방법의 강도는 폐 상피 및 중간엽 세포 유형을 패턴화하여 체외에서 폐 분지, 성숙 및 확장을 조율하는 것이다.
이 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자를 사용하여 최종 엔데름, 전방 전방 배구 내분 및 폐 선조 세포를 통해 다능성 줄기 세포의 분화를 지시합니다. 이 세포는 그 때 분기및 성숙을 포함하여 중요한 발달 단계를 통해 3D 전체 폐 오르가노이드로 유도됩니다. 분화 프로토콜의 요약은 도 1b 에 도시된 내분피 및 오르가노이드 분화의 대표적인 브라이트필드 이미지와 함께 도 1a에 도시된다. 도 1c,d 는 분화를 완료한 후 폐 상피 세포의 근위 및 탈모 집단의 유전자 발현뿐만 아니라 내피 분화의 유전자 발현 세부 사항을 보여준다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

인간 폐 발달 및 질병은 생물학적으로 관련된 체외 모델 시스템의 부족으로 인해 연구하기가 어려웠습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 상피 및 중간 엽 세포 집단으로 만든 3D 다세포 폐 오르가노이드로 단계적으로 분화 될 수 있습니다. 우리는 다양한 성장 인자와 작은 분자를 효율적으로 생성하여 배아 발달 신호를 재구성하여 최종 엔도름, 전방 전방 전구 장부, 그리고 그 이후에 폐 선조 세포를 생성합니다. 이 세포는 그 때 감소된 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 매트릭스 매체에 내장되어, 그(것)들이 외부 성장 인자에 응하여 3D 폐 오르가노이드로 자발적으로 발전할 수 있게 합니다. 이 전체 폐 오르가노이드 (WLO)는 덱사메타손, 순환 앰프 및 이소부틸산틴에 노출 된 후 형성 형성 및 성숙을 포함한 초기 폐 발달 단계를 겪습니다. WlOs는 마커 KRT5 (기저), SCGB3A2 (클럽) 및 MUC5AC (잔)뿐만 아니라 HOPX (alveolar 타입 I) 및 SP-C (alveolar type II)를 표현하는 폐포 상피 세포를 발현하는 기도 상피 세포를 보유하고 있습니다. 중간엽 세포는 또한 평활근 액틴(SMA) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα)를 포함하는 존재한다. iPSC 유래 WlOs는 몇 달 동안 3D 배양 조건에서 유지될 수 있으며 특정 세포 집단을 정화하기 위해 표면 마커를 위해 정렬될 수 있다. iPSC 유래 WlOs는 또한 폐 상피와 관혈 사이의 신호를 포함하여 인간의 폐 발달을 연구하고, 인간 폐 세포 기능 및 발달에 대한 유전 적 돌연변이를 모델링하고, 감염제의 세포 독성을 결정하는 데 활용될 수 있다.

도금 후 24시간, 1일째, iPSC는 50%-90%의 컨할 수 있어야 합니다. 2일째에 DE는 90%-95%로 응모해야 합니다. DE 유도 하는 동안, 그것은 일반적인 세포 죽음을 관찰 하는 4 4 하지만 부착 된 세포는 소형 조약 돌 형태를 유지 합니다 (도 2b). 대부분의 부착 세포가 분리되고 활성 A를 사용하여 DE 미디어에 대한 노출을 6-12 h로 단축하는 것을 고려하는 경우 분화를 중단합니다. AFE 유도 하?...

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Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

이 프로토콜은 유도 된 다능성 줄기 세포를 사용하여 인간의 폐 질환과 접시의 발달을 모델링하기 위해 폐 세포로 분화합니다. 이 프로토콜은 1 차적인 인간 폐 조직을 얻고 배양하기 어렵기 때문에 중요합니다. 만능 줄기 세포에서 폐 세포를 분화의 주요 장점은 인간의 폐 발달 과 질병을 연구하기 위해 특정 폐 세포의 지속적인 공급을 갖는 것입니다.이 세포는 오랜 기간 동안 세포 배양에서 유지될 수 있고, 미래의 응용을 위해 냉동 보존될 수 있고, 유전자 돌연변이를 연구하기 위하여 유전으로 조작될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후보 인 레이첼 맥비카 (Rachel McVicar)가 될 것입니다. 실험을 시작하기 전에, 천천히 감소 성장 인자, 또는 GFR, 얼음에 지하 막 매트릭스 매체를 해동하고, 차가운 DMEM F12의 동일한 볼륨으로 희석.사용 전에 냉장고에 P1000 팁을 놓습니다. 다음으로, 50%GFR 지하 멤브레인 매트릭스 배지의 500 마이크로리터로 12웰 플레이트의 각 웰을 코팅하고, 우물에서 임의의 초과 배지 혼합물 및 거품을 제거한다. 젖은 얼음 위에 우물 접시를 놓거나 냉장고를 섭씨 4도에 놓고 20 분 동안 설정한 다음 접시를 섭씨 37도 인큐베이터로 하룻밤 동안 옮습니다.높은 PSE가 70%의 연결성에 도달하면 인간 유도만능 줄기 세포에 10개의 마이크로몰러 ROCK 억제제 Y27632를 추가하고 해리 전에 한 시간을 기다립니다. 미디어를 흡인하고 PVS로 세포를 한 번 씻으세요. IPSC를 잘 당 500 마이크로리터의 세포 분리 매체를 추가하고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 줄기 세포 통과 배지의 500 마이크로 리터를 잘 한다. P1000 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫 셀을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 그런 다음 해리된 세포를 15 밀리리터 튜브및 원심분리기로 300회 G.Following 원심분리에서 5분간 전송하고, 배지를 흡습하고, 10마이크로몰러 ROCK 억제제로 보충된 mTeSR Plus 미디어의 1밀리리터로 세포 펠릿을 재연한다.세포를 계산한 후, 12웰 GFR 중간 코팅 플레이트의 각 웰에 다섯 번째 IPSC에 2회 10을 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 최종 엔데름 또는 DE 유도 매체를 추가하기 전에 mTeSR 플러스를 흡인. 2일과 3일에 DE 유도 매체를 변경합니다.4일째에는 DE 유도 매체를 세럼이 없는 기저매체로 대체하여 AFE 유도를 시작합니다. 6일 종료 후 AFE 효율을 분석하기 전에 3일간 매일 AFE 매체를 변경합니다. 7일째, GFR 지하 막 매트릭스 배지를 얼음위에 해동하여 나중에 사용한다.동시에, AFE 매체를 흡입하고 PVS로 우물을 세척하여 폐 전구 세포 분화를 진행한다. 잘 세포 분리 용액 1 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 세포 분리 용액을 포함하는 Wells에 담금질 매체 1 밀리리터를 추가합니다.셀을 위아래로 부드럽게 배관하여 응집체로 유지합니다. 모든 세포가 제거되었는지 확인하지만 원심 분리를 위해 15 밀리리터 원전 튜브로 5 분 동안 300 회 G로 옮기십시오. 상체를 제거하고 LPC 유도 매체에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다.세포를 계산하고, 차가운 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 100 마이크로 리터에 다섯 번째 세포에 2.5 배 10을 추가하고 잘 혼합한다. 12웰 플레이트의 우물에 물방울을 넣고 섭씨 37도에서 30~60분 동안 배양합니다. 다음으로, LPC 미디어 1밀리리터를 음부당 추가하여 중간 낙하가 완전히 잠기고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양할 수 있도록 합니다.8일째에는 LPC 배지를 변경하여 ROCK 억제제 Y27632를 제거합니다. 매일 미디어를 계속 변경하고 16일 말에 LPC 효율성을 분석하십시오. 17일, 우물을 씻고 밀리리터 디스파스당 2마이크로그램의 500마이크로리터를 추가합니다.P1000 파이펫으로 디스파제 혼합물을 피펫하고 15분 동안 배양한 다음 혼합물을 피펫하고 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라, 담금질 매체의 1밀리리터를 우물을 포함하는 디스파에 넣고 세포를 원뿔관으로 옮기는다. 원심분리기를 냉각된 PVS의 1밀리리터로 환원분리한 다음 원심분리를 반복합니다.그런 다음 세포 분리 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 섭씨 37도에서 12분 동안 배양한 다음 담금질 매체와 원심분리기의 동일한 양을 다시 추가합니다. 담금질 매체의 1 밀리리터와 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제 Y27632에서 펠릿을 다시 중단하십시오.셀 카운트를 수행하여 10번을 얻는 데 필요한 부피를 잘 당 4세포로 계산한다. 그런 다음 Aliquot는 LPC 세포 응집체의 부피를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로, 300배G.Remove 에서 5분 동안 세포 펠릿을 교반하지 않고 과잉 슈퍼네티얼을 제거하고 10 마이크로리터의 잔류 매체를 남겼다. 감기 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포 배양 막 삽입으로 세포를 전송한다.섭씨 37도에서 30~60분간 배양하세요. 인큐베이션 후, 삽입물의 바소포탈 챔버에 3D 오르간성 유도 배지 1밀리리터를 넣고 6일 동안 매일 신선한 배지로 교체한다. 23일, 매체를 3D 분기 매체로 전환한 다음 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.29일, 3D 성숙 매체로 변경하고, 앞으로 6일 동안 격일로 배지를 계속 교체한다. DE 유도의 4일째에, 연결된 세포는 소형 조약돌 형태를 표시합니다. 핵으로 오버레이된 결정적인 엔도름 마커 CXCR4 및 SOX17이 발현되어 내피 분화를 확인하였다.전방 전경 유도는 7일째에 보다 단단히 압축된 세포를 보여주는 형태학으로 확인되었으며, 마커 FOXA2 및 SOX2는 핵으로 오버레이되었다. 3D 폐 전구세포의 생성은 리포터 세포주에서 NKX2-1 GFP의 3D 스페로이드 및 내인성 발현으로 확인되었다. 전체 폐 오르가노이드로 3 주 분화 한 후, 폐 마커는 면역 세포 화학에 의해 분석되었다.핵에 의해 오버레이된 형태발생 SOX2 및 SOX9를 분기마커는 오르가노이드에서 관찰하였다. 기저 세포의 두 마커인 동축 폐 마커 P63 및 KRT5는 클럽 세포에 대한 마커인 SCGB3A2와 함께 성공적으로 검출되었다. 탈경 폐 마커는 알포올라 타입 II 세포를 위한 프로 SPC 및 SPB 마커를 유도하였다.그리고 폐포 타입 I 세포의 HOPX 마커. 또한, NKX2-1 및 ZO1은 핵과 겹쳐진 발현되었다. 메센키메 폐세포 마커 PGFR 알파는 SOX9과 공동 발현된 섬유아세포에 대한 마커로, 불실의 메센키메를 나타냈다.비멘틴도 발현되었고 폐 전체에 분산되었다. 이 절차에 따라 폐 오르가노이드는 유도된 다능성 줄기 세포유래 내피 및 면역 세포와 투자될 수 있다. 폐 발달 및 질병은 상피 세포 집단과 중간엽 세포 집단 사이 신호에 의해 또한 내피 세포 및 대식세포에서 생깁니다.3D 폐 조직 모델 시스템은 인체 질환 및 치료법을 연구하는 데 임상적으로 관련이 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

연구

발생학

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

부분 Lobular Hepatectomy: Morphologic 간 재생에 대 한 수술 모델

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...