Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Denne studieprotokollen ble godkjent av Institutional Review Board i UCSDs Human Research Protections Program (181180).
1. Definitiv endoderm induksjon fra induserte pluripotente stamceller (Dag 1 - 3)
<ol><li>Tines sakte vekstfaktoren redusert (GFR)-kjellermembran (BM) matrisemedium på is 30 minutter før bruk. I kald DMEM / F12 fortynner blanding GFR BM-matrisemediet 1:1 slik at det utgjør 50% av dette mediet. Plasser P1000 pipettespisser i fryseren for å kjøle deg ned før bruk.</li>
...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

Den vellykkede differensiering av 3D hele lungeorganoider (WLO) er avhengig av en flertrinns, 6-ukers protokoll med oppmerksomhet på detaljer, inkludert tidspunkt for eksponering for vekstfaktorer og små molekyler, cellulær tetthet etter passivitet og kvaliteten på hiPSCer. Hvis du vil ha feilsøking, kan du se tabell 2. hiPSCer bør være omtrent 70% -80% sammenfallende, med mindre enn 5% spontan differensiering før dissosiasjon. Denne protokollen krever "mTeSR plus"-medium. Imidlertid har vanlig "...

Lungen er et komplisert, heterogent, dynamisk organ som utvikler seg i seks forskjellige stadier - embryonal, pseudoglandulær, canalicular, saccular, alveolar og mikrovaskulær modning1,2. De to siste fasene forekommer før og postnatalt i menneskelig utvikling, mens de fire første stadiene forekommer utelukkende under fosterutvikling med mindre preterm fødsel oppstår3. Den embryonale fasen begynner i det endodermale bakterielaget og avsluttes med spirende luftrør og lungeknopper. Lungeutvikling skjer delvis via signalering mellom epitelceller og mesenchymale celler4. Disse interaksjonene resulterer i lungeforgrening, spredning, cellulær skjebnebestemmelse og cellulær differensiering av den utviklende lungen. Lungen er delt inn i ledende soner (luftrør til terminalbronkiolene) og åndedrettssoner (respiratoriske bronkioler til alveolene). Hver sone inneholder unike epitelcelletyper. inkludert basale, sekretoriske, cilierte, børste-, nevroendokrine og ionocyttceller i den ledende luftveiene5, etterfulgt av alveolar type I- og II-celler i respiratorisk epitel6. Mye er fortsatt ukjent om utvikling og respons på skade på de ulike celletypene. iPSC-avledede lungeorganoidmodeller muliggjør studiet av mekanismer som driver menneskelig lungeutvikling, effekten av genetiske mutasjoner på lungefunksjon, og responsen fra både epitelet og mesenchymet til smittsomme stoffer uten behov for primært humant lungevev.
Markører som tilsvarer de ulike stadiene av embryonal differensiering inkluderer CXCR4, cKit, FOXA2 og SOX17 for definitiv endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 og SOX2 for fremre foregut endoderm (AFE)8, og NKX2-1 for tidlige lungegenitorceller9. I embryonal lungeutvikling deler foregut seg i dorsal spiserøret og ventral luftrøret. Knoppene til høyre og venstre lunger vises som to uavhengige outpouchings rundt trakeal knopp10. Under forgrening av morfogenese produserer mesenchymet rundt epitelet elastisk vev, glatt muskel, brusk og vaskulatur11. Samspillet mellom epitel og mesenchyme er avgjørende for normal lungeutvikling. Dette inkluderer sekresjonen av FGF1012 av mesenchyme og SHH13 produsert av epitelet.
Her beskriver vi en protokoll for rettet differensiering av hiPSCer til tredimensjonale (3D) hele lungeorganoider (WLO). Mens det er lignende tilnærminger som inkorporerer isolasjon av lungeforfedrederceller via sortering på LPC-scenen for å lage alveolarlignende 14,15 (distale) organoider eller luftveier16 (proksimale) organoider, eller generere ventral-fremre foregut sfæroider for å lage menneskelige lungeorganoider som uttrykker alveolarcelle og mesenchymale markører og knoppeprogenitorer , styrken av denne metoden er inkludering av både lunge epitelial og mesenchymal celletyper for å mønstre og orkestrere lungeforgrening morfogenese, modning og ekspansjon in vitro.
Denne protokollen bruker små molekyler og vekstfaktorer for å lede differensiering av pluripotente stamceller gjennom definitiv endoderm, fremre foregut endoderm og lungeforfedrederceller. Disse cellene blir deretter indusert i 3D hele lungeorganoider gjennom viktige utviklingstrinn, inkludert forgrening og modning. Oppsummeringen av differensieringsprotokollen er vist i figur 1a med representative brightfield-bilder av endodermal og organoid differensiering vist i figur 1b. Figur 1c,d viser genuttrykksdetaljene til endodermal differensiering samt genuttrykket til både proksimale og distale populasjoner av lungeepitelceller etter å ha fullført differensiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Menneskelig lungeutvikling og sykdom har vært vanskelig å studere på grunn av mangel på biologisk relevante in vitro-modellsystemer . Menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer) kan differensieres trinnvis i 3D multicellulære lungeorganoider, laget av både epitel- og mesenchymale cellepopulasjoner. Vi rekapitulerer embryonale utviklingssignaler ved å bevisst introdusere en rekke vekstfaktorer og små molekyler for effektivt å generere definitiv endoderm, fremre foregut endoderm, og deretter lunge forfedre celler. Disse cellene er deretter innebygd i vekstfaktor redusert (GFR) -kjeller membran matrise medium, slik at de spontant kan utvikle seg til 3D lunge organoider som svar på eksterne vekstfaktorer. Disse hele lungeorganoidene (WLO) gjennomgår tidlige lungeutviklingsstadier, inkludert forgrening av morfogenese og modning etter eksponering for deksametason, syklisk AMP og isobutylxanthine. WLOer har epitelceller i luftveiene som uttrykker markørene KRT5 (basal), SCGB3A2 (klubb) og MUC5AC (beger) samt alveolar epitelceller som uttrykker HOPX (alveolar type I) og SP-C (alveolar type II). Mesenchymale celler er også til stede, inkludert glatt muskel actin (SMA), og blodplate-avledet vekstfaktor reseptor A (PDGFRα). iPSC-avledede WLOer kan opprettholdes under 3D-kulturforhold i mange måneder og kan sorteres for overflatemarkører for å rense en bestemt cellepopulasjon. iPSC-avledede WLOer kan også brukes til å studere menneskelig lungeutvikling, inkludert signalering mellom lungeepitelet og mesenchyme, for å modellere genetiske mutasjoner på menneskelig lungecellefunksjon og utvikling, og for å bestemme cytotoksisiteten til infektive midler.

24 timer etter plating, dag 1, iPSC bør være 50% -90% confluent. På dag 2 skal DE være 90%-95% confluent. Under DE-induksjon er det vanlig å observere betydelig celledød på dag 4, men vedlagte celler vil beholde en kompakt brosteinsmorfologi (figur 2b). Avslutt differensiering hvis flertallet av tilhengercellene løsner og vurderer å forkorte eksponeringen for DE-medier med aktivin A med 6-12 timer. Under AFE-induksjon er celledøden minimal, og cellene forblir tilhenger, men vil vir...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Artikkelen beskriver trinnvis rettet differensiering av induserte pluripotente stamceller til tredimensjonale hele lungeorganoider som inneholder både proksimale og distale epiteliale lungeceller sammen med mesenchyme.

Generering av 3D Hele lungeorganoider fra induserte pluripotente stamceller for modellering av lungeutviklingsbiologi og sykdom

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Denne protokollen bruker induserte pluripotente stamceller for å skille dem ut i lungeceller for å modellere menneskelig lungesykdom og utvikling i en tallerken. Denne protokollen er viktig fordi den er vanskelig å få tak i og kultur primær menneskelig lungevev. De viktigste fordelene ved å differensiere lungeceller fra pluripotente stamceller er å ha en konstant tilførsel av spesifikke lungeceller for å studere menneskelig lungeutvikling og sykdom.Disse cellene kan opprettholdes i cellekultur i lange perioder, kan kryopreserveres for fremtidige applikasjoner, og kan genetisk manipuleres for å studere genmutasjoner. Rachel McVicar, en stipendiat fra laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren. Før du starter eksperimentet, må du sakte tine en vekstfaktor redusert, eller GFR, kjellermembranmatrisemedium på is, og fortynne det i like mye kaldt DMEM F12.Plasser P1000-spissene i fryseren for å kjøle deg ned før bruk. Deretter belegges hver brønn av en 12 brønnplate med 500 mikroliter av 50% GFR kjellermembranmatrisemedium, og fjern overflødig middels blanding og bobler fra brønnene. Plasser brønnplatene på toppen av våtis eller kjøleskap ved fire grader Celsius for å stille inn i 20 minutter, og flytt deretter platen til 37 grader Celsius-inkubatoren over natten.Når høye PSE-er når 70% samløp, tilsett 10 mikromolar ROCK-hemmer Y27632 til menneskeskapte pluripotente stamceller, og vent en time før dissosiasjon. Aspirer media, og vask cellene en gang med PVS. Dissosier IPSC ved å legge til 500 mikroliter celleavløsningsmedium per brønn, og inkubere i 20 minutter ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidinkubator.Etter inkubasjonen legger du til 500 mikroliter stamcellepasseringsmedium per brønn. Pipetteceller forsiktig ved hjelp av en P1000-spiss for å oppnå en enkelt celleoppheng. Overfør deretter de dissosierte cellene til et 15 milliliterrør og sentrifuge i fem minutter ved 300 ganger G.Etter sentrifugering aspirerer du mediet og bruker cellepelleten på nytt med en milliliter mTeSR Plus-medier supplert med 10 mikromolar ROCK-hemmere.Etter å ha talt cellene, legg til to ganger 10 til femte IPSC til hver brønn av en 12 brønn GFR middels belagt plate, og inkuber over natten ved 37 grader Celsius. Neste dag aspirerer du mTeSR Plus før du legger til definitive endoderm- eller DE-induksjonsmedier. På dag to og tre endrer du DE-induksjonsmediet.På dag fire begynner AFE induksjon ved å erstatte DE induksjonsmedier med serumfritt basalmedium. Endre AFE medium daglig i tre dager før du analyserer AFE effektivitet på slutten av dag seks. På dag syv tiner du GFR kjellermembranmatrisemedium på is til senere bruk.Samtidig, fortsett med lungeforfedredercelledifferensiering ved å aspirere AFE-mediene og vaske brønnene med PVS. Tilsett en milliliter celleavløsningsløsning til brønnen og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Etter inkubasjon, tilsett en milliliter slukkemedier til brønnene som inneholder celleavløsningsløsning.Hold cellene som aggregater ved å pipette forsiktig opp og ned. Pass på at alle celler løsnes, men for å overføre dem til et 15 milliliter konisk rør for sentrifugering ved 300 ganger G i fem minutter. Fjern supernatant og resuspend cellepellet i LPC induksjonsmedier.Tell cellene, og tilsett 2,5 ganger 10 til de femte cellene til 100 mikroliter kalde GFR kjellermembranmatrisemedium, og bland godt. Plasser en dråpe i en brønn av en 12-brønns plate og inkuber på 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter. Deretter legger du til en milliliter LPC-medier per brønn, og sikrer at middels fall er helt nedsenket og inkuberer over natten ved 37 grader Celsius.På dag åtte, endre LPC medium for å fjerne ROCK inhibitor Y27632. Fortsett å endre media annenhver dag og analyser LPC-effektivitet på slutten av dag 16. På dag 17, vask brønner og tilsett 500 mikroliter av to mikrogram per milliliterdispase.Pipette dispaseblandingen med en P1000 pipette og inkubere i 15 minutter, rør deretter blandingen og inkuber i ytterligere 15 minutter. Etter inkubasjon legger du til en milliliter av slukkemediet til dispasen som inneholder brønner, og overfører cellene til koniske rør. Sentrifuger og resuspender pellet i en milliliter kjølt PVS, og gjenta deretter sentrifugeringen.Deretter resuspenderer pellet i en milliliter celleavløsningsmedium. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i 12 minutter, og legg deretter til et likt volum slukkemedier og sentrifuger igjen. Resuspend pellet i en milliliter slukking media og 10 micromolar ROCK inhibitor Y27632.Utfør et celleantall for å beregne volumet som trengs for å oppnå åtte ganger 10 til de fjerde cellene per brønn. Deretter aliquot nødvendig volum av LPC celle aggregater i 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør, og sentrifuge i fem minutter på 300 ganger G.Fjern overflødig supernatant uten agitating cellen pellet, forlater 10 mikroliter av gjenværende medier. Resuspend cellepellet i 200 mikroliter kaldt GFR kjellermembranmatrise medium og overfør cellene til cellekulturmembraninnlegg.Inkuber ved 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter. Etter inkubasjon, legg til en milliliter 3D organoid induksjonsmedium til basolateralt kammer av innsatsen, og erstatt den med friskt medium annenhver dag i seks dager. På dag 23 bytter du medium til 3D-forgreningsmedium, og deretter endrer du mediet annenhver dag i seks dager.På dag 29, bytt til 3D modningsmedium, og fortsett å erstatte mediet annenhver dag for de neste seks dagene. På dag fire av DE induksjon viser vedlagte celler en kompakt brosteinsmorfologi. De definitive endodermmarkørene CXCR4 og SOX17 overlagt med kjerner ble uttrykt, noe som bekrefter endodermal differensiering.Fremre foregut induksjon ble bekreftet på dag syv med morfologien som viser tettere komprimerte celler, og markørene FOXA2 og SOX2 overlaid med kjerner. Generasjonen av 3D lungeforfedrederceller ble bekreftet med 3D-sfæroider, og det endogene uttrykket for NKX2-1 GFP i en reportercellelinje. Etter en tre ukers differensiering i hele lungeorganoider ble lungemarkørene analysert av immunocytokjemi.Markører for forgrening av morfogenese SOX2 og SOX9 overlagt av kjerner ble observert i organoidene. Proksimale lungemarkører P63 og KRT5, begge markører av basale celler, ble vellykket oppdaget sammen med SCGB3A2, som er en markør for klubbceller. Distale lungemarkører induserte Pro SPC- og SPB-markører for Alveolar Type II-celler.Og HOPX-markører av Alveolar Type I-celler. I tillegg ble NKX2-1 og ZO1 uttrykt overlagt med kjerner. Mesenchyme lungecellemarkører PGFR Alpha, en markør for fibroblaster, uttrykt sammen med SOX9, representerte distalt mesenchyme.Vimentin ble også uttrykt og ble spredt over hele lungen. Etter denne prosedyren kan lungeorganoidene investeres med indusert pluripotent stamcelle avledet endotel og immunceller. Lungeutvikling og sykdom oppstår ved et signal mellom epitel- og mesenchymale cellepopulasjoner, men også fra endotelceller og makrofager.Et 3D-lungevevsmodellsystem er klinisk relevant for å studere menneskelig sykdom og terapeutiske behandlinger.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av indusert-pluripotente stamceller ved hjelp av fibroblast synoviocytter Isolert fra ledd av pasienter med revmatoid artritt

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra humane melanom Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induced pluripotent stamcelle Generation fra Blood Cells hjelp Sendai Virus og sentrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generasjon Integrerings--frie Utførte Pluripotent stamceller fra menneskelige perifere mononukleære blodceller Bruke episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsdannelse fra Cord Blood-avledede Induced Pluripotent Stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Delvis Lobular Hepatectomy: En kirurgisk modell for morfologiske leveren gjenfødelse

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptiske Microcircuit modellering med 3D Cocultures av astrocyttene og Neurons fra menneskelige Pluripotent stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserte omprogrammering av menneskelig primære fibroblaster til indusert Pluripotent stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon 3D huden Organoid fra ledningen blod-avledet indusert Pluripotent stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...