Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Это исследование было поддержано Калифорнийским институтом регенеративной медицины (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Этот протокол исследования был одобрен Советом по институциональному обзору Программы защиты исследований человека UCSD (181180).
1. Окончательная индукция энтодермы из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (День 1 - 3)
<ol><li>Медленно оттаивайте матричную среду с пон?...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

Успешная дифференциация 3D-органоидов целых легких (WLO) опирается на многоступенчатый 6-недельный протокол с вниманием к деталям, включая время воздействия факторов роста и малых молекул, клеточную плотность после прохождения и качество hiPSCs. Сведения об устранении неполадок см. в та...

Легкое является сложным, гетерогенным, динамическим органом, который развивается в шесть различных стадий - эмбриональное, псевдогландулярное, канальцевое, мешковидное, альвеолярное и микрососудистое созревание1,2. Последние две фазы происходят до и послеродово в развитии человека, в то время как первые четыре стадии происходят исключительно во время развития плода, если не происходят преждевременные роды3. Эмбриональная фаза начинается в эндодермальном зародышевом слое и завершается бутонизацией трахеи и почек легких. Развитие легких происходит частично через передачу сигналов между эпителиальными и мезенхимальными клетками4. Эти взаимодействия приводят к ветвлению легких, пролиферации, определению клеточной судьбы и клеточной дифференцировке развивающегося легкого. Легкое делится на проводящие зоны (трахея к терминальным бронхиолам) и дыхательные зоны (дыхательные бронхиолы к альвеолам). Каждая зона содержит уникальные типы эпителиальных клеток; включая базальные, секреторные, реснитчатые, щеточные, нейроэндокринные и ионоцитарные клетки в проводящих дыхательных путях5, за которыми следуют альвеолярные клетки I и II типа в респираторном эпителии6. Многое до сих пор неизвестно о развитии и реакции на повреждение различных типов клеток. Производные от iPSC модели органоидов легких позволяют изучать механизмы, которые управляют развитием легких человека, влияние генетических мутаций на легочную функцию и реакцию эпителия и мезенхимы на инфекционные агенты без необходимости первичной легочной ткани человека.
Маркеры, соответствующие различным стадиям эмбриональной дифференцировки, включают CXCR4, cKit, FOXA2 и SOX17 для окончательной энтодермы (DE)7, FOXA2, TBX1 и SOX2 для передней эндодермы передней части (AFE)8 и NKX2-1 для ранних клеток-предшественников легких9. При эмбриональном развитии легких передняя кишка делится на дорсальный пищевод и вентральную трахею. Почки правого и левого легких выглядят как два независимых выхода вокруг почка трахеи10. Во время ветвящегося морфогенеза мезенхима, окружающая эпителий, производит эластичную ткань, гладкую мускулатуру, хрящи и сосудистую систему11. Взаимодействие между эпителием и мезенхимой имеет важное значение для нормального развития легких. Это включает в себя секрецию FGF1012 мезенхимой и SHH13 , производимую эпителием.
Здесь мы описываем протокол направленной дифференциации hiPSCs в трехмерные (3D) целые органоиды легких (WLO). Хотя существуют аналогичные подходы, которые включают выделение клеток-предшественников легких путем сортировки на стадии LPC для получения альвеолярных органоидов14,15 (дистальных) органоидов или органоидов дыхательных путей16 (проксимальных) или генерируют вентрально-передние сфероиды передней скаты, чтобы сделать органоиды легких человека, экспрессирующие альвеолярные клетки и мезенхимальные маркеры и органоиды предшественников почек17 , сила этого метода заключается в включении как эпителиальных, так и мезенхимальных типов клеток легких для моделирования и оркестрации морфогенеза, созревания и расширения легких in vitro.
Этот протокол использует малые молекулы и факторы роста для направления дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток через окончательную энтодерму, переднюю эндодерму передней части и клетки-предшественники легких. Эти клетки затем индуцируются в 3D-органоиды целых легких через важные этапы развития, включая ветвление и созревание. Резюме протокола дифференцировки показано на рисунке 1а с репрезентативными изображениями яркого поля эндодермальной и органоидной дифференцировки, показанными на рисунке 1b. На рисунке 1c,d показаны детали экспрессии генов эндодермальной дифференцировки, а также экспрессия генов как проксимальной, так и дистальной популяций эпителиальных клеток легких после завершения дифференцировки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Развитие и заболевания легких человека было трудно изучать из-за отсутствия биологически значимых модельных систем in vitro . Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) могут быть дифференцированы поэтапно в 3D-многоклеточные органоиды легких, состоящие как из эпителиальных, так и из мезенхимальных клеточных популяций. Мы резюмируем эмбриональные сигналы развития, временно вводя различные факторы роста и небольшие молекулы для эффективной генерации окончательной энтодермы, передней передней энтодермы передней части и впоследствии клеток-предшественников легких. Эти клетки затем внедряются в матричную среду с пониженным фактором роста (СКФ), что позволяет им спонтанно развиваться в 3D-органоиды легких в ответ на внешние факторы роста. Эти целые легкие органоиды (WLO) проходят ранние стадии развития легких, включая ветвящийся морфогенез и созревание после воздействия дексаметазона, циклического AMP и изобутилксантина. VLO обладают эпителиальными клетками дыхательных путей, экспрессирующими маркеры KRT5 (базальный), SCGB3A2 (клубный) и MUC5AC (кубок), а также альвеолярными эпителиальными клетками, экспрессирующими HOPX (альвеолярный тип I) и SP-C (альвеолярный тип II). Мезенхимальные клетки также присутствуют, включая актин гладких мышц (СМА) и рецептор фактора роста А,, полученный из тромбоцитов (PDGFRα). Полученные из iPSC VLO могут поддерживаться в условиях 3D-культуры в течение многих месяцев и могут быть отсортированы для поверхностных маркеров для очистки определенной клеточной популяции. Полученные из iPSC WLO также могут быть использованы для изучения развития легких человека, включая передачу сигналов между эпителием легких и мезенхимой, для моделирования генетических мутаций функции и развития клеток легких человека и для определения цитотоксичности инфекционных агентов.

Через 24 часа после нанесения покрытия, день 1, иПСК должны быть на 50%-90% сливающимися. На 2 день ДЭ должен быть 90%-95% сливающимся. Во время индукции DE обычно наблюдается значительная гибель клеток на 4-й день, но прикрепленные клетки сохраняют компактную морфологию булыжника (рису...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

В статье описана пошаговая направленная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в трехмерные цельные органоиды легких, содержащие как проксимальные, так и дистальные эпителиальные клетки легких вместе с мезенхимой.

Генерация 3D-органоидов цельных легких из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для моделирования биологии и болезней развития легких

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Этот протокол использует индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для дифференцировки их в клетки легких, чтобы смоделировать заболевание легких человека и развитие в чашке. Этот протокол важен, потому что трудно получить и культивировать первичную легочную ткань человека. Основными преимуществами дифференцировки клеток легких от плюрипотентных стволовых клеток является постоянный запас специфических клеток легких для изучения развития легких и заболеваний человека.Эти клетки могут поддерживаться в клеточной культуре в течение длительных периодов времени, могут быть криоконсервированы для будущих применений и могут быть генетически изменены для изучения генных мутаций. Продемонстрировать процедуру будет Рэйчел МакВикар, кандидат наук из моей лаборатории. Перед началом эксперимента медленно разморозьте пониженный фактор роста, или СКФ, матричную среду базальной мембраны на льду и разбавьте ее в равном объеме холодного DMEM F12.Поместите наконечники P1000 в морозильную камеру для охлаждения перед использованием. Затем покройте каждую скважину из 12 луночных плит 500 микролитрами 50% матричной среды базальной мембраны СКФ и удалите любую избыточную смесь среды и пузырьки из скважин. Поместите плиты колодца поверх влажного льда или холодильника при четырех градусах Цельсия, чтобы установить на 20 минут, затем переместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь.Когда высокие PSE достигают 70% конфлюентности, добавьте 10 микромолярного ингибитора ROCK Y27632 к плюрипотентным стволовым клеткам, индуцированным человеком, и подождите час до диссоциации. Аспирируйте среду и промывайте клетки один раз с помощью PVS. Диссоциируют IPSC, добавляя 500 микролитров среды отслоения клеток на лунку, и инкубируют в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе диоксида углерода 5%.После инкубации добавляют 500 микролитров среды для прохождения стволовых клеток на лунку. Аккуратно пипетку клеток с помощью наконечника P1000 для получения одноклеточной суспензии. Затем переместите диссоциированные клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу в течение пяти минут в 300 раз больше G. После центрифугирования аспирируют среду и повторно суспендируют клеточную гранулу одним миллилитром среды mTeSR Plus, дополненной 10 микромолярным ингибитором ROCK.После подсчета клеток добавьте два раза по 10 к пятому IPSC в каждую лунку из 12 лунок GFR со средним покрытием и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. На следующий день аспирируйте mTeSR Plus перед добавлением окончательной энтодермы, или DE, индукционной среды. На второй и третий дни измените индукционную среду DE.На четвертый день начните индукцию AFE, заменив индукционную среду DE базальной средой без сыворотки. Меняйте среднюю AFE ежедневно в течение трех дней, прежде чем анализировать эффективность AFE в конце шестого дня. На седьмой день разморозьте матричную среду базальной мембраны СКФ на льду для последующего использования.Одновременно приступают к дифференцировке клеток-предшественников легких путем аспирации среды AFE и промывки колодцев PVS. Добавить в лунку один миллилитр раствора для отслоения клеток и инкубировать в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации добавляют один миллилитр закалочной среды в скважину, содержащую раствор для отслоения клеток.Храните ячейки в виде агрегатов, осторожно пипетируя вверх и вниз. Убедитесь, что все клетки смещены, но для переноса их в 15-миллилитровую коническую трубку для центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в индукционной среде LPC.Подсчитайте клетки и добавьте 2,5 раза по 10 к пятой клетке до 100 микролитров холодной субамбулаторной мембранной матричной среды СКФ и хорошо перемешайте. Поместите каплю в лунку из 12-луночной пластины и высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение 30-60 минут. Затем добавьте один миллилитр среды LPC на скважину, гарантируя, что капля среды полностью погружена и инкубируется в течение ночи при 37 градусах Цельсия.На восьмой день измените среду LPC, чтобы удалить ингибитор ROCK Y27632. Продолжайте менять медиа через день и анализируйте эффективность LPC в конце 16-го дня. На 17 день промыть колодцы и добавить 500 микролитров по два микрограмма на миллилитр диспазу.Пипетку рассеивают смесью с пипеткой P1000 и инкубируют в течение 15 минут, затем пипетку смеси и инкубируют еще 15 минут. После инкубации добавляют один миллилитр закалочной среды к диспазе, содержащей колодцы, и переносят клетки в конические трубки. Центрифугируют и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре охлажденного ПВС, затем повторяют центрифугирование.Затем повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре среды отслоения клеток. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение 12 минут, затем добавьте равный объем закалочной среды и центрифугу снова. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре закалочной среды и 10 микромолярной ингибиторе ROCK Y27632.Выполните подсчет ячеек, чтобы рассчитать объем, необходимый для получения восьми раз 10 до четвертой ячейки на лунку. Затем аликвота необходимого объема клеточных агрегатов LPC в 1,5 миллилитра микроцентрифужных трубок и центрифуги в течение пяти минут в 300 раз больше G. Удаляют избыток супернатанта без перемешивания ячейки гранулы, оставляя 10 микролитров остаточной среды. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 200 микролитрах холодной матричной среды базальной мембраны СКФ и переносят клетки на мембранные вставки клеточной культуры.Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 минут. После инкубации добавьте один миллилитр 3D органоидной индукционной среды в базолатеральную камеру вкладыша и заменяйте ее свежей средой через день в течение шести дней. На 23-й день переключите среду на 3D-среду ветвления, затем меняйте среду через день в течение шести дней.На 29-й день перейдите на 3D-среду созревания и продолжайте заменять среду через день в течение следующих шести дней. На четвертый день индукции DE присоединенные клетки демонстрируют компактную морфологию булыжника. Были экспрессированы окончательные маркеры энтодермы CXCR4 и SOX17, наложенные ядрами, что подтверждает энтодермальную дифференцировку.Индукция передней кишки была подтверждена на седьмой день с морфологией, показывающей более плотно уплотненные клетки, а маркеры FOXA2 и SOX2 наложены ядрами. Генерация 3D-клеток-предшественников легких была подтверждена 3D-сфероидами, а эндогенная экспрессия NKX2-1 GFP в репортерной клеточной линии. После трехнедельной дифференцировки в цельные леговидные органоиды маркеры легких анализировали методом иммуноцитохимии.Маркеры ветвящегося морфогенеза SOX2 и SOX9, наложенные ядрами, наблюдались в органоидах. Проксимальные маркеры легких P63 и KRT5, оба маркера базальных клеток, были успешно обнаружены вместе с SCGB3A2, который является маркером для клубных клеток. Дистальные легочные маркеры индуцировали маркеры Pro SPC и SPB для альвеолярных клеток типа II.И маркеры HOPX альвеолярных клеток I типа. Кроме того, NKX2-1 и ZO1 были экспрессированы наложенными ядрами. Маркеры клеток мезенхимы легких PGFR Alpha, маркер фибробластов, экспрессируемые совместно с SOX9, представляли собой дистальный мезенхим.Виментин также экспрессировался и рассеивался по всему легкому. После этой процедуры органоиды легких могут быть инвестированы с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, полученными из эндотелиальных и иммунных клеток. Развитие легких и заболевание происходит путем передачи сигналов между популяциями эпителиальных и мезенхимальных клеток, а также эндотелиальными клетками и макрофагами.3D-система моделирования легочной ткани клинически актуальна для изучения заболеваний человека и терапии.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от меланомы человека Опухоль-инфильтрации лимфоцитами

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Индуцированные плюрипотентные поколение стволовых клеток из клеток крови с помощью вируса Сендай и центрифугирование

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Генерация интеграции свободных индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови с помощью эписомальные векторы

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Хондрогенное образование гранул из индуцированных пуповинной клеткой флуоресцентных стволовых клеток

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Частичной гепатектомии лобулярного: Хирургические модель для морфологической регенерации печени

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Моделирование синаптических микросхемы с 3D Cocultures астроциты и нейроны от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

На базе РНК перепрограммирование первичной фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...