Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Este protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Programa de Protecciones de Investigación Humana de UCSD (181180).
1. Inducción definitiva del endodermo a partir de células madre pluripotentes inducidas (Día 1 - 3)
<ol><li>Descongele lentamente el medio de matriz de membrana basal reducida (GFR) sobre hielo 30 minutos antes de su uso. En dmEM/F12 frío, mezclar, diluir el medio de matriz BM GFR 1:1 de tal manera que constituya el 50% de este medio. Colo...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. 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B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

La diferenciación exitosa de organoides pulmonares enteros (WLO) en 3D se basa en un protocolo de 6 semanas de varios pasos con atención al detalle, incluido el tiempo de exposición a factores de crecimiento y moléculas pequeñas, densidad celular después del pasaje y la calidad de las hiPSC. Para solucionar problemas, consulte la Tabla 2. Las hiPSC deben ser aproximadamente 70%-80% confluentes, con menos del 5% de diferenciación espontánea antes de la disociación. Este protocolo requiere el medi...

El pulmón es un órgano complicado, heterogéneo y dinámico que se desarrolla en seis estadios distintos: maduración embrionaria, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar y microvascular1,2. Las dos últimas fases ocurren pre y postnatalmente en el desarrollo humano, mientras que las primeras cuatro etapas ocurren exclusivamente durante el desarrollo fetal, a menos que ocurra el parto prematuro3. La fase embrionaria comienza en la capa germinal endodérmica y concluye con la brotación de la tráquea y las yemas pulmonares. El desarrollo pulmonar ocurre en parte a través de la señalización entre las células epiteliales y mesenquimales4. Estas interacciones dan como resultado la ramificación pulmonar, la proliferación, la determinación del destino celular y la diferenciación celular del pulmón en desarrollo. El pulmón se divide en zonas conductoras (tráquea a los bronquiolos terminales) y zonas respiratorias (bronquiolos respiratorios a los alvéolos). Cada zona contiene tipos únicos de células epiteliales; incluyendo células basales, secretoras, ciliadas, de cepillo, neuroendocrinas e ionocitos en la vía aérea conductora5, seguidas de células alveolares tipo I y II en el epitelio respiratorio6. Todavía se desconoce mucho sobre el desarrollo y la respuesta a la lesión de los diversos tipos de células. Los modelos organoides pulmonares derivados de iPSC permiten el estudio de los mecanismos que impulsan el desarrollo pulmonar humano, los efectos de las mutaciones genéticas en la función pulmonar y la respuesta tanto del epitelio como del mesénquima a los agentes infecciosos sin la necesidad de tejido pulmonar humano primario.
Los marcadores correspondientes a las diversas etapas de la diferenciación embrionaria incluyen CXCR4, cKit, FOXA2 y SOX17 para el endodermo definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 y SOX2 para el endodermo del intestino anterior (AFE)8, y NKX2-1 para las células progenitoras pulmonares tempranas9. En el desarrollo pulmonar embrionario, el intestino anterior se divide en el esófago dorsal y la tráquea ventral. Las yemas de los pulmones derecho e izquierdo aparecen como dos bolsas externas independientes alrededor de la yema traqueal10. Durante la morfogénesis ramificada, el mesénquima que rodea el epitelio produce tejido elástico, músculo liso, cartílago y vasculatura11. La interacción entre el epitelio y el mesénquima es esencial para el desarrollo pulmonar normal. Esto incluye la secreción de FGF1012 por el mesénquima y SHH13 producida por el epitelio.
Aquí, describimos un protocolo para la diferenciación dirigida de hiPSCs en organoides pulmonares enteros tridimensionales (3D) (WLO). Si bien existen enfoques similares que incorporan el aislamiento de células progenitoras pulmonares a través de la clasificación en la etapa LPC para hacer organoides similares a los alveolares14,15 (distales) u organoides de las vías respiratorias16 (proximales), o generar esferoides del intestino anterior ventral-anterior para hacer organoides pulmonares humanos que expresan marcadores de células alveolares y mesenquimales y organoides progenitores de punta de yema17 , la fuerza de este método es la inclusión de los tipos de células epiteliales y mesenquimales pulmonares para modelar y orquestar la morfogénesis, maduración y expansión de la ramificación pulmonar in vitro.
Este protocolo utiliza moléculas pequeñas y factores de crecimiento para dirigir la diferenciación de las células madre pluripotentes a través del endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y las células progenitoras pulmonares. Estas células se inducen a organoides pulmonares enteros en 3D a través de importantes pasos de desarrollo, incluida la ramificación y la maduración. El resumen del protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1a con imágenes representativas de campo brillante de diferenciación endodérmica y organoide que se muestran en la Figura 1b. La Figura 1c,d muestra los detalles de la expresión génica de la diferenciación endodérmica, así como la expresión génica de las poblaciones proximal y distal de las células epiteliales pulmonares después de completar la diferenciación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

El desarrollo y la enfermedad pulmonar humana han sido difíciles de estudiar debido a la falta de sistemas modelo in vitro biológicamente relevantes. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar paso a paso en organoides pulmonares multicelulares 3D, formados por poblaciones de células epiteliales y mesenquimales. Recapitulamos las señales del desarrollo embrionario introduciendo temporalmente una variedad de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para generar eficientemente el endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y, posteriormente, las células progenitoras pulmonares. Estas células se incrustan en el medio de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento (GFR), lo que les permite desarrollarse espontáneamente en organoides pulmonares 3D en respuesta a factores de crecimiento externos. Estos organoides pulmonares completos (WLO) se someten a etapas tempranas del desarrollo pulmonar, incluida la morfogénesis ramificada y la maduración después de la exposición a dexametasona, AMP cíclico e isobutilxantina. Los WLO poseen células epiteliales de las vías respiratorias que expresan los marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) y MUC5AC (cáliz), así como células epiteliales alveolares que expresan HOPX (alveolar tipo I) y SP-C (alveolar tipo II). Las células mesenquimales también están presentes, incluida la actina del músculo liso (AME) y el receptor A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα). Los WLO derivados de iPSC se pueden mantener en condiciones de cultivo 3D durante muchos meses y se pueden clasificar para marcadores de superficie para purificar una población celular específica. Los WLO derivados de iPSC también se pueden utilizar para estudiar el desarrollo pulmonar humano, incluida la señalización entre el epitelio pulmonar y el mesénquima, para modelar mutaciones genéticas en la función y el desarrollo de las células pulmonares humanas, y para determinar la citotoxicidad de los agentes infecciosos.

24 horas después del emplatado, día 1, las iPSC deben ser 50% -90% confluentes. En el día 2, el DE debe ser 90%-95% confluente. Durante la inducción de DE, es común observar una muerte celular significativa en el día 4, pero las células unidas conservarán una morfología de adoquines compacta (Figura 2b). Suspenda la diferenciación si la mayoría de las células adherentes se desprenden y considera acortar la exposición a los medios DE con activina A en 6-12 h. Durante la inducció...

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Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

El artículo describe la diferenciación dirigida paso a paso de células madre pluripotentes inducidas a organoides pulmonares enteros tridimensionales que contienen células pulmonares epiteliales proximales y distales junto con mesénquima.

Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Este protocolo utiliza células madre pluripotentes inducidas para diferenciarlas en células pulmonares con el fin de modelar la enfermedad pulmonar humana y el desarrollo en un plato. Este protocolo es significativo porque es difícil obtener y cultivar tejido pulmonar humano primario. Las principales ventajas de diferenciar las células pulmonares de las células madre pluripotentes es tener un suministro constante de células pulmonares específicas para estudiar el desarrollo y la enfermedad pulmonar humana.Estas células se pueden mantener en cultivo celular durante largos períodos de tiempo, se pueden criopreservar para aplicaciones futuras y se pueden manipular genéticamente para estudiar mutaciones genéticas. Demostrando el procedimiento estará Rachel McVicar, una candidata a doctorado de mi laboratorio. Antes de comenzar el experimento, descongele lentamente un medio de matriz de membrana basal reducido de factor de crecimiento, o GFR, en hielo, y diluirlo en un volumen igual de DMEM F12 frío.Coloque las puntas P1000 en el congelador para enfriar antes de usar. A continuación, cubra cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 microlitros del medio de matriz de membrana basal 50% GFR, y elimine cualquier exceso de mezcla media y burbujas de los pozos. Coloque las placas del pozo sobre hielo húmedo o un refrigerador a cuatro grados Celsius para que se fije durante 20 minutos, luego mueva la placa a la incubadora de 37 grados Celsius durante la noche.Cuando los PSE altos alcancen el 70% de confluencia, agregue 10 inhibidores micromolares de ROCK Y27632 a las células madre pluripotentes inducidas por humanos y espere una hora antes de la disociación. Aspire los medios y lave las células una vez con PVS. Disociar las IPSC agregando 500 microlitros de medio de desprendimiento celular por pozo, e incubar durante 20 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.Después de la incubación, agregue 500 microlitros de medio de paso de células madre por pozo. Pipete suavemente las celdas usando una punta P1000 para obtener una suspensión de una sola celda. Luego transfiera las células disociadas a un tubo de 15 mililitros y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G.Después de la centrifugación, aspire el medio y resuspenda el pellet celular con un mililitro de medios mTeSR Plus complementado con un inhibidor de ROCK micromolar de 10.Después de contar las células, agregue dos veces 10 a las quintas IPSC a cada pocillo de una placa recubierta de medio GFR de 12 pocillos, e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, aspire el mTeSR Plus antes de agregar medios de inducción endodermo definitivos, o DE. En los días dos y tres, cambie los medios de inducción DE.En el cuarto día, comience la inducción de AFE reemplazando los medios de inducción de DE con medio basal sin suero. Cambie el medio AFE diariamente durante tres días antes de analizar la eficiencia de AFE al final del sexto día. En el séptimo día, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo para su uso posterior.Simultáneamente, proceda con la diferenciación de células progenitoras pulmonares aspirando los medios AFE y lavando los pozos con PVS. Agregue un mililitro de solución de desprendimiento celular al pozo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue un mililitro de medios de enfriamiento a los pozos que contienen la solución de desprendimiento celular.Mantenga las celdas como agregados canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Asegúrese de que todas las células estén desalojadas, pero para transferirlas a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación a 300 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en medios de inducción LPC.Cuente las células y agregue 2.5 veces 10 a las quintas células a 100 microlitros de medio de matriz de membrana basal de GFR fría y mezcle bien. Coloque una gota en un pozo de una placa de 12 pocillos e incube a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. A continuación, agregue un mililitro de medios LPC por pozo, asegurándose de que la gota media esté completamente sumergida e incube durante la noche a 37 grados centígrados.En el octavo día, cambie el medio LPC para eliminar el inhibidor de ROCK Y27632. Siga cambiando los medios cada dos días y analice la eficiencia de LPC al final del día 16. El día 17, lave los pozos y agregue 500 microlitros de dos microgramos por mililitro de dispasa.Pipetear la mezcla dispase con una pipeta P1000 e incubar durante 15 minutos, luego pipetear la mezcla e incubar durante otros 15 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro del medio de enfriamiento a los pocillos que contienen dispasa y transfiera las células a tubos cónicos. Centrifugar y volver a suspender el pellet en un mililitro de PVS refrigerado, luego repetir la centrifugación.Luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de desprendimiento celular. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 12 minutos, luego agregar un volumen igual de medios de enfriamiento y centrifugar nuevamente. Resuspend el pellet en un mililitro de medios de enfriamiento y 10 micromolares inhibidor de ROCK Y27632.Realice un recuento de células para calcular el volumen necesario para obtener ocho veces 10 a la cuarta celda por pozo. Luego, la alícuota requirió el volumen de agregados de células lpC en tubos de micro centrífuga de 1.5 mililitros, y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G.Retire el exceso de sobrenadante sin agitar el gránulo celular, dejando 10 microlitros de medios residuales. Resuspend el pellet celular en 200 microlitros de medio de matriz de membrana basal GFR frío y transfiera las células a insertos de membrana de cultivo celular.Incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de medio de inducción organoide 3D a la cámara basolateral del inserto y reemplácelo con medio fresco cada dos días durante seis días. El día 23, cambie el medio a un medio de ramificación 3D, luego cambie el medio cada dos días durante seis días.El día 29, cambie al medio de maduración 3D y continúe reemplazando el medio cada dos días durante los próximos seis días. En el cuarto día de inducción de DE, las células adheridas muestran una morfología de adoquines compacta. Se expresaron los marcadores endodermos definitivos CXCR4 y SOX17 superpuestos con núcleos, confirmando la diferenciación endodérmica.La inducción del intestino anterior se confirmó en el séptimo día con la morfología mostrando células más compactas, y los marcadores FOXA2 y SOX2 superpuestos con núcleos. La generación de células progenitoras pulmonares 3D se confirmó con esferoides 3D y la expresión endógena de NKX2-1 GFP en una línea celular reportera. Después de una diferenciación de tres semanas en organoides pulmonares enteros, los marcadores pulmonares se analizaron mediante inmunocitoquímica.Se observaron marcadores de morfogénesis ramificada SOX2 y SOX9 superpuestos por núcleos en los organoides. Los marcadores pulmonares proximales P63 y KRT5, ambos marcadores de células basales, se detectaron con éxito junto con SCGB3A2, que es un marcador para las células club. Los marcadores pulmonares distales indujeron marcadores Pro SPC y SPB para células alveolares tipo II.Y marcadores HOPX de células alveolares tipo I. Además, NKX2-1 y ZO1 se expresaron superpuestos con núcleos. Los marcadores de células pulmonares mesénquimas PGFR Alfa, un marcador para fibroblastos, coexpresado con SOX9, representaban el mesénquima distal.También se expresó vimentina y se dispersó por todo el pulmón. Después de este procedimiento, los organoides pulmonares se pueden invertir con células madre pluripotentes inducidas derivadas de células madre endoteliales e inmunes. El desarrollo pulmonar y la enfermedad se producen por una señalización entre las poblaciones de células epiteliales y mesenquimales, pero también de las células endoteliales y los macrófagos.Un sistema modelo de tejido pulmonar en 3D es clínicamente relevante para estudiar enfermedades humanas y terapéuticas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generación de células madre pluripotentes inducidas por el Uso de sinoviocitos similares a fibroblastos aislados de las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomía parcial lobulado: Un modelo quirúrgico para regeneración hepática morfológico

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...