Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Denna forskning stöddes av California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Detta studieprotokoll godkändes av Institutional Review Board för UCSD:s human research protections program (181180).
1. Definitiv endoderminduktion från inducerade pluripotenta stamceller (dag 1 - 3)
<ol><li>Tina långsamt tillväxtfaktor reducerat (GFR)-källarmembran (BM) matrismedium på is 30 minuter före användning. Vid kall DMEM/F12, späd GFR BM matrismedium 1:1 så att det utgör 50% av detta medium. Placera P1000 pipettspetsar i frysen för att kyla före användning.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

Den framgångsrika differentieringen av 3D hela lungorganoider (WLO) förlitar sig på ett 6-veckors protokoll i flera steg med uppmärksamhet på detaljer, inklusive tid för exponering för tillväxtfaktorer och små molekyler, cellulär densitet efter passaging och kvaliteten på hiPSCs. Felsökning finns i tabell 2. hiPSCs bör vara cirka 70-80% confluent, med mindre än 5% spontan differentiering före dissociation. Detta protokoll kräver "mTeSR plus" medium; Emellertid, vanliga "mTeSR" medium har ...

Lungan är ett komplicerat, heterogent, dynamiskt organ som utvecklas i sex distinkta stadier - embryonala, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar och mikrovaskulära mognad1,2. De två senare faserna förekommer pre och postnatally i mänsklig utveckling medan de första fyra stadierna inträffar uteslutande under fetala utveckling om inte prematur födsel inträffar3. Den embryonala fasen börjar i det endodermala bakterieskiktet och avslutas med att luftstrupen och lungknopparna spirar. Lungutveckling sker delvis via signalering mellan epitelial och mesenkymala celler4. Dessa interaktioner resulterar i lung förgrening, spridning, cellulär ödebestämning och cellulär differentiering av den utvecklande lungan. Lungan är indelad i ledande zoner (luftstrupe till de terminala bronkiolerna) och andningszoner (respiratoriska bronkioler till alveolerna). Varje zon innehåller unika epitelcelltyper. inklusive basala, sekretoriska, ciliated, borste, neuroendokrina och jonocytceller i den ledande luftvägarna5, följt av alveolar typ I och II celler i luftvägarna epitel6. Mycket är fortfarande okänt om utvecklingen och svaret på skador av de olika celltyperna. iPSC härledda lungorganoidmodeller möjliggör studier av mekanismer som driver mänsklig lungutveckling, effekterna av genetiska mutationer på lungfunktionen och svaret från både epitel och mesenkime på smittämnen utan behov av primär mänsklig lungvävnad.
Markörer som motsvarar de olika stadierna av embryonal differentiering inkluderar CXCR4, cKit, FOXA2 och SOX17 för slutgiltig endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 och SOX2 för främre foregut endoderm (AFE)8 och NKX2-1 för tidiga lungprogenitorceller9. I embryonal lungutveckling delar foreguten in i dorsala matstrupen och ventrala luftstrupen. Knopparna i höger och vänster lungor visas som två oberoende utpouchings runt trakeal knopp10. Under förgrening morphogenesis producerar mesenkymen som omger epitelet elastisk vävnad, glatt muskel, brosk och vaskulatur11. Interaktionen mellan epitel och mesenchyme är avgörande för normal lungutveckling. Detta inkluderar utsöndringen av FGF1012 av mesenchymen och SHH13 som produceras av epitelet.
Här beskriver vi ett protokoll för riktad differentiering av hiPSCs till tredimensionella (3D) hela lungorganoider (WLO). Medan det finns liknande metoder som införlivar isolering av lungprogenitorceller via sortering på LPC-stadiet för att göra alveolarliknande 14,15 (distala) organoider eller luftvägsceller16 (proximala) organoider, eller generera ventral-främre foregut-sfäroider för att göra mänskliga lungorganoider som uttrycker alveolarcell- och mesenkymala markörer och knoppspetsprogenitororganoider17 , styrkan i denna metod är införandet av både lung epitelial och mesenchymal celltyper att mönster och orkestrera lunggrenande morfogogenes, mognad och expansion in vitro.
Detta protokoll använder små molekyler och tillväxtfaktorer för att styra differentiering av pluripotenta stamceller genom slutgiltig endoderm, främre foregut endoderm och lung stamceller. Dessa celler induceras sedan till 3D hela lungorganoider genom viktiga utvecklingssteg, inklusive förgrening och mognad. Sammanfattningen av differentieringsprotokollet visas i figur 1a med representativa brightfieldbilder av endodermal och organoid differentiering som visas i figur 1b. Figur 1c,d visar genuttryck detaljer om endodermal differentiering samt genuttryck av både proximala och distala populationer av lung epitelial celler efter avslutad differentiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Mänsklig lungutveckling och sjukdom har varit svår att studera på grund av bristen på biologiskt relevanta in vitro-modellsystem . Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) kan differentieras stegvis i 3D multicellulära lungorganoider, gjorda av både epitelial och mesenchymala cellpopulationer. Vi rekapitulerar embryonala utvecklingsmässiga ledtrådar genom att tidsmässigt införa en mängd olika tillväxtfaktorer och små molekyler för att effektivt generera slutgiltig endoderm, främre foregut endoderm och därefter lung stamceller. Dessa celler är sedan inbäddade i tillväxtfaktor reducerad (GFR)-källare membranmatris medium, så att de spontant kan utvecklas till 3D lungorganoider som svar på externa tillväxtfaktorer. Dessa hela lungorganoider (WLO) genomgår tidiga lungutvecklingsstadier inklusive förgrening av morfenes och mognad efter exponering för dexametason, cyklisk AMP och isobutylxanthine. WLOs har luftvägsepitetelceller som uttrycker markörerna KRT5 (basal), SCGB3A2 (klubba) och MUC5AC (bägare) samt alveolar epitelceller som uttrycker HOPX (alveolar typ I) och SP-C (alveolar typ II). Mesenkymala celler finns också, inklusive glatt muskelaktin (SMA) och trombocyt-härledda tillväxtfaktorreceptor A (PDGFRα). iPSC-härledda WLOs kan bibehållas under 3D-odlingsförhållanden i många månader och kan sorteras för ytmarkörer för att rena en viss cellpopulation. iPSC härledda WLOs kan också användas för att studera mänsklig lungutveckling, inklusive signalering mellan lungepitelet och mesenkym, för att modellera genetiska mutationer på människans lungcellsfunktion och utveckling och för att bestämma cytotoxiciteten hos smittsamma medel.

24 timmar efter plätering, dag 1, bör iPSCs vara 50%-90% confluent. På dag 2 bör DE vara 90%-95% sammanflöde. Under DE-induktion är det vanligt att observera betydande celldöd på dag 4 men bifogade celler kommer att behålla en kompakt kullerstensmorfologi (figur 2b). Avbryt differentiering om majoriteten av vidhäftande celler lossnar och överväger att förkorta exponeringen för DE-media med aktivin A med 6-12 h. Under AFE-induktion är celldöden minimal, och cellerna förblir v...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Artikeln beskriver steg klokt riktade differentiering av inducerade pluripotenta stamceller till tredimensionella hela lung organoider som innehåller både proximal och distala epitelial lungceller tillsammans med mesenchyme.

Generation av 3D Hela Lungorganoider från inducerade pluripotenta stamceller för modellering av lungutvecklingsbiologi och sjukdom

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Detta protokoll använder inducerade pluripotenta stamceller för att differentiera dem i lungceller för att modellera mänsklig lungsjukdom och utveckling i en maträtt. Detta protokoll är viktigt eftersom det är svårt att få och odla primär mänsklig lungvävnad. De främsta fördelarna med att skilja lungceller från pluripotenta stamceller är att ha en konstant tillförsel av specifika lungceller för att studera mänsklig lungutveckling och sjukdom.Dessa celler kan upprätthållas i cellodling under långa tidsperioder, kan kryopreserveras för framtida tillämpningar och kan genetiskt manipuleras för att studera genmutationer. Rachel McVicar, doktorand från mitt laboratorium, visar proceduren. Innan experimentet påbörjas tinar du långsamt upp en reducerad tillväxtfaktor, eller GFR, källarmembranmatrismedium på is och späd det i lika stor mängd kall DMEM F12.Placera P1000-spetsarna i frysen för att kyla före användning. Täck sedan varje brunn på en 12 brunnsplatta med 500 mikroliter av 50% GFR-källarmembranmatrismediet och ta bort eventuell överskott av mediumblandning och bubblor från brunnarna. Placera brunnsplattorna ovanpå våt is eller ett kylskåp vid fyra grader Celsius för att ställa in i 20 minuter och flytta sedan plattan till 37 grader Celsius inkubator över natten.När höga PSEs når 70% confluency, tillsätt 10 mikromolar ROCK-hämmare Y27632 till humanduced pluripotenta stamceller och vänta en timme före dissociation. Aspirera på mediet och tvätta cellerna en gång med PVS. Dissociera IPSCs genom att tillsätta 500 mikroliter av cellavlossningsmedel per brunn och inkubera i 20 minuter vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidinkubator.Efter inkubationen tillsätt 500 mikroliter stamcellspassat per brunn. Pipettera försiktigt celler med en P1000-spets för att få en enda cellupphängning. Överför sedan de dissocierade cellerna till ett 15 ml-rör och centrifug i fem minuter vid 300 gånger G.Följande centrifugering, aspirera på mediet och återanvända cellpelleten med en milliliter mTeSR Plus-media kompletterat med 10 mikromolar ROCK-hämmare.Efter att ha räknat cellerna, tillsätt två gånger 10 till de femte IPSCs till varje brunn på en 12 väl GFR mediumbelagd platta och inkubera över natten vid 37 grader Celsius. Nästa dag, aspirera mTeSR Plus innan du lägger till slutgiltig endoderm, eller DE, induktionsmedier. På dag två och tre, byt DE-induktionsmediet.På dag fyra, börja AFE induktion genom att ersätta DE induktionsmedier med serumfritt basalt medium. Byt AFE-medium dagligen i tre dagar innan du analyserar AFE-effektiviteten i slutet av dag sex. På dag sju tinar GFR källarmembranmatrismedium på is för senare användning.Fortsätt samtidigt med lungprogenitorcelldifferentiering genom att aspirera AFE-media och tvätta brunnarna med PVS. Tillsätt en milliliter cellavlossningslösning till brunnen och inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius. Efter inkubation tillsätt en milliliter släckmedel till Wells som innehåller cellavlossningslösning.Håll cellerna som aggregat genom att försiktigt pipettera upp och ner. Se till att alla celler är lossade, men för överföring av dem till ett koniskt rör på 15 milliliter för centrifugering vid 300 gånger G i fem minuter. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i LPC-induktionsmediet.Räkna cellerna och tillsätt 2,5 gånger 10 till de femte cellerna till 100 mikroliter kallt GFR-källarmembranmatrismedium och blanda väl. Placera en droppe i en brunn med en 12-brunnsplatta och inkubera vid 37 grader Celsius i 30 till 60 minuter. Lägg sedan till en milliliter LPC-media per brunn, se till att mediumfallet är helt nedsänkt och inkuberar över natten vid 37 grader Celsius.På dag åtta, byt LPC medium för att ta bort ROCK-hämmaren Y27632. Fortsätt att byta media varannan dag och analysera LPC-effektiviteten i slutet av dag 16. På dag 17 tvättar du brunnar och tillsätt 500 mikroliter på två mikrogram per milliliter dispase.Pipettera dispaseblandningen med en P1000-pipett och inkubera i 15 minuter, pipetten sedan blandningen och inkubera i ytterligare 15 minuter. Efter inkubation tillsätt en milliliter av släckningsmediet till dispase som innehåller brunnar och överför cellerna till koniska rör. Centrifugera och återsuspendera pelleten i en milliliter kyld PVS och upprepa sedan centrifugeringen.Sätt sedan tillbaka pelleten i en milliliter cellavlossningsmedium. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 12 minuter, tillsätt sedan en lika stor volym av släckmedel och centrifugera igen. Återanvänd pelleten i en milliliter släckmedel och 10 mikromolar ROCK-hämmare Y27632.Utför ett cellantal för att beräkna den volym som behövs för att erhålla åtta gånger 10 till de fjärde cellerna per brunn. Därefter krävs volym LPC-cellaggregat i 1,5 milliliter mikrocentrifugerrör och centrifugera i fem minuter vid 300 gånger G.Ta bort överflödigt supernatant utan att omröra cellpelleten och lämna 10 mikroliter restmedium. Återanvänd cellpelleten i 200 mikroliter av kallt GFR-källarmembranmatrismedium och överför cellerna till cellodlingsmembraninsatser.Inkubera vid 37 grader Celsius i 30 till 60 minuter. Efter inkubation tillsätt en milliliter 3D-organoidinduktionsmedel till insatsens basolateralkammare och ersätt den med färskt medium varannan dag i sex dagar. På dag 23 byter du mellan till 3D-förgreningsmedium och byter sedan medium varannan dag i sex dagar.På dag 29, byt till 3D-mognadsmedium och fortsätt att byta ut mediet varannan dag under de kommande sex dagarna. På dag fyra av DE-induktion visar bifogade celler en kompakt kullerstensmorfologi. De slutgiltiga endoderm markörer CXCR4 och SOX17 överlagrade med atomkärnor uttrycktes, bekräftar endodermal differentiering.Främre foregut induktion bekräftades på dag sju med morfologi visar tätare komprimerade celler, och markörer FOXA2 och SOX2 överlagras med atomkärnor. Generering av 3D lung stamceller bekräftades med 3D sfäroider och det endogena uttrycket av NKX2-1 GFP i en reporter cellinje. Efter en tre veckor differentiering i hela lung organoider analyserades lung markörer av immunocytochemistry.Markörer för förgrening morfogenes SOX2 och SOX9 överlagrad av atomkärnor observerades i organoiderna. Proximala lung markörer P63 och KRT5, båda markörer av basala celler, upptäcktes framgångsrikt tillsammans med SCGB3A2, som är en markör för klubbceller. Distala lungmarkörer inducerade Pro SPC och SPB markörer för Alveolar typ II celler.Och HOPX markörer av Alveolar typ I celler. Dessutom uttrycktes NKX2-1 och ZO1 överlagrade med atomkärnor. Mesenchyme lung cell markörer PGFR Alpha, en markör för fibroblaster, uttryckt med SOX9, representerade distala mesenchyme.Vimentin uttrycktes också och spreds över hela lungan. Efter denna procedur kan lungorganoiderna investeras med inducerad pluripotent stamcell härledda endotel och immunceller. Lungutveckling och sjukdom uppstår genom en signalering mellan epitelial och mesenchymala cellpopulationer, men också från endotelceller och makrofager.Ett 3D-lungvävnadsmodellsystem är kliniskt relevant för att studera mänskliga sjukdomar och terapier.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av inducerade-pluripotenta stamceller med hjälp fibroblastliknande synoviocyter Isolerad från fogar av patienter med reumatoid artrit

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humant melanom tumörinfiltrerande lymfocyter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducerade pluripotenta stamceller Generation från blodkroppar med användning Sendai virus och centrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation Integrations-fria inducerade pluripotenta stamceller från humant perifert blod mononukleära celler med användning av episomala vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsbildning från Cord Blood-härledda inducerade Pluripotenta stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Partiell lobulär Hepatectomy: En kirurgisk modell för Morphologic lever regenerering

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserade omprogrammering av mänskliga primära fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...