Name: generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Bu araştırma Kaliforniya Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) tarafından desteklendi.

Bu çalışma protokolü UCSD İnsan Araştırma Koruma Programı Kurumsal İnceleme Kurulu (181180) tarafından onaylanmıştır.
1. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kesin endoderm indüksiyonu (Gün 1 - 3)
<ol><li>Büyüme faktörünü yavaşça çözün (GFR)-bodrum membran (BM) matris ortamı kullanılmadan 30 dakika önce buz üzerinde. Soğuk DMEM/F12'de, GFR BM matris ortamını bu ortamın% 50'sini oluşturacak şekilde seyreltin. P1000 pipet uçlarını kullanmadan önce...

<ol>
	<li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+development+in+the+mouse+embryo.">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li><li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis.">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li><li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+and+exogenous+stem/progenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease.">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).</li><li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+crosstalk+in+lung+development.">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung.">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li><li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells.">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li><li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+lung.">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis.">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li><li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+(FGF10)+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung.">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li><li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Sonic+hedgehog+(Shh)+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis.">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids.">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li><li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li><li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li><li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal,+spatial,+and+phenotypical+changes+of+PDGFR&#945;+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development.">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFR&#945; expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Nikoli&#263;, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction.">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li><li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases.">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li><li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development.">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA.">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li><li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy.">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li><li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2++airway+epithelium.">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li><li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells.">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).</li><li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population.">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li><li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells:+universal+donor+for+cell+therapy.">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).</li></ol>

3D tüm akciğer organoidlerinin (WLO) başarılı farklılaşması, büyüme faktörlerine ve küçük moleküllere maruz kalma süresi, geçtikten sonra hücresel yoğunluk ve hiPSC'lerin kalitesi de dahil olmak üzere detaylara dikkat edilen çok adımlı, 6 haftalık bir protokole dayanır. Sorun giderme için tablo 2'ye bakın. hiPSC'ler yaklaşık%70-%80 bir arada olmalı, ayrışma öncesinde %5'ten az spontan farklılaşma olmalıdır. Bu protokol "mTeSR artı" ortamını gerektirir; ancak, düz ...

Akciğer, embriyonik, psödooglandular, kanaliküler, sakküler, alveolar ve mikrovasküler olgunlaşma1,2 olmak üzere altı farklı aşamada gelişen karmaşık, heterojen, dinamik bir organdır. İkinci iki evre insan gelişiminde prenatal olarak gerçekleşirken, ilk dört aşama sadece fetal gelişim sırasında meydana gelir, tabii preterm doğum gerçekleşmediği sürece3. Embriyonik faz endodermal mikrop tabakasında başlar ve trakea ve akciğer tomurcuklarının tomurcuklanmasıyla sonuçlanır. Akciğer gelişimi kısmen epitel ve mezenkimal hücreler arasında sinyal yoluyla gerçekleşir4. Bu etkileşimler akciğer dallanması, çoğalması, hücresel kader tespiti ve gelişmekte olan akciğerin hücresel farklılaşması ile sonuçlanır. Akciğer iletken bölgelere (terminal bronşiollere trakea) ve solunum bölgelerine (alveollere solunum bronşiolleri) ayrılmıştır. Her bölge benzersiz epitel hücre tipleri içerir; hava yolunda bazal, salgı, siliated, fırça, nöroendokrin ve iyonosit hücreleri5, ardından solunum epitelinde alveolar tip I ve II hücreleri dahil olmak üzere6. Çeşitli hücre tiplerinin gelişimi ve yaralanmasına yanıt hakkında hala çok şey bilinmemektedir. iPSC türevi akciğer organoid modelleri, insan akciğer gelişimini yönlendiren mekanizmaların incelenmesini, genetik mutasyonların pulmoner fonksiyon üzerindeki etkilerini ve hem epitel hem de mezenkimlerin primer insan akciğer dokusuna ihtiyaç duymadan enfeksiyöz ajanlara yanıtlanmasını sağlar.
Embriyonik farklılaşmanın çeşitli aşamalarına karşılık gelen belirteçler arasında kesin endoderm (DE)7 için CXCR4, cKit, FOXA2 ve SOX17, ön ön endoderm (AFE)8 için FOXA2, TBX1 ve erken akciğer progenitor hücreleri için NKX2-1 bulunur9. Embriyonik akciğer gelişiminde, foregut dorsal yemek borusu ve ventral trakeaya bölünür. Sağ ve sol akciğerlerin tomurcukları, trakeal tomurcuk10 etrafında iki bağımsız çıkıntı olarak görünür. Dallanma morfogenez sırasında, epitel çevreleyen mezenkim elastik doku, düz kas, kıkırdak ve vaskülür üretir11. Epitel ve mezenkim arasındaki etkileşim normal akciğer gelişimi için gereklidir. Bu, FGF1012'nin epitel tarafından üretilen mezenkim ve SHH13 tarafından salgılanmasıdır.
Burada, hiPSC'lerin üç boyutlu (3D) tüm akciğer organoidlerine (WLO) yönlendirilmiş farklılaşması için bir protokol açıklıyoruz. Alveolar benzeri 14,15 (distal) organoid veya hava yolu16 (proksimal) organoid yapmak için LPC aşamasında tasnif yoluyla akciğer progenitör hücrelerinin izolasyonunu içeren benzer yaklaşımlar olsa da, veya insan akciğer organoidlerini alveolar hücre ve mezenkimal belirteçleri ve tomurcuk ucu progenitor organoidlerini ifade eden hale getirmek için ventral-ön sferoidler üretin17 , bu yöntemin gücü, akciğer dallanma morfogenez, olgunlaşma ve genişleme in vitro için hem akciğer epitel hem de mezenkimal hücre tiplerinin örüntülenmesi ve düzenlenmesidir.
Bu protokol, pluripotent kök hücrelerin ayırt ediciliğini kesin endoderm, ön ön ön endoderm ve akciğer progenitör hücreleri yoluyla yönlendirmek için küçük moleküller ve büyüme faktörleri kullanır. Bu hücreler daha sonra dallanma ve olgunlaşma da dahil olmak üzere önemli gelişimsel adımlarla 3D tüm akciğer organoidlerine indüklenir. Farklılaşma protokolünün özeti Şekil 1a'da, Şekil 1b'de gösterilen endodermal ve organoid farklılaşmanın temsili parlak alan görüntüleriyle gösterilmiştir. Şekil 1c, endodermal farklılaşmanın gen ekspresyon detaylarının yanı sıra farklılaşmayı tamamladıktan sonra akciğer epitel hücrelerinin hem proksimal hem de distal popülasyonlarının gen ekspresyonunu gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well inserts, 0.4um, translucent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10769-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without retinoic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>StemCellTech</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM) + Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus Kit (10/case)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 + Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors/Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Br-cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>345-FG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF/PIGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>297-VP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170P</td>
			<td>1:200 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOPX</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-398703</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTII-280</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280</td>
			<td>0.145833333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52635</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76013</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-1-APC</td>
			<td>LS-BIO</td>
			<td>LS-C264437</td>
			<td>1:1000 (F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proSPC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40871</td>
			<td>0.215277778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCGB3A2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181853</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-014</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3075</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPB (mature)</td>
			<td>7 Hills</td>
			<td>48604</td>
			<td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC (mature)</td>
			<td>LS Bio</td>
			<td>LS-B9161</td>
			<td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease

Biyolojik olarak ilgili in vitro model sistemlerin eksikliği nedeniyle insan akciğer gelişimi ve hastalığının incelenmesi zor olmuştur. İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) adım adım hem epitel hem de mezenkimal hücre popülasyonlarından oluşan 3D çok hücreli akciğer organoidlerine ayırt edilebilir. Embriyonik gelişimsel ipuçlarını, kesin endoderm, ön ön endoderm ve daha sonra akciğer progenitör hücreleri verimli bir şekilde üretmek için çeşitli büyüme faktörleri ve küçük moleküller sunarak yeniden kapsülleriz. Bu hücreler daha sonra büyüme faktörü azaltılmış (GFR)-bodrum membran matris ortamına gömülür ve dış büyüme faktörlerine yanıt olarak kendiliğinden 3D akciğer organoidlerine dönüşmelerini sağlar. Tüm bu akciğer organoidleri (WLO) deksametazon, siklik AMP ve izobutilksantin maruziyeti sonrası dallanma morfogenez ve olgunlaşma dahil olmak üzere erken akciğer gelişim evrelerinden geçer. WLO'lar KRT5 (bazal), SCGB3A2 (club) ve MUC5AC (goblet) belirteçlerini ifade eden hava yolu epitel hücrelerinin yanı sıra HOPX (alveolar tip I) ve SP-C'yi (alveolar tip II) ifade eden alveolar epitel hücrelerine sahiptir. Düz kas aksin (SMA) ve trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü A (PDGFRα) dahil olmak üzere mezenkimal hücreler de mevcuttur. iPSC türevi WLO'lar aylarca 3D kültür koşullarında tutulabilir ve belirli bir hücre popülasyonunun saflaştırılması için yüzey belirteçleri için sıralanabilir. iPSC türevi WLO'lar, akciğer epitel ve mezenkim arasındaki sinyaller de dahil olmak üzere insan akciğer gelişimini incelemek, insan akciğer hücresi fonksiyonu ve gelişimi üzerinde genetik mutasyonları modellemek ve enfektif ajanların sitotoksikliğini belirlemek için de kullanılabilir.

Kaplamadan 24 saat sonra, 1. 2. günde DE%90-%95 bir arada olmalıdır. DE indüksiyonu sırasında, 4. günde önemli hücre ölümünü gözlemlemek yaygındır, ancak bağlı hücreler kompakt bir parke taşı morfolojisini koruyacaktır (Şekil 2b). Yapışık hücrelerin çoğunluğu ayrılırsa farklılaşmayı durdurun ve ACTIVIN A ile DE ortamına maruz kalmayı 6-12 saat kısaltmayı düşünün. AFE indüksiyonu sırasında hücre ölümü minimumdur ve hücreler yapışmada kalır...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease at JoVE.com

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Makalede, indüklenen pluripotent kök hücrelerin mezenkim ile birlikte hem proksimal hem de distal epitel akciğer hücrelerini içeren üç boyutlu tüm akciğer organoidlerine yönlendirilmiş adım bilgeliği açıklanmaktadır.

Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Bu protokol, insan akciğer hastalığını ve bir tabaktaki gelişimi modellemek için indüklenmiş pluripotent kök hücreleri akciğer hücrelerine ayırt etmek için kullanır. Bu protokol önemlidir, çünkü birincil insan akciğer dokusunu elde etmek ve kültüre etmek zordur. Akciğer hücrelerini pluripotent kök hücrelerden ayırt ederek temel avantajları, insan akciğer gelişimini ve hastalığını incelemek için sürekli olarak belirli akciğer hücrelerinin tedarik edilmesidir.Bu hücreler hücre kültüründe uzun süre korunabilir, gelecekteki uygulamalar için kriyoprezizonlanabilir ve gen mutasyonlarını incelemek için genetik olarak manipüle edilebilir. Prosedürü gösteren rachel McVicar olacak, laboratuvarımdan bir doktora adayı. Deneye başlamadan önce, azaltılmış bir büyüme faktörünü veya GFR'yi buz üzerinde bodrum membran matris ortamını yavaşça çözün ve eşit miktarda soğuk DMEM F12'de seyreltin.P1000 uçlarını kullanmadan önce soğuması için dondurucuya yerleştirin. Daha sonra, 12 kuyu plakasının her kuyusunu% 50 GFR bodrum membran matris ortamının 500 mikrolitresi ile kaplayın ve fazla orta karışımı ve kabarcıkları kuyulardan çıkarın. Kuyu plakalarını 20 dakika ayarlamak için ıslak buzun veya dört santigrat derecede bir buzdolabının üzerine yerleştirin, ardından plakayı bir gecede 37 santigrat derece inkübatöre taşıyın.Yüksek PSE'ler %70 izdiah süresine ulaştığında, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere 10 mikromoler ROCK inhibitörü Y27632 ekleyin ve ayrışmadan önce bir saat bekleyin. Ortamı emiş edin ve hücreleri PVS ile bir kez yıkayın. Kuyu başına 500 mikrolitre hücre ayırma ortamı ekleyerek IPSC'leri ayrıştırın ve %5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra kuyu başına 500 mikrolitre kök hücre geçirme ortamı ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için P1000 ucu kullanarak hücreleri hafifçe pipetler. Daha sonra ayrışmış hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe ve santrifüje 300 kez G.Santrifüjasyonu takiben beş dakika boyunca aktarın, ortamı epire edin ve hücre peletini 10 mikromoler ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir mililitre mTeSR Plus medya ile yeniden biriktirin.Hücreleri saydıktan sonra, 12 kuyu GFR orta kaplamalı plakanın her kuyusuna beşinci IPSC'lere iki kez 10 ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kesin endoderm veya DE indüksiyon ortamı eklemeden önce mTeSR Plus'ı aspire edin. İkinci ve üçüncü günlerde DE indüksiyon medyasını değiştirin.Dördüncü gün, DE indüksiyon ortamını serumsuz bazal ortamla değiştirerek AFE indüksiyona başlayın. Altıncı günün sonunda AFE verimliliğini analiz etmeden önce üç gün boyunca AFE ortamını günlük olarak değiştirin. Yedinci günde, GFR bodrum membran matris ortamını daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde çözün.Aynı zamanda, AFE medyasını aspire ederek ve kuyuları PVS ile yıkayarak akciğer progenitör hücre farklılaşmasına devam edin. Kuyuya bir mililitre hücre müfreze çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre ayırma çözeltisi içeren Kuyulara bir mililitre söndürme ortamı ekleyin.Yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yaparak hücreleri agrega olarak tutun. Tüm hücrelerin yerinden olduğundan emin olun, ancak beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için. Üstnatant çıkarın ve hücre peletini LPC indüksiyon ortamında yeniden diriltin.Hücreleri sayın ve 100 mikrolitre soğuk GFR bodrum membran matrisi ortamına beşinci hücrelere 2,5 çarpı 10 ekleyin ve iyice karıştırın. Bir damlayı 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin ve 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, kuyu başına bir mililitre LPC ortamı ekleyerek orta düşüşün tamamen suya batırılıp gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatmasını sağlayın.Sekizinci günde, ROCK inhibitörü Y27632'yi çıkarmak için LPC ortamını değiştirin. Medyayı her gün değiştirmeye devam edin ve 16. 17. günde kuyuları yıkayın ve mililitre dispaz başına iki mikrogramdan 500 mikrolitre ekleyin.Dispaz karışımını bir P1000 pipet ile pipetleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın, ardından karışımı pipetleyin ve 15 dakika daha kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuyuları içeren dispaziye söndürme ortamlarından bir mililitre ekleyin ve hücreleri konik tüplere aktarın. Santrifüjleyin ve peleti bir mililitre soğutulmuş PVS'de yeniden diriltin, ardından santrifüjü tekrarlayın.Daha sonra peleti bir mililitre hücre ayırma ortamına yeniden ayırın. Hücreleri 37 santigrat derecede 12 dakika kuluçkaya bırakın, ardından eşit miktarda söndürme ortamı ve santrifüj ekleyin. Peletin bir mililitre söndürme ortamı ve 10 mikromoler ROCK inhibitörü Y27632'de yeniden dürt.Kuyu başına sekiz kez 10 ila dördüncü hücreleri elde etmek için gereken birimi hesaplamak için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Daha sonra aliquot, 1,5 mililitre mikro santrifüj tüplerine LPC hücre agregalarının hacmini ve 300 kez beş dakika boyunca santrifüj gerektirir G.Hücre peletini karıştırmadan fazla süpernatantı çıkarın ve 10 mikrolitre artık ortam bırakın. Hücre peletini 200 mikrolitre soğuk GFR bodrum membran matrisi ortamına yeniden depoleyin ve hücreleri hücre kültürü membran uçlarına aktarın.30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Kuluçkadan sonra, kesici ucun bazolateral odasına bir mililitre 3D organoid indüksiyon ortamı ekleyin ve altı gün boyunca her gün taze ortamla değiştirin. 23. günde, ortamı 3D dallanma ortamına geçirin, ardından altı gün boyunca her gün ortamı değiştirin.29. günde, 3D olgunlaşma ortamına geçin ve önümüzdeki altı gün boyunca ortamı iki günde bir değiştirmeye devam edin. DE indüksiyonunun dördüncü gününde, bağlı hücreler kompakt bir parke taşı morfolojisi gösterir. Çekirdekle kaplanmış kesin endoderm belirteçleri CXCR4 ve SOX17 ifade edildi ve endodermal farklılaşma doğrulandı.Ön ön indüksiyon, daha sıkı sıkıştırılmış hücreler gösteren morfoloji ile yedinci günde doğrulandı ve FOXA2 ve SOX2 belirteçleri çekirdekle kaplandı. 3D akciğer progenitör hücrelerinin üretimi 3D sferoidler ve bir muhabir hücre hattında NKX2-1 GFP'nin endojen ekspresyonu ile doğrulandı. Üç haftalık bir farklılaşmadan sonra tüm akciğer organoidlerine, akciğer belirteçleri immünostokimya ile analiz edildi.Organoidlerde çekirdeklerin kaplatığı morfogenez SOX2 ve SOX9 dallanma belirteçleri gözlendi. Bazal hücrelerin her ikisi de belirteç olan proksimal akciğer belirteçleri P63 ve KRT5, kulüp hücreleri için bir belirteç olan SCGB3A2 ile birlikte başarıyla tespit edildi. Distal akciğer belirteçleri Alveolar Tip II hücreleri için Pro SPC ve SPB belirteçlerini indükler.Ve Alveolar Tip I hücrelerinin HOPX işaretleyicileri. Ek olarak, NKX2-1 ve ZO1 çekirdeklerle kaplanmış olarak ifade edildi. Sox9 ile birlikte ifade edilen fibroblastlar için bir belirteç olan Mezenkime akciğer hücresi belirteçleri PGFR Alpha distal mezenkimi temsil etti.Vimentin de ifade edildi ve akciğere dağıldı. Bu işlemden sonra akciğer organoidlerine indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş endotel ve immün hücreler ile yatırım yapılabilir. Akciğer gelişimi ve hastalığı, epitel ve mezenkimal hücre popülasyonları arasında bir sinyalle ortaya çıkar, aynı zamanda endotel hücrelerinden ve makrofajlardan da kaynaklanır.3D akciğer dokusu modeli sistemi klinik olarak insan hastalığı ve terapötikleri incelemekle ilgilidir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Kısmi Lobular Hepatectomy: Morfolojik karaciğer rejenerasyonu için cerrahi bir Model

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...