Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

ونشكر معهد غونسالو مونيز وفيوكروز باهيا بالبرازيل وقسم الفحص المجهري على المساعدة. تم دعم هذا العمل من قبل INOVA-FIOCRUZ رقم 79700287000 ، P.S.T.V. حاصل على منحة للإنتاجية في الأبحاث من CNPq (305235/2019-2). تم تقديم البلازميدات بلطف من قبل موريسيو تيريبيزنيك ، جامعة تورنتو ، كاليفورنيا. يود المؤلفون أن يشكروا أندريس ك. والتر على مراجعة اللغة الإنجليزية والمساعدة في تحرير نسخ المخطوطات.

تم الحصول على الخلايا من متبرعين أصحاء بعد الموافقة على الإجراءات من قبل اللجان الوطنية لأخلاقيات البحث (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. مزارع الخلايا
<ol><li>البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية ملاحظة: للحصول على البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية للتمايز في المختبر<...

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages.">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li><li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania-macrophage+interactions:+multiple+receptors,+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses.">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li><li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+Leishmania+infection.">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li><li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages.">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li><li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani+lipophosphoglycan+causes+periphagosomal+actin+accumulation:+correlation+with+impaired+translocation+of+PKCalpha+and+defective+phagosome+maturation.">Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation.</a> Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).</li><li>Vergne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).</li><li>Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages.">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection.">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response:+a+signaling+point+of+view.">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Ligase+Smurf1+Functions+in+Selective+Autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Anti-tuberculous+Host+Defense.">The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense.</a> Cell Host &amp; Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li><li>Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane.">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis.">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase.">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li><li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+rab5+activation+in+endocytosis+and+phagocytosis.">Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).</li><li>Vitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+small+GTPase+Rab7+in+the+late+endocytic+pathway.">Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).</li><li>Matte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+major+Promastigotes+Evade+LC3-Associated+Phagocytosis+through+the+Action+of+GP63.">Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63.</a> PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).</li><li>Dias, B. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+Induction+Greatly+Enhances+Leishmania+major+Intracellular+Survival+Compared+to+Leishmania+amazonensis+in+CBA/j-Infected+Macrophages.">Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).</li><li>Babcock, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+phagocytosis+by+confocal+microscopy.">Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).</li><li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+and+phagocytosis:+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis.">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li><li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

التفاعل بين الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة وينطوي على العديد من الخطوات التي يمكن أن تؤثر على تطور المرض5. لفهم أفضل للآليات التي ينطوي عليها تفاعل الليشمانيا غير المتعثرة والخلايا المضيفة ، وصفنا بروتوكولا يستخدم المجهر الفلوري البؤري لتقييم البلعمة من المراحل ال?...

داء الليشمانيات هو مرض استوائي مهمل تسببه طفيليات البروتوزوان من جنس الليشمانيا ، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من المظاهر السريرية في مضيف الفقاريات ، بما في ذلك داء الليشمانيات الجلدي ، داء الليشمانيات المخاطي الجلدي وداء الليشمانيات الحشوي 1. تقدر منظمة الصحة العالمية (WHO) أن أكثر من مليار شخص معرضون للخطر ، مع الإبلاغ عن أكثر من مليون حالة جديدة سنويا2.
الليشمانيا spp. هي بدائيات ملزمة داخل الخلايا التي تعيش داخل الخلايا المضيفة ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة والبلاعم والخلايا المتغصنة3. تفاعل الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة تنطوي على مستقبلات متعددة للخلايا المضيفة وروابط طفيليات إما من خلال التفاعل المباشر أو عن طريق opsonization التي تنطوي على مستقبلات تكميلية 4,5. مستقبلات السطح الكلاسيكية ، مثل CR1 ، CR3 ، mannose-fucose ، fibronectin ، مستقبلات تشبه الرسوم والزبال ، تتوسط ارتباط الطفيلي بالبلاعم 6,7,8. تتعرف هذه المستقبلات على الجزيئات الموجودة على سطح الليشمانيا ، بما في ذلك البروتين السكري 63 kDa (gp63) و glycolipid lipophosphoglycan (LPG)9. هذه هي الجزيئات الأكثر وفرة على سطح promastigotes وتلعب دورا أساسيا في تخريب الاستجابة المناعية للمضيف ، وتفضل إنشاء عدوى الطفيليات في خلايا الثدييات10. بعد أن ترتبط روابط سطح الطفيليات بمستقبلات البلاعم ، يتراكم F-actin على أسطح خلايا الثدييات ، والطفيليات المحيطة بها أثناء البلعمة. في وقت لاحق ، يؤدي هذا إلى تكوين حجرة مستحثة بالطفيليات تسمى الفجوة الطفيلية (PV) ، والتي تقدم ميزات البلعمة11. بمجرد دخول هذه البلعمة ، تخضع الطفيليات لعدة تعديلات ضرورية للبقاء على قيد الحياة والتكاثر3.
التولد الحيوي للكهروضوئيات هو عملية اتجار غشاء عالية التنظيم حاسمة لبقاء هذا العامل الممرض داخل الخلايا12. ينتج تكوين هذه المقصورة عن أحداث اندماج متسلسلة بين البلعمة ومقصورات المسار الداخلي للمضيف. كشفت دراسات بيولوجيا الخلية الكلاسيكية أن نضوج الخلايا الكهروضوئية ينطوي على الحصول على بروتين G الأحادي Rab 5 و Rab 7 ، والتي ترتبط بشكل رئيسي بنضج البطانة المبكرة والمتأخرة ، على التوالي13. بالإضافة إلى ذلك ، تكتسب هذه المقصورات بروتينات الغشاء المرتبطة بالليزوسوم 1 و 2 (LAMP 1 ، LAMP 2) ، ومكونات البروتين الرئيسية للغشاء الليزوزومي والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B - سلسلة الضوء 3 (LC3) ، وهي علامة البلعمة الذاتية14. على الرغم من أوجه التشابه الواضحة ، فإن حركية التكوين الكهروضوئي 15,16 ومورفولوجيا هذه المقصورات تختلف اعتمادا على أنواع الليشمانيا. على سبيل المثال ، العدوى التي تسببها L. mexicana أو L. amazonensis تحفز على تكوين مقصورات كبيرة تحتوي على عدد كبير من الطفيليات17. على النقيض من ذلك ، تشكل الأنواع الأخرى ، مثل L. braziliensis و L. infantum ، فجوات أصغر تحتوي عادة على طفيلي واحد أو اثنين فقط في كل فجوة18.
على الرغم من هذه المعرفة المحيطة بتفاعل خلية المضيف مع الليشمانيا ، إلا أن الأحداث الأولية الناجمة عن الاتصال بين مستقبلات المضيف وروابط الطفيليات لم يتم توضيحها بالكامل. ومن المعروف أن هذه الأحداث هي محددات لنتائج العدوى الطفيلية وتعتمد على أنواع الطفيليات ، ونوع مستقبلات الخلايا المضيفة التي تم تجنيدها للتعرف على الطفيليات وتنشيط مسارات إشارات البلاعم 19,20. لذلك ، من الضروري تحديد الجزيئات المشاركة في التكوين الحيوي للكائنات الكهروضوئية التي يسببها الليشمانيا وتحديد الدور (الأدوار) التي تلعبها هذه الجزيئات في إنشاء العدوى ونتائجها. هنا ، نصف طريقة لرصد الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء البلعمة في الليشمانيا ، بما في ذلك الربط والاستيعاب وتكوين البلعمة والنضج. يمكن أن يساعد هذا العمل في توضيح مشاركة PLC و Akt و Rab5 و Rab7 و LC3 في تكوين PVs التي تسببها أنواع مختلفة من الليشمانيا. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في مشاركة البروتينات الأخرى المشاركة في النضج الكهروضوئي. ستوسع الدراسات المستقبلية المعرفة المحيطة بالآليات المشاركة في تفاعل الخلايا المضيفة بين الليشمانيا وتساهم في تصميم استراتيجيات جديدة للعلاج الكيميائي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

البلعمة هي عملية منسقة تتضمن خطوات متميزة: التعرف والربط والاستيعاب. تأخذ الخلايا البلعمية الاحترافية طفيليات الليشمانيا عن طريق البلعمة ، والتي تتكون من التعرف على الأربطة على أسطح الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة المتعددة. يحدث ارتباط الليشمانيا بأغشية البلاعم من خلال مستقبلات المكمل من النوع 1 (CR1) والمستقبلات المكملة من النوع 3 (CR3) ومستقبلات التعرف على الأنماط. Lipophosphoglycan (LPG) و 63 kDa glycoprotein (gp63) هي الروابط الرئيسية المشاركة في تفاعلات البلاعم والليشمانيا . بعد التعرف الأولي على روابط الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة ، تصبح الطفيليات داخلية وتبقى على قيد الحياة وتتكاثر داخل الفجوات الطفيلية. تتضمن عملية نضج الفجوات التي يسببها الليشمانيا الحصول على جزيئات من الحويصلات داخل الخلايا ، بما في ذلك بروتين G الأحادي Rab 5 و Rab 7 ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 1 (LAMP-1) ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 2 (LAMP-2) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B-light chain 3 (LC3).
هنا ، نصف طرقا لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة باستخدام المجهر البؤري ، بما في ذلك (i) الربط (ii) الاستيعاب ، و (iii) نضج البلعمة. من خلال إضافة مجموعة المعرفة المحيطة بهذه المحددات لنتائج العدوى ، نأمل في تحسين فهم التسبب في عدوى الليشمانيا ودعم البحث النهائي عن أهداف جديدة للعلاج الكيميائي.

يهدف هذا التقرير إلى تقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء البلعمة ل L. braziliensis المعزولة من المرضى الذين يقدمون L. braziliensis-LCL أو L. braziliensis-DL شكل CL. باستخدام المجهر البؤري ، قمنا بالتحقيق في الأحداث الرئيسية المرتبطة بالبلعمة للطفيليات: الربط ، والاستيعاب ، ونضج البلعمة. قمنا أول?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا ، نصف طرق لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة.

التحقيق في البلعمة من الليشمانيا باستخدام المجهر البؤري

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا نصف طرق لتقييم الحالات المبكرة للعلاج أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة. تقدم هذه التقنية كميزة رئيسية ، مما يسمح بدراسة حالات مختلفة من البلعمة الليشمانيا ومشاركة العديد من البروتينات.تجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية يمكن أن تمتد أيضا إلى أنواع أخرى من الدراسات ، بما في ذلك العدوى بالبكتيريا والخمائر ، أو أن تبتلعها أنواع أخرى من الخلايا. يجب على الأشخاص الذين يجربون هذه التقنية الاهتمام بوقت تعرض الخلايا لمحلول Nucleofector. بالإضافة إلى ذلك ، نقترح البدء في اختبار النقل باستخدام اثنين من البلازميدات كحد أقصى.ستوضح أماندا ريبوكاس الإجراء ، طالبة دكتوراه من مختبرنا. بادئ ذي بدء ، بذور 0.2 مليون خلية THP-1 ، أو البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية في 500 ميكرولتر RPMI لكل بئر على صفيحة 24 بئر مع أغطية زجاجية 13 ملم. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وغسل الخلايا مرتين مع 0.9٪ المالحة واحتضان الخلايا في وسط RPMI كامل.إضافة أنواع الليشمانيا ذات مرحلة ثابتة إلى الخلايا عند 10 طفيليات هي نسبة خلية مضيفة واحدة ، ثم جهاز طرد مركزي عند 720 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، اغسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ لإزالة أي بروماستيغوتات غير داخلية. احتضن الخلايا في RPMI Medium المكمل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة.بعد ذلك، قم بتركيب أغطية الغطاء باستخدام وسائط التركيب المفضلة. ثم عد ما لا يقل عن 400 خلية في حقول عشوائية تحت المجهر الفلوري. للتحقيق في التكوين الحيوي الكهروضوئي الناجم عن الليشمانيا ، ابدأ في نقل خلايا THP-1 بالبلازميد عن طريق بذر 15 مليون خلية THP-1 في قوارير زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 75 سنتيمترا مربعا تحتوي على 10 ملليلتر من Complete RPMI Medium مع 100 نانوغرام لكل ملليلتر PMA ، و 50 ميكرومولار إلى ميركابتوإيثانول لمدة 48 ساعة.ثم ، اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول ملحي بنسبة 0.9٪ وافصل الخلايا باستخدام محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمي. ثم ، جهاز طرد مركزي في 250 مرة غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أعد تعليق خلايا THP-1 في ملليلتر واحد من RPMI Medium وقم بإجراء العد في غرفة Neubauer.الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى في 250 مرات غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant. أعد تعليق 2 مليون خلية في 100 ميكرولتر من محلول Nucleofector واحتضنها مع 0.5 ميكروغرام من طلاء البلازميد للبروتين محل الاهتمام ، الموسومة ببروتين الفلورسنت. انقل التعليق الذي يحتوي على خلايا THP-1 والحمض النووي إلى كوفيت Nucleofector.ثم ، قم بنقل الخلايا باستخدام برنامج Nucleofector Y one. استرجع الخلايا والبذور المنقولة في 500 ميكرولتر من RPMI Medium على 24 لوحة بئر مع أغطية زجاجية 13 ملم. احتضان الخلايا وإكمال RPMI المتوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 و 2 و 4 و 6 و 12 و 24 ساعة.اترك الغطاء الزجاجي 13 ملم في درجة حرارة الغرفة وقم بحمايته من الضوء قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستحواذ. تنظيف الأغطية بأنسجة ماصة. بعد ذلك ، أضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف ، ثم أضف الشريحة.حرك الهدف لأعلى حتى يلامس الزيت الشريحة. مراقبة وضبط التركيز على المجهر واختيار الخيار 63x الهدف مع النفط. افتح برنامج LIQA واضبط أشعة الليزر في الأطوال الموجية 488 و 552 و 405.حدد دقة الصورة ك 1024 × 1024. بعد النقر فوق الزر المباشر ، اضبط مكدس Z واضغط على خيار البدء. انتظر الحصول على الصورة ثم حدد الخيار ، الحد الأقصى للإسقاط ، في الأدوات.احفظ التجربة، وقم بتصدير صور بتنسيق TIFF إلى جهاز كمبيوتر. أظهرت النتائج أن كلا من Leishmania Braziliensis LCL ، و Leishmania Braziliensis DL ، يرتبطان بالمثل بالبلاعم. أيضا ، لم يلاحظ أي اختلافات فيما يتعلق Leishmania Braziliensis LCL و Leishmania Braziliensis DL البلعمة بواسطة الخلايا المضيفة.تمت مقارنة تجنيد LC3 في الفجوة الطفيلية ، أو PV ، التي تسببها Leishmania Braziliensis LCL أو Leishmania Braziliensis DL ، في الخلايا المصابة. بعد أربع ساعات من العدوى ، لوحظت نسب مماثلة من PV المزينة LC3 في Leishmania Braziliensis LCL و Leishmania Braziliensis DL المصابة بالبلاعم. وهكذا ، أظهرت النتائج أن Leishmania Braziliensis LCL و Leishmania Braziliensis DL يتفاعلان بالمثل مع البلاعم أثناء الربط ، البلعمة ، والتكوين الحيوي للخلايا الكهروضوئية فيما يتعلق بتجنيد LC3.أظهرت الصور المجهرية التمثيلية كفاءة نقل خلايا THP-1 باستخدام بلازميدات PLC-GFP و Rab5-GFP و Rab7-GFP. يجب على الأشخاص الذين يحاولون هذا البروتوكول الانتباه إلى حضانة درجة الحرارة وحماية عينات المجهر من الضوء ، وجميع الأنواع. إن تعديل التعبير عن البروتينات المحددة التي تعجل بالبلعمة الليشمانيا سيوضح أهمية تلك البروتينات في نتائج عدوى الليشمانيا.يمكننا توسيع هذه التقنية نحو أنواع مختلفة من دراسات علم الأمراض والآليات المرتبطة بإنشاء الطفيليات وتحديد الأهداف لتطوير الاستراتيجيات العلاجية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...