Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Nous remercions l’Institut Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brésil et le département de microscopie pour leur aide. Ce travail a été soutenu par INOVA-FIOCRUZ numéro 79700287000, P.S.T.V. détient une subvention pour la productivité dans la recherche du CNPq (305235/2019-2). Les plasmides ont été aimablement fournis par Mauricio Terebiznik, Université de Toronto, CA. Les auteurs tiennent à remercier Andris K. Walter pour la révision de la langue anglaise et l’aide à la révision des manuscrits.

Les cellules ont été obtenues à partir de donneurs sains après l’approbation des procédures par les comités nationaux d’éthique de la recherche (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cultures cellulaires
<ol><li>Macrophages dérivés de monocytes humains NOTE: Pour obtenir des macrophages dérivés de monocytes humains pour la différenciation in vitro en macrophages, prélever du sang de donneurs sains et purifier les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comm...

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages.">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li><li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania-macrophage+interactions:+multiple+receptors,+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses.">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li><li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+Leishmania+infection.">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li><li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages.">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li><li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani+lipophosphoglycan+causes+periphagosomal+actin+accumulation:+correlation+with+impaired+translocation+of+PKCalpha+and+defective+phagosome+maturation.">Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation.</a> Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).</li><li>Vergne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).</li><li>Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages.">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection.">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response:+a+signaling+point+of+view.">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Ligase+Smurf1+Functions+in+Selective+Autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Anti-tuberculous+Host+Defense.">The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense.</a> Cell Host &amp; Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li><li>Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane.">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis.">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase.">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li><li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+rab5+activation+in+endocytosis+and+phagocytosis.">Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).</li><li>Vitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+small+GTPase+Rab7+in+the+late+endocytic+pathway.">Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).</li><li>Matte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+major+Promastigotes+Evade+LC3-Associated+Phagocytosis+through+the+Action+of+GP63.">Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63.</a> PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).</li><li>Dias, B. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+Induction+Greatly+Enhances+Leishmania+major+Intracellular+Survival+Compared+to+Leishmania+amazonensis+in+CBA/j-Infected+Macrophages.">Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).</li><li>Babcock, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+phagocytosis+by+confocal+microscopy.">Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).</li><li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+and+phagocytosis:+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis.">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li><li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs étapes qui peuvent influencer le développement de la maladie5. Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction de Leishmania non opsonisée et des cellules hôtes, nous avons décrit un protocole qui utilise la microscopie confocale à fluorescence pour évaluer la phagocytose des stades précoces à avancés de l’infection à Leishmania. L’utilisation de te...

La leishmaniose est une maladie tropicale négligée causée par des parasites protozoaires du genre Leishmania, entraînant un large éventail de manifestations cliniques chez l’hôte vertébré, notamment la leishmaniose cutanée, la leishmaniose cutanéo-muqueuse et la leishmaniose viscérale1. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estime que plus d’un milliard de personnes sont à risque, avec plus d’un million de nouveaux cas signalés chaque année2.
Les espèces du genre Leishmania sont des protozoaires intracellulaires obligatoires qui survivent à l’intérieur des cellules hôtes, y compris les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques3. L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs récepteurs de cellules hôtes et ligands parasitaires soit par interaction directe, soit par opsonisation impliquant les récepteurs du complément 4,5. Les récepteurs de surface classiques, tels que CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectine, récepteurs de type Toll et charognards, interviennent dans la fixation du parasite aux macrophages 6,7,8. Ces récepteurs reconnaissent les molécules à la surface de Leishmania, notamment la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) et le lipophosphoglycane glycolipidique (GPL)9. Ce sont les molécules les plus abondantes à la surface des promastigotes et jouent un rôle essentiel dans la subversion de la réponse immunitaire de l’hôte, favorisant l’établissement d’une infection parasitaire dans les cellules demammifères10. Une fois que les ligands de surface du parasite se lient aux récepteurs des macrophages, la F-actine s’accumule sur les surfaces cellulaires des mammifères, entourant les parasites au fur et à mesure qu’ils sont phagocytés. Par la suite, cela conduit à la formation d’un compartiment induit par le parasite appelé vacuole parasiphore (PV), qui présente des caractéristiques phagolysosomales11. Une fois à l’intérieur de ces phagolysosomes, les parasites subissent plusieurs altérations essentielles à la survie et à lamultiplication3.
La biogenèse des PV est un processus de trafic membranaire hautement réglementé essentiel à la survie intracellulaire de cet agent pathogène12. La formation de ce compartiment résulte d’événements de fusion séquentielle entre les phagosomes et les compartiments de la voie endocytaire de l’hôte. Des études classiques de biologie cellulaire ont révélé que la maturation des PV implique l’acquisition de protéines G monomères Rab 5 et Rab 7, qui sont principalement associées à une maturation précoce et tardive des endosomes, respectivement13. De plus, ces compartiments acquièrent les protéines membranaires associées aux lysosomes 1 et 2 (LAMP 1, LAMP 2), les principaux constituants protéiques de la membrane lysosomale et la protéine 1A/1B-light chain 3 (CL3) associée aux microtubules, un marqueur autophagosome14. Malgré des similitudes apparentes, la cinétique de formation de PV15,16 et la morphologie de ces compartiments varient selon les espèces de Leishmania. Par exemple, une infection causée par L. mexicana ou L. amazonensis induit la formation de grands compartiments contenant un grand nombre de parasites17. En revanche, d’autres espèces, comme L. braziliensis et L. infantum, forment des vacuoles plus petites qui ne contiennent normalement qu’un ou deux parasites dans chaque vacuole18.
Malgré cette connaissance de l’interaction entre la cellule hôte et la leishmanie, les événements initiaux déclenchés par le contact entre les récepteurs de l’hôte et les ligands du parasite n’ont pas été entièrement élucidés. Ces événements sont connus pour être des déterminants de l’issue de l’infection parasitaire et dépendent des espèces parasitaires, du type de récepteurs de la cellule hôte recrutés pour reconnaître les parasites et de l’activation des voies de signalisation des macrophages19,20. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les molécules impliquées dans la biogenèse des PV induites par Leishmania et de déterminer le(s) rôle(s) joué(s) par ces molécules dans l’établissement et l’issue de l’infection. Ici, nous décrivons une méthode de surveillance des événements précoces survenant au cours de la phagocytose de Leishmania, y compris la liaison, l’internalisation, la formation et la maturation des phagosomes. Ce travail pourrait aider à clarifier la participation de PLC, Akt, Rab5, Rab7 et LC3 dans la formation de PV induite par différentes espèces de Leishmania. Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour étudier la participation d’autres protéines impliquées dans la maturation PV. Les études futures élargiront les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l’interaction Leishmania-cellule hôte et contribueront à la conception de nouvelles stratégies chimiothérapeutiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

La phagocytose est un processus orchestré qui implique des étapes distinctes : la reconnaissance, la liaison et l’internalisation. Les phagocytes professionnels absorbent les parasites Leishmania par phagocytose, consistant à reconnaître les ligands sur les surfaces des parasites par de multiples récepteurs de cellules hôtes. La liaison de Leishmania aux membranes des macrophages se produit par le récepteur du complément de type 1 (CR1) et le récepteur du complément de type 3 (CR3) et les récepteurs de reconnaissance de formes. Le lipophosphoglycane (LPG) et la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) sont les principaux ligands impliqués dans les interactions macrophage-leishmania . Après la reconnaissance initiale des ligands du parasite par les récepteurs de la cellule hôte, les parasites deviennent intériorisés, survivent et se multiplient dans les vacuoles parasitophres. Le processus de maturation des vacuoles induites par Leishmania implique l’acquisition de molécules à partir de vésicules intracellulaires, y compris la protéine G monomère Rab 5 et Rab 7, la protéine membranaire associée lysosomale 1 (LAMP-1), la protéine membranaire associée lysosomale 2 (LAMP-2) et la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 associée aux microtubules (CL3).
Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes en utilisant la microscopie confocale, y compris (i) la liaison (ii) l’internalisation et (iii) la maturation du phagosome. En ajoutant à l’ensemble des connaissances entourant ces déterminants de l’issue de l’infection, nous espérons améliorer la compréhension de la pathogenèse de l’infection à Leishmania et soutenir la recherche éventuelle de nouvelles cibles chimiothérapeutiques.

Ce rapport vise à évaluer les événements précoces survenant au cours de la phagocytose de L. braziliensis isolé chez des patients présentant la forme L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL de CL. En utilisant la microscopie confocale, nous avons étudié les principaux événements associés à la phagocytose des parasites: liaison, internalisation et maturation du phagosome. Nous avons d’abord évalué la liaison et la phagocytose de L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL</e...

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Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes.

Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Nous décrivons ici des méthodes pour évaluer les premiers états de durcissement au cours de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes. Cette technique présente comme le principal avantage, permettant l’étude des différents états de phagocytose de Leishmania et la participation de plusieurs protéines.Il convient de noter que cette technique peut également être étendue à d’autres types d’études, y compris l’infection par des bactéries, des levures ou l’engloutissement par d’autres types de cellules. Les personnes qui essaient cette technique devraient prendre soin du temps d’exposition des cellules à la solution de Nucleofector. De plus, nous suggérons de commencer à tester la transfection en utilisant un maximum de deux plasmides.La démonstration de la procédure sera Amanda Reboucas, une doctorante de notre laboratoire. Pour commencer, ensemencez 0,2 million de cellules THP-1, ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 microlitres RPMI par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 millimètres. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone, laver les cellules deux fois avec 0,9% de solution saline et incuber les cellules dans un milieu RPMI complet.Ajouter la phase stationnaire des espèces de Leishmania aux cellules à un parasite 10 est à un rapport de cellule hôte, puis centrifuger à 720 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir incubé les cellules à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, lavez les cellules deux fois avec une solution saline à 0,9% pour éliminer tous les promastigotes non internalisés. Incuber les cellules dans un milieu RPMI supplémenté à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis fixer les cellules avec 4% PFA pendant 15 minutes.Ensuite, montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré. Ensuite, comptez au moins 400 cellules dans des champs aléatoires sous un microscope à fluorescence. Pour étudier la biogenèse PV induite par Leishmania, commencez à transfecter les cellules THP-1 avec du plasmide en ensemençant 15 millions de cellules THP-1 dans des flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés contenant 10 millilitres de milieu RPMI complet complété par 100 nanogrammes par millilitre de PMA et 50 micromolaires au mercaptoéthanol pendant 48 heures.Ensuite, lavez les cellules une fois dans une solution saline à 0,9% et détachez les cellules à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique. Ensuite, centrifuger à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, remettez en suspension les cellules THP-1 dans un millilitre de milieu RPMI et effectuez des comptages dans une chambre de Neubauer.Centrifuger à nouveau les cellules à 250 fois g pendant 10 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Resuspendre 2 millions de cellules dans 100 microlitres de solution de Nucleofector et incuber avec 0,5 microgramme du revêtement plasmidique de la protéine d’intérêt, marquée avec une protéine fluorescente. Transférer la suspension contenant des cellules THP-1 et de l’acide nucléique dans la cuvette Nucleofector.Ensuite, transfectez les cellules à l’aide du programme Nucleofector Y un. Récupérer les cellules transfectées et les ensemencer dans 500 microlitres de milieu RPMI sur 24 plaques de puits avec des lamelles de verre de 13 millimètres. Incuber les cellules et compléter le milieu RPMI à 37 degrés Celsius pendant 0,5, 2, 4, 6, 12 et 24 heures.Laissez les lamelles de verre de 13 millimètres à température ambiante et protégez-les de la lumière au moins 30 minutes avant l’acquisition. Nettoyez les lamelles de couverture avec un tissu absorbant. Ensuite, ajoutez une goutte d’huile d’immersion à l’objectif, puis ajoutez la diapositive.Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’huile touche la glissière. Observez et ajustez la mise au point sur le microscope et choisissez l’option objectif 63x avec huile. Ouvrez le programme LIQA et ajustez les lasers dans les longueurs d’onde 488, 552 et 405.Sélectionnez la résolution de l’image 1024 x 1024. Après avoir cliqué sur le bouton en direct, définissez la pile Z et appuyez sur l’option de début. Attendez l’acquisition de l’image, puis sélectionnez l’option, projection maximale, dans les outils.Enregistrez l’expérience et exportez les images au format TIFF vers un ordinateur. Les résultats ont montré que Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL se lient de manière similaire aux macrophages. De plus, aucune différence n’a été observée concernant Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL phagocytose par les cellules hôtes.Le recrutement de CL3 dans la vacuole parasitophore, ou PV, induite par Leishmania Braziliensis LCL ou Leishmania Braziliensis DL, a été comparé dans des cellules infectées. Après quatre heures d’infection, des pourcentages similaires de PV décorés de CL3 dans les macrophages infectés par Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL ont été observés. Ainsi, les résultats ont montré que Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL interagissent de manière similaire avec les macrophages lors de la liaison, de la phagocytose et de la biogenèse des PV concernant le recrutement de la CL3.Des images microscopiques représentatives ont démontré une transfection efficace des cellules THP-1 avec les plasmides PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Les personnes qui essaient ce protocole doivent faire attention à l’incubation de la température et protéger les échantillons de microscope de la lumière, de tous les types. La modulation de l’expression des protéines identifiées précipitant la phagocytose de Leishmania démontrera l’importance de ces protéines dans le résultat de l’infection à Leishmania.Nous pouvons étendre cette technique à différents types d’études pathologiques et de mécanismes associés à l’établissement de parasites et à l’identification de cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Recherche

Immunologie et infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

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Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

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Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

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Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...