Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Wir danken dem Gonçalo Moniz Institut, Fiocruz Bahia, Brasilien und der Abteilung für Mikroskopie für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INOVA-FIOCRUZ Nummer 79700287000 unterstützt, P.S.T.V. hält einen Zuschuss für Produktivität in der Forschung von CNPq (305235/2019-2). Plasmide wurden freundlicherweise von Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA, zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Andris K. Walter für die Überarbeitung der englischen Sprache und die Unterstützung beim Manuskriptlektorat.

Die Zellen wurden von gesunden Spendern nach Genehmigung der Verfahren durch die Nationalen Forschungsethikkommissionen gewonnen (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Zellkulturen
<ol><li>Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen HINWEIS: Um humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen für die In-vitro-Differenzierung in Makrophagen zu erhalten, sammeln Sie Blut von gesunden Spendern und reinigen Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), wie von D. English und B. R. Andersen beschriebe...

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages.">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li><li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania-macrophage+interactions:+multiple+receptors,+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses.">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li><li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+Leishmania+infection.">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li><li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages.">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li><li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages.">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection.">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response:+a+signaling+point+of+view.">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. 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G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane.">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis.">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase.">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li><li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).</li><li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+and+phagocytosis:+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis.">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li><li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess und umfasst mehrere Schritte, die die Krankheitsentwicklung beeinflussen können5. Um die Mechanismen der Interaktion von nicht opsonisierten Leishmanien und Wirtszellen besser zu verstehen, haben wir ein Protokoll beschrieben, das konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Phagozytose vom frühen bis zum späten Stadium der Leishmanien-Infektion zu beurteilen. Die Verwendung von Fluoreszenztechniken m...

Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch Protozoenparasiten der Gattung Leishmanien verursacht wird und zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen im Wirbeltierwirt führt, einschließlich kutaner Leishmaniose, mukokutaner Leishmaniose und viszeraler Leishmaniose 1. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass über eine Milliarde Menschen gefährdet sind, wobei mehr als eine Million neue Fälle pro Jahr gemeldetwerden 2.
Leishmania spp. sind obligate intrazelluläre Protozoen, die in Wirtszellen überleben, einschließlich Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen3. Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess, an dem mehrere Wirtszellrezeptoren und Parasitenliganden beteiligt sind, entweder durch direkte Interaktion oder durch Opsonisierung mit Komplementrezeptoren 4,5. Klassische Oberflächenrezeptoren wie CR1, CR3, Mannose-Fucose, Fibronektin, Toll-like- und Scavenger-Rezeptoren vermitteln die Parasitenbindung an Makrophagen 6,7,8. Diese Rezeptoren erkennen Moleküle auf der Oberfläche von Leishmania, darunter das 63 kDa-Glykoprotein (gp63) und das Glykolipid Lipophosphoglycan (LPG)9. Dies sind die am häufigsten vorkommenden Moleküle auf der Oberfläche von Promastigoten und spielen eine wesentliche Rolle bei der Subversion der Immunantwort des Wirts, was die Etablierung einer Parasiteninfektion in Säugetierzellen begünstigt10. Nachdem Parasitenoberflächenliganden an Makrophagenrezeptoren gebunden haben, reichert sich F-Aktin auf den Zelloberflächen von Säugetieren an und umgibt Parasiten, wenn sie phagozytiert werden. Anschließend führt dies zur Bildung eines parasiteninduzierten Kompartiments, das als parasitophoröse Vakuole (PV) bezeichnet wird und phagolysosomale Merkmale aufweist11. Sobald sie sich in diesen Phagolysosomen befinden, durchlaufen Parasiten mehrere Veränderungen, die für das Überleben und die Vermehrung unerlässlich sind3.
Die Biogenese von PVs ist ein stark regulierter Membrantransportprozess, der für das intrazelluläre Überleben dieses Erregers entscheidend ist12. Die Bildung dieses Kompartiments resultiert aus sequentiellen Fusionsereignissen zwischen Phagosomen und Kompartimenten des endozytären Signalwegs des Wirts. Klassische zellbiologische Studien haben gezeigt, dass die Reifung von PVs den Erwerb von monomeren G-Proteinen Rab 5 und Rab 7 beinhaltet, die hauptsächlich mit einer frühen bzw. späten Endosomenreifung assoziiert sind13. Zusätzlich erwerben diese Kompartimente die Lysosom-assoziierten Membranproteine 1 und 2 (LAMP 1, LAMP 2), die Hauptproteinbestandteile der lysosomalen Membran und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A/1B-Lichtkette 3 (LC3), einen Autophagosomenmarker14. Trotz offensichtlicher Ähnlichkeiten variieren die Kinetik der PV-Bildung15,16 und die Morphologie dieser Kompartimente je nach Leishmania-Spezies. Zum Beispiel induziert eine Infektion durch L. mexicana oder L. amazonensis die Bildung großer Kompartimente, die eine große Anzahl von Parasiten enthalten17. Im Gegensatz dazu bilden andere Arten, wie L. braziliensis und L. infantum, kleinere Vakuolen, die normalerweise nur einen oder zwei Parasiten in jeder Vakuoleenthalten 18.
Trotz dieses Wissens über die Interaktion zwischen Wirtszelle und Leishmanie sind die anfänglichen Ereignisse, die durch den Kontakt zwischen Wirtsrezeptoren und Parasitenliganden ausgelöst werden, nicht vollständig aufgeklärt. Es ist bekannt, dass diese Ereignisse Determinanten des Ergebnisses einer Parasiteninfektion sind und von der Parasitenart, der Art der Wirtszellrezeptoren, die zur Erkennung von Parasiten rekrutiert werden, und der Aktivierung von Makrophagen-Signalwegen abhängen19,20. Daher ist es wichtig, die Moleküle zu identifizieren, die an der Biogenese von Leishmanien-induzierten PVs beteiligt sind, und die Rolle(n) zu bestimmen, die diese Moleküle bei der Etablierung und dem Ergebnis von Infektionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Überwachung früher Ereignisse, die während der Phagozytose von Leishmania auftreten, einschließlich Bindung, Internalisierung, Phagosomenbildung und Reifung. Diese Arbeit könnte dazu beitragen, die Beteiligung von PLC, Akt, Rab5, Rab7 und LC3 an der Bildung von PVs zu klären, die durch verschiedene Leishmania-Arten induziert werden. Wichtig ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Beteiligung anderer Proteine zu untersuchen, die an der PV-Reifung beteiligt sind. Zukünftige Studien werden das Wissen über die Mechanismen der Leishmania-Wirtszellinteraktion erweitern und zur Entwicklung neuartiger chemotherapeutischer Strategien beitragen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

Phagozytose ist ein orchestrierter Prozess, der verschiedene Schritte umfasst: Erkennen, Binden und Verinnerlichen. Professionelle Phagozyten nehmen Leishmanien-Parasiten durch Phagozytose auf, die aus der Erkennung von Liganden auf Parasitenoberflächen durch mehrere Wirtszellrezeptoren besteht. Die Bindung von Leishmanien an Makrophagenmembranen erfolgt durch Komplementrezeptor Typ 1 (CR1) und Komplementrezeptor Typ 3 (CR3) und Mustererkennungsrezeptoren. Lipophosphoglycan (LPG) und 63 kDa Glykoprotein (gp63) sind die Hauptliganden, die an Makrophagen-Leishmanien-Interaktionen beteiligt sind. Nach der ersten Erkennung von Parasitenliganden durch Wirtszellrezeptoren werden Parasiten internalisiert, überleben und vermehren sich in parasitophoren Vakuolen. Der Reifungsprozess von Leishmanien-induzierten Vakuolen beinhaltet den Erwerb von Molekülen aus intrazellulären Vesikel, einschließlich des monomeren G-Proteins Rab 5 und Rab 7, des lysosomalen assoziierten Membranproteins 1 (LAMP-1), des lysosomalen assoziierten Membranproteins 2 (LAMP-2) und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A / 1B-Lichtkette 3 (LC3).
Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der frühen Ereignisse, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten, mittels konfokaler Mikroskopie, einschließlich (i) Bindung, (ii) Internalisierung und (iii) Phagosomenreifung. Durch die Erweiterung des Wissens über diese Determinanten des Infektionsergebnisses hoffen wir, das Verständnis der Pathogenese der Leishmanien-Infektion zu verbessern und die Suche nach neuen chemotherapeutischen Zielen zu unterstützen.

Dieser Bericht zielt darauf ab, die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Phagozytose von L. braziliensis auftreten, die von Patienten mit L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Form von CL isoliert wurden. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie untersuchten wir die wichtigsten Ereignisse, die mit der Phagozytose von Parasiten verbunden sind: Bindung, Internalisierung und Phagosomenreifung. Wir untersuchten zuerst die L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Bindung ...

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Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Heilungszustände während der Leishmanien-Interaktion mit den Wirtszellen zu bewerten. Diese Technik stellt sich als Hauptvorteil dar und ermöglicht die Untersuchung verschiedener Zustände der Leishmania-Phagozytose und die Teilnahme mehrerer Proteine.Es ist erwähnenswert, dass diese Technik auch auf andere Arten von Studien ausgedehnt werden kann, einschließlich Infektionen durch Bakterien, Hefen oder Verschlingen durch andere Arten von Zellen. Menschen, die diese Technik ausprobieren, sollten auf die Expositionszeit der Zellen gegenüber der Nucleofector-Lösung achten. Darüber hinaus empfehlen wir, die Transfektion mit maximal zwei Plasmiden zu testen.Amanda Reboucas, Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Zunächst werden 0,2 Millionen THP-1-Zellen oder menschliche Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 Mikrolitern U/min pro Vertiefung auf einer 24-Well-Platte mit 13-Millimeter-Glasdeckgläsern ausgesät. Inkubieren Sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid, waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% Kochsalzlösung und inkubieren Sie die Zellen in einem Complete RPMI Medium.Fügen Sie stationäre Phasen-Leishmania-Arten zu den Zellen bei einem 10-Parasiten-Verhältnis zu einem Wirtszellverhältnis hinzu und zentrifugieren Sie dann bei 720 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% Kochsalzlösung, um nicht internalisierte Promastigoten zu entfernen. Inkubieren Sie die Zellen in ergänztem RPMI-Medium bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und fixieren Sie dann die Zellen mit 4% PFA für 15 Minuten.Als nächstes montieren Sie Deckgläser mit bevorzugten Montagemedien. Dann zählen Sie mindestens 400 Zellen in zufälligen Feldern unter einem Fluoreszenzmikroskop. Um die Leishmanien-induzierte PV-Biogenese zu untersuchen, beginnen Sie mit der Transfizierung von THP-1-Zellen mit Plasmid, indem Sie 15 Millionen THP-1-Zellen in 75 Quadratzentimeter große Gewebekulturkolben mit 10 Milliliter Complete RPMI Medium mit 100 Nanogramm pro Milliliter PMA und 50 Mikromolar zu Mercaptoethanol für 48 Stunden aussäen.Dann waschen Sie die Zellen einmal in 0,9% Kochsalzlösung und lösen Sie die Zellen mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung. Dann zentrifugieren Sie bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes resuspendieren Sie die THP-1-Zellen in einem Milliliter RPMI Medium und führen Zählungen in einer Neubauer-Kammer durch.Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 250 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie 2 Millionen Zellen in 100 Mikroliter Nucleofector-Lösung und inkubieren Sie mit 0,5 Mikrogramm der Plasmidbeschichtung für das interessierende Protein, markiert mit einem fluoreszierenden Protein. Die Suspension, die THP-1-Zellen und Nukleinsäure enthält, wird in die Nucleofector-Küvette überführt.Transfizieren Sie dann die Zellen mit dem Nucleofector-Programm Y one. Gewinnen Sie die transfizierten Zellen und Samen in 500 Mikrolitern RPMI Medium auf 24 Well-Platten mit 13-Millimeter-Glasdeckgläsern. Inkubieren Sie die Zellen und Complete RPMI Medium bei 37 Grad Celsius für 0,5, 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden.Lassen Sie die 13 Millimeter Glasdeckgläser bei Raumtemperatur stehen und schützen Sie sie mindestens 30 Minuten vor der Aufnahme vor dem Licht. Reinigen Sie die Deckgläser mit saugfähigem Tuch. Als nächstes fügen Sie einen Tropfen Tauchöl zum Objektiv hinzu und fügen Sie dann die Folie hinzu.Bewegen Sie das Objektiv nach oben, bis das Öl den Objektträger berührt. Beobachten und stellen Sie den Fokus auf dem Mikroskop ein und wählen Sie die Option 63x Objektiv mit Öl. Öffnen Sie das LIQA-Programm und stellen Sie die Laser in den Wellenlängen 488, 552 und 405 ein.Wählen Sie die Bildauflösung als 1024 x 1024. Nachdem Sie auf den Live-Button geklickt haben, stellen Sie den Z-Stack ein und drücken Sie die Startoption. Warten Sie auf die Bildaufnahme und wählen Sie dann die Option Maximale Projektion in den Werkzeugen aus.Speichern Sie das Experiment, und exportieren Sie die Bilder im TIFF-Format auf einen Computer. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl Leishmania Braziliensis LCL als auch Leishmania Braziliensis DL in ähnlicher Weise an Makrophagen binden. Auch wurden keine Unterschiede in Bezug auf Leishmania Braziliensis LCL und Leishmania Braziliensis DL Phagozytose durch Wirtszellen beobachtet.Die Rekrutierung von LC3 für die parasitophore Vakuole oder PV, induziert durch Leishmania Braziliensis LCL oder Leishmania Braziliensis DL, wurde in infizierten Zellen verglichen. Nach vier Stunden Infektion wurden ähnliche Prozentsätze von LC3-dekorierten PVs in Leishmania Braziliensis LCL und Leishmania Braziliensis DL infizierten Makrophagen beobachtet. So zeigten die Ergebnisse, dass Leishmania Braziliensis LCL und Leishmania Braziliensis DL in ähnlicher Weise mit Makrophagen während der Bindung, Phagozytose und Biogenese von PVs in Bezug auf die LC3-Rekrutierung interagieren.Repräsentative mikroskopische Bilder zeigten eine effiziente Transfektion von THP-1-Zellen mit PLC-GFP-, Rab5-GFP- und Rab7-GFP-Plasmiden. Menschen, die dieses Protokoll ausprobieren, müssen auf die Temperaturinkubation achten und die Mikroskopproben vor dem Licht schützen, alle Arten. Die Modulation der Expression der identifizierten Proteine, die die Leishmanien-Phagozytose auslösen, wird die Bedeutung dieser Proteine für das Ergebnis der Leishmanien-Infektion demonstrieren.Wir können diese Technik auf verschiedene Arten von pathologischen Studien und Mechanismen im Zusammenhang mit der Parasitenetablierung und Zielidentifizierung für die Entwicklung therapeutischer Strategien ausdehnen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...