Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brazil 및 현미경 검사 부서에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 연구는 INOVA-FIOCRUZ 번호 79700287000에 의해 지원되었으며, P.S.T.V.는 CNPq (305235/2019-2)의 연구 생산성 보조금을 보유하고 있습니다. 플라스미드는 캘리포니아 토론토 대학교 Mauricio Terebiznik에서 친절하게 제공했습니다. 저자는 Andris K. Walter에게 영어 개정 및 원고 카피 편집 지원에 감사드립니다.

세포는 국가 연구 윤리위원회 (ID : 94648218.8.0000.0040)의 절차 승인에 따라 건강한 기증자로부터 얻어졌다.
1. 세포 배양
<ol><li>인간 단핵구 유래 대식세포 참고: 시험관 내에서 대식세포로의 분화를 위한 인간 단핵구 유래 대식세포를 수득하려면, 건강한 기증자로부터 혈액을 수집하고 D. English 및 B. R. Andersen21에 의해 기술된 바와 같이 말초 혈액 단핵 ...

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages.">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li><li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania-macrophage+interactions:+multiple+receptors,+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses.">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li><li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+Leishmania+infection.">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li><li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages.">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li><li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani+lipophosphoglycan+causes+periphagosomal+actin+accumulation:+correlation+with+impaired+translocation+of+PKCalpha+and+defective+phagosome+maturation.">Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation.</a> Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).</li><li>Vergne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).</li><li>Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages.">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection.">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response:+a+signaling+point+of+view.">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Ligase+Smurf1+Functions+in+Selective+Autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Anti-tuberculous+Host+Defense.">The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense.</a> Cell Host &amp; Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li><li>Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane.">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis.">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase.">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li><li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+rab5+activation+in+endocytosis+and+phagocytosis.">Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).</li><li>Vitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+small+GTPase+Rab7+in+the+late+endocytic+pathway.">Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).</li><li>Matte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+major+Promastigotes+Evade+LC3-Associated+Phagocytosis+through+the+Action+of+GP63.">Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63.</a> PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).</li><li>Dias, B. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+Induction+Greatly+Enhances+Leishmania+major+Intracellular+Survival+Compared+to+Leishmania+amazonensis+in+CBA/j-Infected+Macrophages.">Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).</li><li>Babcock, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+phagocytosis+by+confocal+microscopy.">Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).</li><li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+and+phagocytosis:+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis.">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li><li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

리슈마니아-대식세포 상호작용은 복잡한 과정이며 질병 발생에 영향을 줄 수 있는 몇 가지 단계를 포함한다5. 비수술화된 리슈마니아와 숙주 세포의 상호작용에 관여하는 메카니즘을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 공초점 형광 현미경을 사용하여 리슈마니아 감염의 초기 단계부터 후기 단계까지 식작용을 평가하는 프로토콜을 기술하였다. 면역 표지 및 형광 ...

Leishmaniasis는 Leishmania 속의 원생 동물 기생충에 의해 야기 된 방치 된 열대 질환으로, 피부 리슈 마니아증, 점막 피부 리슈 마니아증 및 내장 리슈 마니아증1을 포함하여 척추 동물 숙주에서 광범위한 임상 증상을 나타냅니다. 세계 보건기구 (WHO)는 10 억 명이 넘는 사람들이 위험에 처해 있으며 연간 백만 건 이상의 새로운 사례가보고되고있다고 추정합니다 2.
Leishmania spp.는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한 숙주 세포 내에서 생존하는 의무적 인 세포 내 원생 동물입니다3. 리슈마니아-대식세포 상호작용은 직접적인 상호작용을 통해 또는 보체 수용체 4,5를 수반하는 옵소닌화에 의해 다수의 숙주 세포 수용체 및 기생충 리간드를 포함하는 복잡한 과정이다. 고전적 표면 수용체, 예컨대 CR1, CR3, 만노스-푸코스, 피브로넥틴, 톨-유사 및 스캐 빈저 수용체는 대식세포 6,7,8에 대한 기생충 부착을 매개한다. 이 수용체는 63 kDa 당단백질 (gp63) 및 당지질 리포스포글리칸 (LPG)9을 포함하여 리슈마니아의 표면에있는 분자를 인식합니다. 이들은 프로마스티고테스의 표면에서 가장 풍부한 분자이며, 숙주 면역 반응의 전복에 필수적인 역할을 하며, 포유동물 세포(10)에서 기생충 감염의 확립을 선호한다. 기생충 표면 리간드가 대식세포 수용체에 결합한 후, F-액틴은 포유류 세포 표면에 축적되어 기생충을 둘러싸고 식균작용을 한다. 이어서, 이것은 기생충-유도된 구획의 형성으로 이어지고, 이는 식리소좀 특징(11)을 제시한다. 일단 이러한 식세포 내부에 들어가면, 기생충은 생존과 증식에 필수적인 몇 가지 변화를 겪습니다3.
PVs의 생물발생은 이 병원체(12)의 세포내 생존에 매우 중요한 고도로 조절된 막 밀매 과정이다. 이 구획의 형성은 숙주 내시성 경로의 식세포와 구획 사이의 순차적 융합 사건으로부터 초래된다. 고전적 세포 생물학 연구에 따르면 PV의 성숙은 단량체 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7 단백질의 획득을 포함하며, 이는 주로 초기 및 후기 엔도솜 성숙과 관련이 있습니다13. 또한, 이들 구획은 리소좀 관련 막 단백질 1 및 2 (LAMP 1, LAMP 2), 리소좀 막 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3 (LC3), 오토파고좀 마커14의 주요 단백질 구성성분을 획득한다. 명백한 유사성에도 불구하고, PV 형성15,16의 동역학과 이들 구획의 형태학은 리슈마니아 종에 따라 다양하다. 예를 들어, L. mexicana 또는 L. amazonensis에 의한 감염은 많은 수의 기생충(17)을 함유하는 큰 구획의 형성을 유도한다. 대조적으로, L. braziliensis 및 L. infantum과 같은 다른 종은 일반적으로 각 액포(18)에 하나 또는 두 개의 기생충 만 포함하는 더 작은 액포를 형성합니다.
숙주 세포-리슈마니아 상호작용을 둘러싼 이러한 지식에도 불구하고, 숙주 수용체와 기생충 리간드 사이의 접촉에 의해 촉발된 초기 사건은 완전히 해명되지 않았다. 이러한 사건은 기생충 감염의 결과의 결정 요인으로 알려져 있으며 기생충 종, 기생충을 인식하기 위해 모집 된 숙주 세포 수용체의 유형 및 대식세포 신호 전달 경로의 활성화19,20에 의존합니다. 따라서 리슈마니아로 유도된 PV의 생물발생에 관여하는 분자를 확인하고 감염 확립 및 결과에서 이들 분자가 수행하는 역할을 결정하는 것이 필수적이다. 여기에서, 우리는 결합, 내재화, 식기 형성 및 성숙을 포함하여 Leishmania의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 PLC, Akt, Rab5, Rab7 및 LC3가 다른 리슈마니아 종에 의해 유도 된 PV의 형성에 참여하는 것을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 PV 성숙에 관여하는 다른 단백질의 참여를 조사하는데 사용될 수 있다. 미래의 연구는 Leishmania-host cell 상호 작용에 관련된 메커니즘을 둘러싼 지식을 확장하고 새로운 화학 요법 전략의 설계에 기여할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

Phagocytosis는 뚜렷한 단계를 포함하는 오케스트레이션 된 과정입니다 : 인식, 결합 및 내면화. 전문 식세포는 식균작용에 의해 Leishmania 기생충을 흡수하며, 여러 숙주 세포 수용체에 의해 기생충 표면의 리간드를 인식하는 것으로 구성됩니다. 대식세포막에 대한 리슈마니아 의 결합은 보체 수용체 유형 1 (CR1) 및 보체 수용체 유형 3 (CR3) 및 패턴 인식 수용체를 통해 발생한다. 리포포스포글리칸(LPG)과 63kDa 당단백질(gp63)은 대식세포-리슈마니아 상호작용에 관여하는 주요 리간드이다. 숙주 세포 수용체에 의한 기생충 리간드의 초기 인식에 따라, 기생충은 기생충 액포 내에서 내재화되고, 생존하고, 증식합니다. 리슈마니아-유도된 액포의 성숙 과정은 단량체성 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7, 리소좀 관련 막 단백질 1 (LAMP-1), 리소좀 관련 막 단백질 2 (LAMP-2), 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B-경쇄 3 (LC3)을 포함하는 세포 내 소포로부터 분자의 획득을 포함한다.
여기에서, 우리는 공초점 현미경을 사용하여 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명하는데, 여기에는 (i) 결합 (ii) 내재화 및 (iii) 식세포 성숙이 포함된다. 감염 결과의 이러한 결정 요인을 둘러싼 지식의 본문에 추가함으로써, 우리는 리슈 마니아 감염의 병인에 대한 이해를 향상시키고 새로운 화학 요법 표적에 대한 최종 검색을 지원하기를 희망합니다.

이 보고서는 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 형태의 CL을 제시하는 환자로부터 분리 된 L. braziliensis의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 평가하는 것을 목표로합니다. 공초점 현미경을 사용하여 기생충의 식작용과 관련된 주요 사건 인 결합, 내재화 및 식균 성숙을 조사했습니다. 먼저 인간 단핵구 유래 대식세포에 의한 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 결합 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

리슈만 편모충 감염에서 식균 작용과 관련된 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 여기에서는 숙주 세포에 대한 리슈만편모충 상호작용 동안 경화의 초기 상태를 평가하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 Leishmania 식균 작용의 다른 상태와 여러 단백질의 참여를 연구하는 주요 이점으로 제시됩니다.이 기술은 박테리아, 효모에 의한 감염 또는 다른 유형의 세포에 의한 삼킴을 포함하여 다른 유형의 연구로도 확장 될 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이 기술을 시도하는 사람들은 뉴클레오펙터 용액에 대한 세포의 노출 시간을 관리해야 합니다. 또한 최대 2개의 플라스미드를 사용하여 형질감염 테스트를 시작하는 것이 좋습니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 박사 과정 학생 인 Amanda Reboucas가 될 것입니다. 우선, 0.2 백만 THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대 식세포를 13mm 유리 커버 슬립이있는 24 웰 플레이트에 웰 당 500 마이크로 리터 RPMI로 시드합니다. 5% 이산화탄소의 밑에 섭씨 37도에 24 시간 동안 인큐베이션하고, 0.9% 식염수로 세포를 두 번 세척하고, 완전한 RPMI 매체에서 세포를 인큐베이션합니다.고정상 리슈만편모충 종을 10개의 기생충으로 세포에 첨가하여 숙주 세포 비율로 한 다음, 섭씨 4도에서 10분 동안 720회 g으로 원심분리한다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 배양한 후 0.9% 식염수로 세포를 두 번 세척하여 내재화되지 않은 프로마스티고테를 제거합니다. 세포를 섭씨 37도의 보충된 RPMI 배지에서 1시간 동안 배양한 다음, 세포를 4%PFA로 15분 동안 고정합니다.그런 다음 선호하는 장착 미디어를 사용하여 커버슬립을 장착합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 무작위 필드에서 최소 400개의 세포를 계수합니다. 리슈만편모충 유도 PV 생물발생을 조사하려면 밀리리터 PMA당 100나노그램이 보충된 10밀리리터의 Complete RPMI 배지가 포함된 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 1,500만 개의 THP-1 세포를 시딩하여 THP-1 세포를 플라스미드로 형질감염을 시작하고 48시간 동안 메르캅토에탄올에 50마이크로몰을 투여합니다.그런 다음 0.9% 식염수에서 세포를 한 번 세척하고 비효소 세포 해리 용액을 사용하여 세포를 분리합니다. 이어서, 실온에서 5분 동안 250회 g으로 원심분리한다. 다음으로, THP-1 세포를 1밀리리터의 RPMI 배지에 재현탁시키고 노이바우어 챔버에서 계수를 수행한다.세포를 다시 250회 g에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 100 마이크로 리터의 Nucleofector 용액에 2 백만 개의 세포를 재현탁하고 형광 단백질로 태그 된 관심 단백질에 대해 0.5 마이크로 그램의 플라스미드 코팅으로 배양합니다. THP-1 세포 및 핵산을 함유하는 현탁액을 뉴클레오펙터 큐벳으로 옮긴다.이어서, 뉴클레펙터 프로그램 Y를 사용하여 세포를 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 회수하고 13mm 유리 커버슬립이 있는 24웰 플레이트의 500마이크로리터의 RPMI 배지에 시드합니다. 세포를 배양하고 RPMI 배지를 섭씨 37도에서 0.5, 2, 4, 6, 12 및 24시간 동안 배양합니다.13mm 유리 커버슬립을 실온에 두고 획득 최소 30분 전에 빛으로부터 보호하십시오. 흡수성 티슈로 커버 슬립을 청소하십시오. 그런 다음 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 추가한 다음 슬라이드를 추가합니다.오일이 슬라이드에 닿을 때까지 대물렌즈를 위로 이동합니다. 현미경의 초점을 관찰 및 조정하고 오일이 포함된 옵션 63x 대물렌즈를 선택합니다. LIQA 프로그램을 열고 488, 552 및 405 파장의 레이저를 조정합니다.이미지 해상도를 1024 x 1024로 선택합니다. 라이브 버튼을 클릭 한 후 Z 스택을 설정하고 시작 옵션을 누릅니다. 이미지 획득을 기다린 다음 도구에서 최대 투영 옵션을 선택합니다.실험을 저장하고 TIFF 형식 이미지를 컴퓨터로 내보냅니다. 결과는 Leishmania Braziliensis LCL 및 Leishmania Braziliensis DL이 대식세포에 유사하게 결합하는 것으로 나타났습니다. 또한, 숙주 세포에 의한 리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 및 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL 식균작용에 대해서는 차이가 관찰되지 않았다.리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 또는 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL에 의해 유도된 기생 액포 또는 PV에 LC3의 모집을 감염된 세포에서 비교했습니다. 감염 4시간 후, 리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 및 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL에 감염된 대식세포에서 유사한 비율의 LC3-장식 PV가 관찰되었다. 따라서, 결과는 리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 및 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL이 LC3 모집과 관련하여 PV의 결합, 식균작용 및 생물발생 동안 대식세포와 유사하게 상호작용한다는 것을 보여주었다.대표적인 현미경 이미지는 THP-1 세포를 PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP 플라스미드로 효율적으로 형질감염시키는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜을 시도하는 사람들은 온도 배양에주의를 기울여야하며 모든 유형의 빛으로부터 현미경 샘플을 보호해야합니다. 리슈만편모충 식작용을 촉진하는 확인된 단백질의 발현을 조절하는 것은 리슈만편모충 감염 결과에서 이러한 단백질의 중요성을 입증할 것입니다.우리는이 기술을 치료 전략 개발을위한 기생충 설정 및 표적 식별과 관련된 다양한 유형의 병리학 연구 및 메커니즘으로 확장 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...