Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим Институт Гонсалу Мониса, Фиокрус Баия, Бразилия и отдел микроскопии за помощь. Эта работа была поддержана INOVA-FIOCRUZ номером 79700287000, P.S.T.V. владеет грантом на продуктивность в исследованиях от CNPq (305235/2019-2). Плазмиды были любезно предоставлены Маурисио Теребизником, Университет Торонто, Калифорния. Авторы хотели бы поблагодарить Андриса К. Уолтера за редактирование на английском языке и помощь в редактировании рукописей.

Клетки были получены от здоровых доноров после утверждения процедур Национальными комитетами по этике исследований (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Клеточные культуры
<ol><li>Макрофаги, полученные из моноцитов человека ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить макрофаги человеческого моноцитарног...

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages.">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li><li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania-macrophage+interactions:+multiple+receptors,+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses.">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li><li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+Leishmania+infection.">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li><li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages.">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li><li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani+lipophosphoglycan+causes+periphagosomal+actin+accumulation:+correlation+with+impaired+translocation+of+PKCalpha+and+defective+phagosome+maturation.">Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation.</a> Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).</li><li>Vergne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).</li><li>Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages.">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection.">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response:+a+signaling+point+of+view.">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Ligase+Smurf1+Functions+in+Selective+Autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Anti-tuberculous+Host+Defense.">The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense.</a> Cell Host &amp; Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li><li>Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane.">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis.">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase.">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li><li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+rab5+activation+in+endocytosis+and+phagocytosis.">Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).</li><li>Vitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+small+GTPase+Rab7+in+the+late+endocytic+pathway.">Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).</li><li>Matte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+major+Promastigotes+Evade+LC3-Associated+Phagocytosis+through+the+Action+of+GP63.">Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63.</a> PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).</li><li>Dias, B. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+Induction+Greatly+Enhances+Leishmania+major+Intracellular+Survival+Compared+to+Leishmania+amazonensis+in+CBA/j-Infected+Macrophages.">Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).</li><li>Babcock, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+phagocytosis+by+confocal+microscopy.">Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).</li><li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+and+phagocytosis:+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis.">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li><li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

Взаимодействие лейшмании и макрофага является сложным процессом и включает в себя несколько этапов, которые могут влиять на развитие заболевания5. Чтобы лучше понять механизмы, участвующие во взаимодействии неопсонизированной лейшмании и клеток-хозяев, мы опис?...

Лейшманиоз является запущенным тропическим заболеванием, вызываемым простейшими паразитами рода Leishmania, приводящим к широкому спектру клинических проявлений у позвоночного хозяина, включая кожный лейшманиоз, слизисто-кожный лейшманиоз и висцеральный лейшманиоз1. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более одного миллиарда человек находятся в группе риска, причем более одного миллиона новых случаев регистрируются в год2.
Leishmania spp. являются облигатными внутриклеточными простейшими, которые выживают внутри клеток-хозяев, включая моноциты, макрофаги и дендритные клетки3. Взаимодействие лейшмании и макрофагов представляет собой сложный процесс, который включает в себя несколько рецепторов клеток-хозяев и лигандов паразитов либо путем прямого взаимодействия, либо путем опсонизации с участием рецепторов комплемента 4,5. Классические поверхностные рецепторы, такие как CR1, CR3, манноза-фукоза, фибронектин, толл-подобные и поглотители рецепторов, опосредуют прикрепление паразитов к макрофагам 6,7,8. Эти рецепторы распознают молекулы на поверхности лейшмании, включая гликопротеин 63 кДа (gp63) и гликолипидный липофосфогликан (LPG)9. Это наиболее распространенные молекулы на поверхности промастиготов и играют важную роль в подрыве иммунного ответа хозяина, способствуя установлению паразитарной инфекции в клетках млекопитающих10. После того, как поверхностные лиганды паразитов связываются с рецепторами макрофагов, F-актин накапливается на клеточных поверхностях млекопитающих, окружающих паразитов по мере их фагоцитоза. Впоследствии это приводит к образованию паразитарно-индуцированного компартмента, называемого паразитофорной вакуолей (PV), который представляет фаголисосомальные признаки11. Попав внутрь этих фаголизосом, паразиты претерпевают несколько изменений, необходимых для выживания и размножения3.
Биогенез PV представляет собой высоко регулируемый процесс мембранного трафика, критически важный для внутриклеточной выживаемости этого патогена12. Образование этого компартмента происходит в результате последовательных слияний между фагосомами и компартментами эндоцитарного пути хозяина. Классические исследования клеточной биологии показали, что созревание PV включает в себя приобретение мономерного G-белка Rab 5 и rab 7 белков, которые в основном связаны с ранним и поздним созреванием эндосом соответственно13. Кроме того, эти компартменты приобретают лизосомно-ассоциированные мембранные белки 1 и 2 (LAMP 1, LAMP 2), основные белковые составляющие лизосомальной мембраны и микротрубочки-ассоциированный белок 1A/1B-световая цепь 3 (LC3), аутофагосомный маркер14. Несмотря на кажущееся сходство, кинетика PV-образования15,16 и морфология этих компартментов варьируются в зависимости от вида Leishmania. Например, инфекция, вызванная L. mexicana или L. amazonensis, вызывает образование крупных компартментов, содержащих большое количество паразитов17. Напротив, другие виды, такие как L. braziliensis и L. infantum, образуют более мелкие вакуоли, которые обычно содержат только одного или двух паразитов в каждой вакуоле18.
Несмотря на эти знания, связанные с взаимодействием клетки-хозяина и лейшмании, первоначальные события, вызванные контактом между рецепторами хозяина и лигандами паразитов, не были полностью выяснены. Эти события, как известно, являются детерминантами исхода заражения паразитами и зависят от видов паразитов, типа рецепторов клеток-хозяев, набираемых для распознавания паразитов, и активации сигнальных путей макрофагов19,20. Поэтому важно идентифицировать молекулы, участвующие в биогенезе Индуцированных Лейшманией ПВ, и определить роль (роли), которую играют эти молекулы в установлении инфекции и исходе. Здесь мы описываем метод мониторинга ранних событий, происходящих во время фагоцитоза лейшмании, включая связывание, интернализацию, образование и созревание фагосом. Эта работа может помочь прояснить участие PLC, Akt, Rab5, Rab7 и LC3 в формировании PV, индуцированных различными видами Leishmania. Важно отметить, что этот протокол может быть использован для исследования участия других белков, участвующих в pv-созревании. Будущие исследования расширят знания, связанные с механизмами, участвующими во взаимодействии клеток лейшмании и хозяина, и внесут вклад в разработку новых химиотерапевтических стратегий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

Фагоцитоз — это организованный процесс, который включает в себя различные этапы: распознавание, связывание и интернализацию. Профессиональные фагоциты поглощают паразитов Лейшмании путем фагоцитоза, состоящего из распознавания лигандов на поверхностях паразитов несколькими рецепторами клеток-хозяев. Связывание лейшмании с мембранами макрофагов происходит через рецептор комплемента типа 1 (CR1) и рецептор комплемента типа 3 (CR3) и рецепторы распознавания образов. Липофосфогликан (LPG) и гликопротеин 63 кДа (gp63) являются основными лигандами, участвующими во взаимодействиях макрофагов и лейшмании . После первоначального распознавания лигандов паразитов рецепторами клеток-хозяев паразиты интернализируются, выживают и размножаются в паразитофорных вакуолях. Процесс созревания вакуолей, индуцированных лейшманией, включает в себя приобретение молекул из внутриклеточных везикул, включая мономерный G-белок Rab 5 и Rab 7, лизосомально-ассоциированный мембранный белок 1 (LAMP-1), лизосомно-ассоциированный мембранный белок 2 (LAMP-2) и микротрубочко-ассоциированный белок 1A/1B-легкая цепь 3 (LC3).
Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами с использованием конфокальной микроскопии, включая (i) связывание,ii) интернализацию и (iii) созревание фагосом. Добавляя к совокупности знаний, окружающих эти детерминанты исхода инфекции, мы надеемся улучшить понимание патогенеза инфекции Leishmania и поддержать возможный поиск новых химиотерапевтических целей.

Этот отчет направлен на оценку ранних событий, происходящих во время фагоцитоза L. braziliensis , выделенного у пациентов с L . braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL формой CL. Используя конфокальную микроскопию, мы исследовали основные события, связанные с фагоцитозом паразитов: связывание, ин?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Механизм, связанный с фагоцитозом при инфекции Leishmania , остается плохо изученным. Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами.

Исследование фагоцитоза лейшмании с помощью конфокальной микроскопии

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Механизм, связанный с фагоцитозом при инфекции Leishmania, остается плохо изученным. Здесь мы описываем методы оценки ранних состояний излечения во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами. Данная методика представляет собой главное преимущество, позволяющее изучать различные состояния фагоцитоза лейшмании и участие нескольких белков.Стоит отметить, что этот метод также может быть распространен на другие типы исследований, включая заражение бактериями, дрожжами или поглощение другими типами клеток. Люди, пробующие эту технику, должны позаботиться о времени воздействия на клетки раствора нуклеофектора. Кроме того, мы предлагаем начать тестирование трансфекции с использованием максимум двух плазмид.Продемонстрировать процедуру будет Аманда Ребукас, аспирант из нашей лаборатории. Начнем с того, что посейте 0,2 миллиона клеток THP-1 или человеческих моноцитарных макрофагов в 500 микролитров RPMI на скважину на 24-луночную пластину с 13-миллиметровыми стеклянными крышками. Инкубируйте в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия при 5% углекислого газа, дважды промывайте клетки 0,9% физиологическим раствором и инкубируйте клетки в полной среде RPMI.Добавьте стационарную фазу вида Leishmania к клеткам при 10 паразитов с соотношением клеток-хозяев, а затем центрифугу в 720 раз в g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После инкубации клеток при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут дважды промывайте клетки 0,9% физиологическим раствором, чтобы удалить любые неинтернализованные промастиготы. Инкубируйте клетки в дополненной RPMI среде при 37 градусах Цельсия в течение одного часа, а затем зафиксируйте клетки с 4% PFA в течение 15 минут.Затем смонтируйте крышки с помощью предпочтительного монтажного носителя. Затем подсчитайте не менее 400 клеток в случайных полях под флуоресцентным микроскопом. Чтобы исследовать биогенез PV, вызванный лейшманией, начните трансфектацию клеток THP-1 плазмидой, посеяв 15 миллионов клеток THP-1 в колбы для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров, содержащие 10 миллилитров Complete RPMI Medium, дополненных 100 нанограммами на миллилитр PMA, и 50 микромоляров в меркаптоэтанол в течение 48 часов.Затем промыть клетки один раз в 0,9% физиологическом растворе и отделить клетки с помощью неферментативного раствора для диссоциации клеток. Затем центрифугируют в 250 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируйте ячейки THP-1 в одном миллилитре RPMI Medium и выполните подсчет в камере Нойбауэра.Центрифугируют клетки снова в 250 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант. Повторно суспендировать 2 миллиона клеток в 100 микролитрах раствора нуклеофектора и инкубировать с 0,5 мкг плазмидного покрытия для интересующего белка, помеченного флуоресцентным белком. Перенесите суспензию, содержащую клетки THP-1 и нуклеиновую кислоту, в кювету нуклеофектора.Затем трансфектируйте клетки с помощью программы Нуклеофектора Y one. Восстановите трансфектированные клетки и посейте семена в 500 микролитров RPMI Medium на 24 пластинах скважины с 13-миллиметровыми стеклянными крышками. Инкубируйте клетки и полную rpmI-среду при 37 градусах Цельсия в течение 0,5, 2, 4, 6, 12 и 24 часов.Оставьте 13-миллиметровые стеклянные крышки при комнатной температуре и защитите их от света не менее чем за 30 минут до приобретения. Очистите покровы абсорбирующей тканью. Затем добавьте каплю погружного масла к объекту, а затем добавьте слайд.Перемещайте объектив вверх, пока масло не коснется слайда. Наблюдайте и регулируйте фокусировку на микроскопе и выбирайте вариант объектива 63x с маслом. Откройте программу LIQA и отрегулируйте лазеры на длинах волн 488, 552 и 405.Выберите разрешение изображения 1024 x 1024. После нажатия на живую кнопку установите Z-стек и нажмите опцию start. Дождитесь получения изображения, а затем выберите опцию максимальная проекция в инструментах.Сохраните эксперимент и экспортируйте изображения в формате TIFF на компьютер. Результаты показали, что и Leishmania Braziliensis LCL, и Leishmania Braziliensis DL, аналогично связываются с макрофагами. Кроме того, не наблюдалось различий в отношении Leishmania Braziliensis LCL и Leishmania Braziliensis DL фагоцитоза клетками-хозяевами.Рекрутирование LC3 в паразитофорную вакуоль, или PV, индуцированную Leishmania Braziliensis LCL или Leishmania Braziliensis DL, сравнивали в инфицированных клетках. После четырех часов заражения наблюдался аналогичный процент pv-элементов, украшенных LC3, у зараженных макрофагов Leishmania Braziliensis LCL и Leishmania Braziliensis DL. Таким образом, результаты показали, что Leishmania Braziliensis LCL и Leishmania Braziliensis DL одинаково взаимодействуют с макрофагами во время связывания, фагоцитоза и биогенеза PV относительно рекрутирования LC3.Репрезентативные микроскопические изображения продемонстрировали эффективную трансфекцию клеток THP-1 с помощью плазмид PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Люди, пробующие этот протокол, должны обращать внимание на температурную инкубацию и защищать образцы микроскопа от света, всех типов. Модуляция экспрессии идентифицированных белков, ускоряющих фагоцитоз лейшмании, продемонстрирует важность этих белков в исходе инфекции лейшмании.Мы можем распространить эту технику на различные типы исследований патологии и механизмов, связанных с установлением паразитов и идентификацией мишеней для разработки терапевтических стратегий.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

В естественных изображений трансгенных Паразиты Leishmania в реальный хост

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Визуализация сотовый к клетке передачи ВИЧ-инфекции с помощью флуоресцентного клоны ВИЧ и жить конфокальной микроскопии

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Прямое наблюдение Фагоцитоз и NET-формации Нейтрофилы в Зараженные легкие с помощью 2-фотонной микроскопии

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Онлайн-клеточной видео микроскопия грибкового патогена Фагоцитоз

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Исследование действия пробиотиков на пневмококковой колонизации Использование<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Соблюдение Анализ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Прижизненные микроскопия Визуализация печени следующие<em&gt; Лейшмания</em&gt; Инфекция: оценка печеночного гемодинамики

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Новый метод для качественного многомасштабном анализа Бактериальный биопленок на нитчатых конидий с помощью конфокальной и электронной микроскопии

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...