Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Agradecemos al Instituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahía, Brasil y al departamento de microscopía por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por INOVA-Fiocruz número 79700287000, P.S.T.V. tiene una beca para productividad en investigación del CNPq (305235/2019-2). Los plásmidos fueron amablemente proporcionados por Mauricio Terebiznik, Universidad de Toronto, CA. Los autores desean agradecer a Andris K. Walter por la revisión del idioma inglés y la asistencia en la edición de manuscritos.

Las células se obtuvieron de donantes sanos tras la aprobación de los procedimientos por parte de los Comités Nacionales de Ética en Investigación (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cultivos celulares
<ol><li>Macrófagos humanos derivados de monocitos NOTA: Para obtener macrófagos derivados de monocitos humanos para la diferenciación in vitro en macrófagos, recolectar sangre de donantes sanos y purificar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como lo describen D....

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

La interacción leishmania-macrófagos es un proceso complejo e involucra varios pasos que pueden influir en el desarrollo de la enfermedad5. Para comprender mejor los mecanismos implicados en la interacción de la Leishmania no opsonizada y las células huésped, hemos descrito un protocolo que emplea microscopía de fluorescencia confocal para evaluar la fagocitosis desde las etapas tempranas hasta las últimas de la infección por Leishmania. El uso de técnicas de fl...

La leishmaniasis es una enfermedad tropical desatendida causada por parásitos protozoarios del género Leishmania, que da lugar a un amplio espectro de manifestaciones clínicas en el huésped vertebrado, incluyendo leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea y leishmaniasis visceral1. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que más de mil millones de personas están en riesgo, con más de un millón de nuevos casos reportados por año2.
Leishmania spp. son protozoos intracelulares obligados que sobreviven dentro de las células huésped, incluyendo monocitos, macrófagos y células dendríticas3. La interacción Leishmania-macrófagos es un proceso complejo que involucra múltiples receptores de células huésped y ligandos parásitos, ya sea a través de interacción directa o por opsonización que involucra receptores del complemento 4,5. Los receptores de superficie clásicos, como CR1, CR3, manosa-fucosa, fibronectina, toll-like y receptores eliminadores, median la unión del parásito a los macrófagos 6,7,8. Estos receptores reconocen moléculas en la superficie de Leishmania, incluyendo la glicoproteína de 63 kDa (gp63) y el lipofosfoglicano glicolípido (LPG)9. Estas son las moléculas más abundantes en la superficie de los promastigotes y juegan un papel esencial en la subversión de la respuesta inmune del huésped, favoreciendo el establecimiento de la infección parasitaria en células de mamíferos10. Después de que los ligandos de superficie del parásito se unen a los receptores de macrófagos, la actina F se acumula en las superficies celulares de los mamíferos, rodeando a los parásitos a medida que se fagocitan. Posteriormente, esto conduce a la formación de un compartimento inducido por parásitos denominado vacuola parasitófora (PV), que presenta características fagolisosomales11. Una vez dentro de estos fagolisomas, los parásitos sufren varias alteraciones esenciales para la supervivencia y la multiplicación3.
La biogénesis de PVs es un proceso de tráfico de membrana altamente regulado crítico para la supervivencia intracelular de este patógeno12. La formación de este compartimento resulta de eventos de fusión secuencial entre fagosomas y compartimentos de la vía endocítica del huésped. Los estudios clásicos de biología celular han revelado que la maduración de PVs implica la adquisición de proteínas monoméricas G Rab 5 y Rab 7, que se asocian principalmente con la maduración temprana y tardía del endosoma, respectivamente13. Además, estos compartimentos adquieren proteínas de membrana asociadas a lisosomas 1 y 2 (LAMP 1, LAMP 2), los principales constituyentes proteicos de la membrana lisosomal y proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador autofagosómico14. A pesar de las similitudes aparentes, la cinética de la formación de PV15,16 y la morfología de estos compartimentos varían dependiendo de las especies de Leishmania. Por ejemplo, la infección causada por L. mexicana o L. amazonensis induce la formación de grandes compartimentos que contienen un gran número de parásitos17. Por el contrario, otras especies, como L. braziliensis y L. infantum, forman vacuolas más pequeñas que normalmente contienen sólo uno o dos parásitos en cada vacuola18.
A pesar de este conocimiento que rodea la interacción entre la célula huésped y Leishmania, los eventos iniciales desencadenados por el contacto entre los receptores del huésped y los ligandos del parásito no se han dilucidado completamente. Se sabe que estos eventos son determinantes del resultado de la infección parasitaria y dependen de las especies de parásitos, el tipo de receptores de células huésped reclutados para reconocer parásitos y la activación de las vías de señalización de macrófagos19,20. Por lo tanto, es esencial identificar las moléculas involucradas en la biogénesis de PV inducidas por Leishmania y determinar el papel (s) desempeñado por estas moléculas en el establecimiento y el resultado de la infección. Aquí, describimos un método para monitorear los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de Leishmania, incluida la unión, la internalización, la formación de fagosomas y la maduración. Este trabajo podría ayudar a aclarar la participación de PLC, Akt, Rab5, Rab7 y LC3 en la formación de PVs inducidos por diferentes especies de Leishmania. Es importante destacar que este protocolo se puede utilizar para investigar la participación de otras proteínas involucradas en la maduración fotovoltaica. Los estudios futuros ampliarán el conocimiento sobre los mecanismos involucrados en la interacción Leishmania-célula huésped y contribuirán al diseño de nuevas estrategias quimioterapéuticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

La fagocitosis es un proceso orquestado que implica distintos pasos: reconocimiento, unión e internalización. Los fagocitos profesionales absorben los parásitos Leishmania por fagocitosis, que consiste en reconocer ligandos en las superficies del parásito por múltiples receptores de células huésped. La unión de Leishmania a las membranas de macrófagos ocurre a través del receptor del complemento tipo 1 (CR1) y el receptor del complemento tipo 3 (CR3) y los receptores de reconocimiento de patrones. El lipofosfoglicano (LPG) y la glicoproteína de 63 kDa (gp63) son los principales ligandos implicados en las interacciones macrófago-leishmania . Tras el reconocimiento inicial de los ligandos del parásito por los receptores de la célula huésped, los parásitos se internalizan, sobreviven y se multiplican dentro de las vacuolas parasitóforas. El proceso de maduración de las vacuolas inducidas por Leishmania implica la adquisición de moléculas de vesículas intracelulares, incluidas las proteínas G monoméricas Rab 5 y Rab 7, la proteína de membrana lisosomal asociada 1 (LAMP-1), la proteína de membrana lisosomal asociada 2 (LAMP-2) y la proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3).
Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped utilizando microscopía confocal, incluyendo (i) unión (ii) internalización y (iii) maduración del fagosoma. Al agregar al cuerpo de conocimiento que rodea estos determinantes del resultado de la infección, esperamos mejorar la comprensión de la patogénesis de la infección por Leishmania y apoyar la eventual búsqueda de nuevos objetivos quimioterapéuticos.

Este informe tiene como objetivo evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de L. braziliensis aislada de pacientes que presentan L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL forma de CL. Utilizando microscopía confocal, investigamos los principales eventos asociados con la fagocitosis de los parásitos: unión, internalización y maduración del fagosoma. Primero evaluamos la unión a L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL y la fagocitosis por macrófagos humanos...

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Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí describimos métodos para evaluar los primeros estados de curación durante la interacción de Leishmania con las células huésped. Esta técnica se presenta como principal ventaja, permitiendo el estudio de diferentes estados de fagocitosis de Leishmania y la participación de varias proteínas.Vale la pena señalar que esta técnica también se puede extender a otros tipos de estudios, incluida la infección por bacterias, levaduras o la absorción por otros tipos de células. Las personas que prueben esta técnica deben cuidar el tiempo de exposición de las células a la solución de nucleofector. Además, sugerimos comenzar a probar la transfección utilizando un máximo de dos plásmidos.Demostrando el procedimiento estará Amanda Reboucas, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para empezar, sembrar 0,2 millones de células THP-1, o macrófagos humanos derivados de monocitos en 500 microlitros RPMI por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono, lavar las células dos veces con solución salina al 0,9% e incubar las células en un medio RPMI completo.Agregar especies de Leishmania de fase estacionaria a las células en una proporción de 10 parásitos es a una célula huésped, y luego, centrifugar a 720 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de incubar las células a cuatro grados centígrados durante cinco minutos, lave las células dos veces con solución salina al 0,9% para eliminar cualquier promastigotes no internalizado. Incubar las células en RPMI medio suplementado a 37 grados centígrados durante una hora, y luego, fijar las células con 4% PFA durante 15 minutos.A continuación, monte los cubreobjetos utilizando los medios de montaje preferidos. Luego, cuente al menos 400 células en campos aleatorios bajo un microscopio de fluorescencia. Para investigar la biogénesis fotovoltaica inducida por Leishmania, comience a transfectar células THP-1 con plásmido sembrando 15 millones de células THP-1 en matraces de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados que contienen 10 mililitros de RPMI Medio completo suplementado con 100 nanogramos por mililitro PMA y 50 micromolares a mercaptoetanol durante 48 horas.Luego, lave las células una vez en solución salina al 0,9% y separe las células utilizando una solución de disociación celular no enzimática. Luego, centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, resuspenda las células THP-1 en un mililitro de RPMI Medium y realice los recuentos en una cámara Neubauer.Centrifugar las células de nuevo a 250 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Resuspender 2 millones de células en 100 microlitros de solución de Nucleofector e incubar con 0,5 microgramos del recubrimiento plásmido para la proteína de interés, marcada con una proteína fluorescente. Transfiera la suspensión que contiene células THP-1 y ácido nucleico a la cubeta Nucleofector.Luego, transfecte las células usando el programa Nucleofector Y uno. Recuperar las células transfectadas y la semilla en 500 microlitros de RPMI Medio en placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros. Incubar las células y completar RPMI Medio a 37 grados centígrados durante 0,5, 2, 4, 6, 12 y 24 horas.Deje los cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros a temperatura ambiente y protéjalos de la luz al menos 30 minutos antes de la adquisición. Limpie los cubreobjetos con tejido absorbente. A continuación, agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo y luego agregue la diapositiva.Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el aceite toque la corredera. Observe y ajuste el enfoque en el microscopio y elija la opción objetivo 63x con aceite. Abra el programa LIQA y ajuste los láseres en las longitudes de onda 488, 552 y 405.Seleccione la resolución de imagen como 1024 x 1024. Después de hacer clic en el botón en vivo, configure la pila Z y presione la opción de inicio. Espere la adquisición de la imagen y luego seleccione la opción, proyección máxima, en las herramientas.Guarde el experimento y exporte las imágenes en formato TIFF a un equipo. Los resultados mostraron que tanto Leishmania Braziliensis LCL, como Leishmania Braziliensis DL, se unen de manera similar a los macrófagos. Además, no se observaron diferencias con respecto a Leishmania Braziliensis LCL y Leishmania Braziliensis DL fagocitosis por células huésped.El reclutamiento de CL3 a la vacuola parasitófora, o PV, inducida por Leishmania Braziliensis LCL o Leishmania Braziliensis DL, se comparó en células infectadas. Después de cuatro horas de infección, se observaron porcentajes similares de PV decorados con LC3 en macrófagos infectados con Leishmania Braziliensis LCL y Leishmania Braziliensis DL. Por lo tanto, los resultados mostraron que Leishmania Braziliensis LCL y Leishmania Braziliensis DL interactúan de manera similar con los macrófagos durante la unión, la fagocitosis y la biogénesis de PV con respecto al reclutamiento de LC3.Las imágenes microscópicas representativas demostraron una transfección eficiente de células THP-1 con plásmidos PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Las personas que prueban este protocolo deben prestar atención a la incubación de temperatura y proteger las muestras de microscopio de la luz, todos los tipos. La modulación de la expresión de las proteínas identificadas que precipitan la fagocitosis de Leishmania demostrará la importancia de esas proteínas en el resultado de la infección por Leishmania.Podemos extender esta técnica hacia diferentes tipos de estudios de patología y mecanismos asociados con el establecimiento de parásitos y la identificación de dianas para el desarrollo de estrategias terapéuticas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Investigación

Inmunología e Infección

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...