Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Gonçalo Moniz Enstitüsü, Fiocruz Bahia, Brezilya ve mikroskopi bölümüne yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma INOVA-FIOCRUZ numarası 79700287000 tarafından desteklenmiştir, P.S.T.V. CNPq'dan (305235/2019-2) araştırmalarda verimlilik için bir hibeye sahiptir. Plazmidler Mauricio Terebiznik, Toronto Üniversitesi, CA tarafından nazikçe sağlandı. Yazarlar, İngilizce revizyonu ve el yazması kopya düzenleme yardımı için Andris K. Walter'a teşekkür eder.

Ulusal Araştırma Etik Kurulları (ID: 94648218.8.0000.0040) tarafından prosedürlerin onaylanmasını takiben sağlıklı donörlerden hücreler elde edilmiştir.
1. Hücre kültürleri
<ol><li>İnsan monosit türevi makrofajlar NOT: Makrofajlara in vitro farklılaşma için insan monosit türevi makrofajlar elde etmek için, sağlıklı donörlerden kan toplayın ve D. English ve B. R. Andersen21 tarafından tanımlandığı gibi periferik kan mononük...

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages.">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li><li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania-macrophage+interactions:+multiple+receptors,+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses.">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li><li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+Leishmania+infection.">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li><li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages.">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li><li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani+lipophosphoglycan+causes+periphagosomal+actin+accumulation:+correlation+with+impaired+translocation+of+PKCalpha+and+defective+phagosome+maturation.">Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation.</a> Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).</li><li>Vergne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).</li><li>Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages.">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection.">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response:+a+signaling+point+of+view.">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Ligase+Smurf1+Functions+in+Selective+Autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Anti-tuberculous+Host+Defense.">The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense.</a> Cell Host &amp; Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li><li>Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane.">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis.">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase.">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li><li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+rab5+activation+in+endocytosis+and+phagocytosis.">Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).</li><li>Vitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+small+GTPase+Rab7+in+the+late+endocytic+pathway.">Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).</li><li>Matte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+major+Promastigotes+Evade+LC3-Associated+Phagocytosis+through+the+Action+of+GP63.">Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63.</a> PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).</li><li>Dias, B. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+Induction+Greatly+Enhances+Leishmania+major+Intracellular+Survival+Compared+to+Leishmania+amazonensis+in+CBA/j-Infected+Macrophages.">Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).</li><li>Babcock, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+phagocytosis+by+confocal+microscopy.">Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).</li><li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+and+phagocytosis:+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis.">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li><li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

Leishmania-makrofaj etkileşimi karmaşık bir süreçtir ve hastalık gelişimini etkileyebilecek birkaç adım içerir5. Opsonize edilmemiş Leishmania ve konakçı hücrelerin etkileşiminde yer alan mekanizmaları daha iyi anlamak için, Leishmania enfeksiyonunun erken ve geç evrelerinden fagositozu değerlendirmek için konfokal floresan mikroskobu kullanan bir protokol tanımladık. İmmünoetiketleme ve floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu da dahil olmak ü...

Leishmaniasis, Leishmania cinsinin protozoan parazitlerinin neden olduğu, omurgalı konakçıda kutanöz leishmaniasis, mukokutanöz leishmaniasis ve viseral leishmaniasis 1 dahil olmak üzere geniş bir klinik bulgu spektrumuna neden olan ihmal edilmiş tropikal bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), bir milyardan fazla insanın risk altında olduğunu ve yılda bir milyondan fazla yeni vaka bildirildiğini tahmin etmektedir2.
Leishmania spp., monositler, makrofajlar ve dendritik hücreler dahil olmak üzere konakçı hücrelerin içinde hayatta kalan zorunlu hücre içi protozoanlardır3. Leishmania-makrofaj etkileşimi, doğrudan etkileşim yoluyla veya kompleman reseptörlerini içeren opsonizasyon yoluyla çoklu konakçı hücre reseptörlerini ve parazit ligandlarını içeren karmaşık bir süreçtir 4,5. CR1, CR3, mannoz-fukoz, fibronektin, toll-like ve çöpçü reseptörleri gibi klasik yüzey reseptörleri, makrofajlara parazit bağlanmasına aracılık eder 6,7,8. Bu reseptörler, 63 kDa glikoprotein (gp63) ve glikolipid lipofosfoglikan (LPG)9 dahil olmak üzere Leishmania yüzeyindeki molekülleri tanır. Bunlar promastigotların yüzeyindeki en bol moleküllerdir ve konakçı bağışıklık tepkisinin yıkılmasında önemli bir rol oynar ve memeli hücrelerinde parazit enfeksiyonunun kurulmasını destekler10. Parazit yüzey ligandları makrofaj reseptörlerine bağlandıktan sonra, F-aktin, memeli hücre yüzeylerinde birikir ve parazitleri fagositonize edildikçe çevreler. Daha sonra, bu, fazolizozomal özellikler11 sunan parazit kaynaklı bir bölmenin oluşumuna yol açar parazitoforlu vakuol (PV). Bu fagolizozomların içine girdikten sonra, parazitler hayatta kalma ve çoğalma için gerekli olan çeşitli değişikliklere uğrar3.
PV'lerin biyogenezi, bu patojenin hücre içi sağkalımı için kritik öneme sahip, yüksek oranda düzenlenmiş bir membran kaçakçılığı sürecidir12. Bu kompartmanın oluşumu, konakçı endositik yolun fagozomları ve kompartmanları arasındaki sıralı füzyon olaylarından kaynaklanır. Klasik hücre biyolojisi çalışmaları, PV'lerin olgunlaşmasının, esas olarak sırasıyla erken ve geç endozom olgunlaşması ile ilişkili olan monomerik G proteini Rab 5 ve Rab 7 proteinlerinin edinilmesini içerdiğini ortaya koymuştur,13. Ek olarak, bu bölmeler, lizozomla ilişkili membran proteinleri 1 ve 2'yi (LAMP 1, LAMP 2), lizozomal membranın ana protein bileşenlerini ve bir otofagozom belirteci14 olan mikrotübülle ilişkili protein 1A / 1B-hafif zincir 3'ü (LC3) elde eder. Belirgin benzerliklere rağmen, PV oluşumunun kinetiği15,16 ve bu bölmelerin morfolojisi Leishmania türlerine bağlı olarak değişir. Örneğin, L. mexicana veya L. amazonensis'in neden olduğu enfeksiyon, çok sayıda parazit içeren büyük bölmelerin oluşumunu tetikler17. Buna karşılık, L. braziliensis ve L. infantum gibi diğer türler, normalde her vakuol18'de sadece bir veya iki parazit içeren daha küçük vakuoller oluşturur.
Konakçı hücre-Leishmania etkileşimini çevreleyen bu bilgiye rağmen, konakçı reseptörleri ve parazit ligandları arasındaki temasın tetiklediği ilk olaylar tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu olayların parazit enfeksiyonunun sonucunun belirleyicileri olduğu bilinmektedir ve parazit türlerine, parazitleri tanımak için işe alınan konakçı hücre reseptörlerinin tipine ve makrofaj sinyal yolaklarının aktivasyonuna bağlıdır19,20. Bu nedenle, Leishmania kaynaklı PV'lerin biyogenezinde rol oynayan molekülleri tanımlamak ve bu moleküllerin enfeksiyon oluşumunda ve sonuçlarında oynadığı rolleri belirlemek önemlidir. Burada, Leishmania'nın fagositozu sırasında meydana gelen, bağlanma, içselleştirme, fagozom oluşumu ve olgunlaşma dahil olmak üzere erken olayları izlemek için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu çalışma, PLC, Akt, Rab5, Rab7 ve LC3'ün farklı Leishmania türleri tarafından indüklenen PV'lerin oluşumuna katılımını açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir. Önemli olarak, bu protokol PV olgunlaşmasında rol oynayan diğer proteinlerin katılımını araştırmak için kullanılabilir. Gelecekteki çalışmalar, Leishmania-host hücre etkileşiminde yer alan mekanizmaları çevreleyen bilgileri genişletecek ve yeni kemoterapötik stratejilerin tasarımına katkıda bulunacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

Fagositoz, farklı adımları içeren düzenlenmiş bir süreçtir: tanıma, bağlama ve içselleştirme. Profesyonel fagositler, çoklu konakçı hücre reseptörleri tarafından parazit yüzeylerindeki ligandların tanınmasından oluşan fagositoz ile Leishmania parazitlerini alırlar. Leishmania'nın makrofaj membranlarına bağlanması, kompleman reseptörü tip 1 (CR1) ve kompleman reseptörü tip 3 (CR3) ve Desen Tanıma Reseptörleri aracılığıyla gerçekleşir. Lipofosfoglikan (LPG) ve 63 kDa glikoprotein (gp63), makrofaj-Leishmania etkileşiminde rol oynayan ana ligandlardır. Parazit ligandlarının konakçı hücre reseptörleri tarafından ilk kez tanınmasını takiben, parazitler içselleştirilir, hayatta kalır ve parazitoforlu vakuoller içinde çoğalır. Leishmania kaynaklı vakuollerin olgunlaşma süreci, monomerik G proteini Rab 5 ve Rab 7, lizozomal ilişkili membran proteini 1 (LAMP-1), lizozomal ilişkili membran proteini 2 (LAMP-2) ve mikrotübül ile ilişkili protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) dahil olmak üzere hücre içi veziküllerden moleküllerin edinilmesini içerir.
Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle etkileşimi sırasında meydana gelen erken olayları konfokal mikroskopi kullanarak değerlendirmek için (i) bağlanma (ii) içselleştirme ve (iii) fagozom olgunlaşması dahil olmak üzere yöntemleri açıklıyoruz. Enfeksiyon sonucunun bu belirleyicilerini çevreleyen bilgi birikimine ekleyerek, Leishmania enfeksiyonunun patogenezinin anlaşılmasını geliştirmeyi ve yeni kemoterapötik hedefler için nihai arayışı desteklemeyi umuyoruz.

Bu rapor, CL'nin L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL formunu sunan hastalardan izole edilen L. braziliensis'in fagositozu sırasında meydana gelen erken olayları değerlendirmeyi amaçlamaktadır. konfokal mikroskopi kullanarak, parazitlerin fagositozu ile ilişkili ana olayları araştırdık: bağlanma, içselleştirme ve fagozom olgunlaşması. İlk olarak L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL bağlanmasını ve fagositozu insan monosit kaynaklı makrofajlar tarafın...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle erken kürlenme durumlarını değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır. Bu teknik, Leishmania fagositozunun farklı durumlarının incelenmesine ve birkaç proteinin katılımına izin veren ana avantaj olarak sunar.Bu tekniğin, bakteriler, mayalar veya diğer hücre türleri tarafından yutulması da dahil olmak üzere diğer çalışma türlerine de genişletilebileceğini belirtmek gerekir. Bu tekniği deneyen insanlar, hücrelerin Nükleofektör çözeltisine maruz kalma süresine dikkat etmelidir. Ek olarak, transfeksiyonu en fazla iki plazmid kullanarak test etmeye başlamanızı öneririz.Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Amanda Reboucas olacaktır. Başlangıç olarak, 0.2 milyon THP-1 hücresi veya insan monosit türevi makrofajları, kuyu başına 500 mikrolitre RPMI'da, 13 milimetrelik cam kapaklı 24 kuyucuklu bir plakaya tohumlayın. % 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin,% 0.9 salin ile hücreleri iki kez yıkayın ve hücreleri Tam RPMI Ortamında inkübe edin.10 parazitteki hücrelere sabit faz Leishmania türlerini ekleyin, bir konakçı hücre oranına sahiptir ve daha sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 720 kez g'de santrifüj yapın. Hücreleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe ettikten sonra, içselleştirilmemiş promastigotları çıkarmak için hücreleri% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile iki kez yıkayın. Hücreleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede takviyeli RPMI Ortamında inkübe edin ve ardından hücreleri% 4 PFA ile 15 dakika sabitleyin.Ardından, tercih edilen montaj ortamını kullanarak kapak fişlerini monte edin. Ardından, floresan mikroskobu altında rastgele alanlardaki en az 400 hücreyi sayın. Leishmania kaynaklı PV biyogenezini araştırmak için, 10 mililitre PMA başına 100 nanogram ve 48 saat boyunca merkaptoetanol'e 50 mikromolar ile desteklenmiş 10 mililitre Tam RPMI Medium içeren 75 santimetrekare doku kültürü şişelerinde 15 milyon THP-1 hücresini plazmidle transfekte etmeye başlayın.Daha sonra, hücreleri% 0.9 salin çözeltisinde bir kez yıkayın ve enzimatik olmayan bir hücre ayrışma çözeltisi kullanarak hücreleri ayırın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez g'de santrifüj yapın. Daha sonra, THP-1 hücrelerini bir mililitre RPMI Ortamında yeniden askıya alın ve bir Neubauer odasında sayımlar yapın.Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 kez g'de tekrar santrifüj edin ve süpernatanı atın. 100 mikrolitre Nükleofektör çözeltisinde 2 milyon hücreyi yeniden askıya alın ve bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgili protein için 0.5 mikrogram plazmid kaplama ile inkübe edin. THP-1 hücreleri ve nükleik asit içeren süspansiyonu Nükleofektör küvete aktarın.Ardından, Nucleofector programı Y one kullanarak hücreleri transfekte edin. Transfekte edilmiş hücreleri ve tohumu, 13 milimetre cam kapaklı 24 kuyucuk plakasında 500 mikrolitre RPMI Medium'da geri kazanın. Hücreleri ve Tam RPMI Ortamını 0.5, 2, 4, 6, 12 ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.13 milimetrelik cam kapakları oda sıcaklığında bırakın ve alımdan en az 30 dakika önce ışıktan koruyun. Kapak kapaklarını emici doku ile temizleyin. Ardından, hedefe bir damla daldırma yağı ekleyin ve ardından slaytı ekleyin.Yağ kızağa değene kadar hedefi yukarı doğru hareket ettirin. Mikroskoptaki odağı gözlemleyin ve ayarlayın ve yağ ile 63x objektif seçeneğini seçin. LIQA programını açın ve lazerleri 488, 552 ve 405 dalga boylarında ayarlayın.Görüntü çözünürlüğünü 1024 x 1024 olarak seçin. Canlı düğmesine tıkladıktan sonra, Z-yığınını ayarlayın ve başlat seçeneğine basın. Görüntü alımını bekleyin ve ardından araçlarda maksimum projeksiyon seçeneğini seçin.Denemeyi kaydedin ve TIFF biçimindeki görüntüleri bir bilgisayara verin. Sonuçlar, hem Leishmania Braziliensis LCL hem de Leishmania Braziliensis DL'nin makrofajlara benzer şekilde bağlandığını gösterdi. Ayrıca konakçı hücreler tarafından Leishmania Braziliensis LCL ve Leishmania Braziliensis DL fagositozu açısından fark gözlenmedi.LC3'ün Leishmania Braziliensis LCL veya Leishmania Braziliensis DL tarafından indüklenen parazitoforöz vakuol veya PV'lere alınması, enfekte olmuş hücrelerde karşılaştırıldı. Dört saatlik enfeksiyondan sonra, Leishmania Braziliensis LCL ve Leishmania Braziliensis DL ile enfekte makrofajlarda LC3 ile süslenmiş PV'lerin benzer yüzdeleri gözlendi. Bu nedenle, sonuçlar Leishmania Braziliensis LCL ve Leishmania Braziliensis DL'nin, LC3 işe alımı ile ilgili PV'lerin bağlanması, fagositozu ve biyogenezi sırasında makrofajlarla benzer şekilde etkileşime girdiğini göstermiştir.Temsili mikroskobik görüntüler, THP-1 hücrelerinin PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP plazmidleri ile etkili transfeksiyonunu göstermiştir. Bu protokolü deneyen insanlar sıcaklık inkübasyonuna dikkat etmeli ve mikroskop örneklerini ışıktan, her türden korumalıdır. Leishmania fagositozunu çökelten tanımlanmış proteinlerin ekspresyonunun modüle edilmesi, bu proteinlerin Leishmania enfeksiyonu sonucundaki önemini gösterecektir.Bu tekniği, terapötik stratejilerin geliştirilmesi için parazit oluşumu ve hedef belirleme ile ilişkili farklı patoloji çalışmalarına ve mekanizmalarına genişletebiliriz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...