Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة جين وآتوس إركو.

يتضمن هذا البروتوكول استخدام الحيوانات وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجان الأخلاقية المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها ومرفق الحيوانات في جامعة هلسنكي.
1. إعداد طبق ثقافة الجهاز
<ol><li>تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء التدفق الصفحي. نظف أسطح العمل بنسبة 70٪ من ال...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

تم استخدام زراعة الأعضاء في المختبر على نطاق واسع لدراسة الإمكانات الاستقرائية والتفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأعضاء والتشكل. أظهر مختبر Thesleff كيفية تكييف تعديل Saxén لثقافة الأعضاء من نوع Trowell واستخدامها لدراسة تطور الأسنان14. جعلت الظروف والتطورات القابلة لل...

تنمو قواطع الفأر باستمرار بسبب الحفاظ مدى الحياة على الخلايا الجذعية (SC) التي تدعم الإنتاج المستمر لمكونات الأسنان. وتشمل هذه SCs الظهارية ، التي تولد الأرومات المينائية المنتجة للمينا ، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، التي تولد الأرومات السنية المنتجة للعاج ، من بين خلايا أخرى1. تم تحديد SCs الظهارية في القواطع المتنامية باستمرار في البداية على أنها خلايا تحتفظ بالتسمية 2,3 ومنذ ذلك الحين ثبت أنها تعبر عن عدد من جينات الجذعية المعروفة ، بما في ذلك Sox24. تشترك هذه الخلايا في سمات مشتركة مع SCs الظهارية في الأعضاء الأخرى وتتواجد داخل مكانة SC تسمى حلقة عنق الرحم الموجودة على الجانب الشفوي من القاطعة. المكانة هي كيان ديناميكي يتكون من خلايا ومصفوفة خارج الخلية تتحكم في نشاط SC5. أظهرت دراسات تتبع النسب أن Sox2+ SCs الظهارية يمكنها تجديد المقصورة الظهارية بأكملها من السن وأنها ضرورية لتشكيل الأسنان المتتالية 6,7. يتم تجنيد MSCs ذات إمكانات إصلاح العاج أو التجدد إلى حد كبير من خارج العضو من خلال الأوعية الدموية والأعصاب8،9،10،11 ، وبالتالي ، توفير نموذج مناسب لدراسة التوظيف والهجرة والإسكان لسكان MSC.
إن دراسة SCs في الجسم الحي ليست ممكنة دائما ، لأن العديد من التلاعب الجيني و / أو الدوائي يمكن أن يؤثر على توازن الأعضاء و / أو يكون له عواقب مميتة. لذلك ، توفر زراعة الأعضاء أداة ممتازة لدراسة تنظيم SCs ومنافذها في المختبر. تم تطوير نظام زراعة الأعضاء الذي يستخدم شبكة معدنية في البداية بواسطة Trowell12 لدراسة تطور الأعضاء وتم تعديله بواسطة Saxen13 لدراسة الإشارات الاستقرائية في تطور الكلى. منذ ذلك الحين ، تم تطبيق هذه الطريقة في المختبر لزراعة كل أو جزء من العضو بنجاح في مجالات مختلفة. في مجال تطور الأسنان ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأسنان14 وتشكيل الأسنان المتتالية15. أظهر عمل مختبر Thesleff فائدة هذا النظام للتحليل الزمني لنمو الأسنان وتكوينها ، لتحليل تأثير الجزيئات المختلفة وعوامل النمو على نمو الأسنان ، وللتصوير الحي بفاصل زمني لتطور الأسنان16,17. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تنظيم SCs القاطعة ومكانتها18،19 ، والتي تم وصفها بالتفصيل هنا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

يعتمد نمو الأعضاء ووظيفتها وتجديدها على الخلايا الجذعية ، والتي تتواجد داخل مساحات تشريحية منفصلة تسمى منافذ الخلايا الجذعية. توفر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة. توجد الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة الظهارية للقاطعة في الطرف القريب من السن في مكان يسمى حلقة عنق الرحم. أنها توفر تدفقا مستمرا للخلايا لموازنة التآكل المستمر لطرف السن ذاتي الشحذ. يظهر هنا بروتوكول مفصل لعزل وثقافة الطرف القريب من قاطعة الفأر التي تضم الخلايا الجذعية ومكانتها. هذا هو بروتوكول زراعة الأعضاء المعدل من نوع Trowell الذي يتيح زراعة قطع الأنسجة في المختبر (explants) ، بالإضافة إلى شرائح الأنسجة السميكة في واجهة السائل / الهواء على مرشح مدعوم بشبكة معدنية. يتيح بروتوكول زراعة الأعضاء الموصوف هنا التلاعب بالأنسجة غير الممكنة في الجسم الحي ، وعندما يقترن باستخدام مراسل (مراسلين) فلوري ، فإنه يوفر منصة لتحديد وتتبع مجموعات الخلايا المنفصلة في الأنسجة الحية بمرور الوقت ، بما في ذلك الخلايا الجذعية. يمكن اختبار الجزيئات التنظيمية المختلفة والمركبات الدوائية في هذا النظام لتأثيرها على الخلايا الجذعية ومنافذها. يوفر هذا في النهاية أداة قيمة لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية وصيانتها.

توجد SCs الظهارية في مكان يسمى حلقة عنق الرحم ، والذي يقع في الطرف القريب من القاطعة (الشكل 3 أ). حلقات عنق الرحم هي هياكل متميزة شكليا تتكون من ظهارة المينا الداخلية والخارجية التي تغلف الشبكة النجمية ، وهي نواة من الخلايا الظهارية المرتبة بشكل فضفاض (الشكل 3 ب</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

تم استخدام طريقة زراعة الأعضاء من نوع Trowell لكشف شبكات الإشارات المعقدة التي تحكم نمو الأسنان ، ومؤخرا ، لدراسة التنظيم الذي ينطوي عليه الخلايا الجذعية لقاطعة الفأر التي تنمو باستمرار. تسهل النماذج الحيوانية الفلورية وطرق التصوير الحي التحليلات المتعمقة للخلايا الجذعية للأسنان وبيئتها المكروية المتخصصة.

استخدام زراعة الأعضاء من نوع Trowell لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للأسنان

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

يتم استخدام ثقافة الأعضاء من نوع Trowell لزراعة الأنسجة الخارجية. نوضح هنا كيفية استخدام هذه الطريقة لدراسة الخلايا الجذعية في الأسنان التي تنمو باستمرار. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا دراسة الخلايا الجذعية وسلوكها في مكانه وفحص تأثير الجزيئات المختلفة على بقاء الخلايا الجذعية وصيانتها.يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة الخلايا الجذعية للأعضاء الأخرى أيضا ، مثل الجلد أو الغدة الثديية. ابدأ بوضع شبكات معدنية 30 ملم مع ثقوب قطرها من ملليمتر إلى مليمترين في طبق بتري 35 ملم. املأ المكان بالوسائط حتى تصل الوسائط إلى سطح الشبكة.بعد ذلك ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم عزل الأنسجة وجاهزة للزراعة. بعد قطع رأس الفأر ، قم بإزالة الجلد لفضح الفك السفلي وقطع عضلات الفك السفلي لفصل الفك السفلي عن الفك العلوي وبقية الرأس. بمجرد عزل الفك السفلي ، قم بإزالة اللسان والحد الأقصى من الأنسجة الرخوة.تقسيم الفك السفلي في خط الوسط عن طريق قطع من خلال الارتفاق . ضع الفك السفلي في طبق بتري الذي يحتوي على PBS على الجليد. استخدم إبرة تحت الجلد يمكن التخلص منها بقياس 20 × 26 لتشريح القاطعة.بعد ذلك ، قم بتنظيف الأنسجة الرخوة والأنسجة العضلية من سطح العظام للحصول على تصور أفضل. بالنسبة للفك السفلي الذي تم الحصول عليه من الحيوانات التي يقل عمرها عن 10 أيام ، استخدم إبر تحت الجلد يمكن التخلص منها 20 × 26 لفتح كل نصف من الفك السفلي طوليا لفضح السن القاطع. افصل القاطعة برفق عن العظم المحيط.قطع الطرف القريب الذي يحتوي على حلقة عنق الرحم وإزالة المينا المعدنية ومصفوفة العاج. احتفظ بالنهايات القريبة المجمعة في برنامج تلفزيوني Dulbecco على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستزراع. بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن 10 أيام ، افتح كل نصف من الفك السفلي طوليا لفضح السن القاطع.استخدم الملقط للإمساك بالفك السفلي وكسر العظم لكشف السن. قطع النهاية القريبة التي تحتوي على حلقة عنق الرحم. احتفظ بالنهايات القريبة المجمعة في برنامج تلفزيوني Dulbecco على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستزراع.ضع بعناية مرشحات المستطيل أعلى الشبكة في طبق ثقافة تم تسخينه مسبقا وقم بتوجيه قطع الأنسجة بشكل صحيح. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ورطوبة 90 إلى 95٪. قم بتغيير الوسيط بعناية في أيام بديلة ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء.راقب نمو الأنسجة والتقط الصور يوميا. أخرج وسط الاستزراع من الطبق وأضف بعناية الميثانول المثلج إلى الأنسجة. ثم احتضنها لمدة خمس دقائق.انقل مرشحا يحمل نبتة الأنسجة إلى أنبوب أخذ العينات المملوء بمحلول التثبيت. ثبت النبات في 4٪ بارافورمالدهيد المحضر في PBS بحد أقصى بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. تتواجد الخلايا الجذعية الظهارية في مكان يسمى حلقة عنق الرحم ، وتقع في الطرف القريب من القاطعة.تتكون حلقة عنق الرحم من ظهارة مينا داخلية وخارجية تغلف الشبكة النجمية ، وهي نواة من الخلايا الظهارية المرتبة بشكل فضفاض. تحتوي كل قاطعة على حلقة عنق الرحم الشفوية وحلقة عنق الرحم اللسانية ولكن حلقة عنق الرحم الشفوية فقط هي التي تحتوي على الخلايا الجذعية. تم التقاط الطرف القريب من القاطعة ، المعزولة من فئران Sox2-GFP بعد الولادة لمدة يومين ، مما مكن من تحديد وتصور الخلايا الجذعية الظهارية القاطعة المعبرة عن Sox2.في حلقات عنق الرحم المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا Sox2-GFP و Fucci الحمراء ، تم تحديد الخلايا الجذعية الإيجابية GFP والخلايا غير التكاثرية الإيجابية Fucci-red. تم استخدام تعبير Sox2-GFP كمراسل لتحليل تأثير منشط إشارات Wnt / beta-catenin BIO ، والذي أثر سلبا على الخلايا الجذعية المعبرة عن Sox2 بالإضافة إلى تعبير GFP. يمكن تحسين هذه التقنية للتصوير المباشر لسلوك الخلايا الجذعية.يمكن أيضا معالجة النباتات المضغوطة أو المستزرعة إنزيميا إلى معلقات أحادية الخلية لمزيد من التحليل.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

طريقة دراسة حلقي فيوجن باستخدام ثابت الجهاز الثقافة

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

أساليب لدراسة Mrp4 تحتوي على المجمعات ضخم في تنظيم الخلايا الليفية الهجرة

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

عزل وإكثار بريون البروتين التعبير خلال تمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية لب الأسنان

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...