Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Jane og Aatos Erkko Foundation.

Denne protokol indebærer brug af dyr, og alle procedurer blev godkendt af etiske komitéer for brug og pleje af dyr og dyrefaciliteten ved Helsinki Universitet.
1. Tilberedning af orgelkulturskålen
<ol><li>Udfør alle procedurer i en laminær flowhætte. Rengør arbejdsflader med 70% ethanol, og brug autoklaverede glasinstrumenter og -løsninger. Steriliser saks og andet metaludstyr i en glasperlesterilisator.</li>
	<li>Forbered filtre, der normalt opbevares i 70% ethanol, ved at vaske dem...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

In vitro organkultur er blevet brugt i vid udstrækning til at studere induktivt potentiale og epitel-mesenkymale interaktioner, der styrer organvækst og morfogenese. Thesleff-laboratoriet har demonstreret, hvordan man kan tilpasse Saxén-modifikationen af Trowell-typen organkultur og bruge den til at studere tandudvikling14. De reproducerbare forhold og fremskridt inden for fluorescerende journalister har gjort dette til en nyttig metode til overvågning af tandmorfogenese og de forskel...

Musefortænder vokser kontinuerligt på grund af livslang bevarelse af stamcellerne (SC), der understøtter den uophørlige produktion af tandkomponenter. Disse omfatter epitel SC'er, som genererer emaljeproducerende ameloblaster, og mesenkymale stamceller (MSC'er), der genererer dentinproducerende odontoblaster, blandt andre celler1. Epitel-SC'erne i de stadigt voksende fortænder blev oprindeligt identificeret som etiketbevarende celler2,3 og har siden vist sig at udtrykke en række velkendte stammegener, herunder Sox24. Disse celler deler fælles træk med epitel SC'er i andre organer og bor inden for SC-nichen kaldet livmoderhalssløjfen placeret på labialsiden af fortænderne. Nichen er en dynamisk enhed sammensat af celler og ekstracellulær matrix, der styrer SC-aktivitet5. Afstamningssporingsundersøgelser har vist, at Sox2+ epitel-SC'er kan regenerere hele tandens epitelrum, og at de er afgørende for successionstanddannelse 6,7. MSC'er med dentinreparativt eller regenerativt potentiale rekrutteres stort set uden for organet gennem blodkar og nerver 8,9,10,11, hvilket giver en passende model til at studere rekruttering, migration og boliger af MSC-befolkningen.
At studere SC'er in vivo er ikke altid muligt, da mange af de genetiske og / eller farmakologiske manipulationer kan påvirke organhomeostase og / eller have dødelige konsekvenser. Derfor giver orgelkultur et glimrende værktøj til at studere regulering af SC'er og deres nicher in vitro. Orgelkultursystemet, der bruger et metalgitter, blev oprindeligt udviklet af Trowell12 for at studere organudvikling og er blevet yderligere modificeret af Saxen13 for at studere induktive signaler i nyreudvikling. Siden da er denne in vitro-metode til dyrkning af hele eller en del af orglet blevet anvendt med succes på forskellige områder. Inden for tandudvikling er denne metode blevet brugt i vid udstrækning til at studere epitel-mesenkymale interaktioner, der styrer tandudvikling14 og successionstanddannelse15. Thesleff-laboratoriets arbejde har vist nytten af dette system til tidsmæssig analyse af tandvækst og morfogenese, til analyse af virkningen af forskellige molekyler og vækstfaktorer på tandvækst og til time-lapse levende billeddannelse af tandudvikling16,17. For nylig er denne metode blevet brugt til at studere regulering af incisor SC'er og deres niche18,19, som er beskrevet detaljeret her.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

Organudvikling, funktion og regenerering afhænger af stamceller, som befinder sig inden for diskrete anatomiske rum kaldet stamcellenicher. Den kontinuerligt voksende musefortænder giver en fremragende model til at studere vævsspecifikke stamceller. De epitelvævsspecifikke stamceller i fortænderne er placeret i den proksimale ende af tanden i en niche kaldet livmoderhalssløjfen. De giver en kontinuerlig tilstrømning af celler for at opveje den konstante slid på tandens selvslibende spids. Præsenteret her er en detaljeret protokol for isolering og kultur af den proksimale ende af musefortænderne, der huser stamceller og deres niche. Dette er en modificeret Trowell-type organkulturprotokol, der muliggør in vitro-kultur af vævsstykker (explants) samt de tykke vævsskiver ved væske / luft-grænsefladen på et filter understøttet af et metalgitter. Den organkulturprotokol, der er beskrevet her, muliggør vævsmanipulationer, der ikke er mulige in vivo , og når den kombineres med brugen af en eller flere fluorescerende reportere, giver den en platform til identifikation og sporing af diskrete cellepopulationer i levende væv over tid, herunder stamceller. Forskellige regulatoriske molekyler og farmakologiske forbindelser kan testes i dette system for deres virkning på stamceller og deres nicher. Dette giver i sidste ende et værdifuldt værktøj til at studere stamcelleregulering og vedligeholdelse.

Epitel-SC'erne befinder sig i en niche kaldet livmoderhalssløjfen, som er placeret i den proksimale ende af fortænderne (figur 3A). Cervikale sløjfer er morfologisk forskellige strukturer sammensat af indre og ydre emaljeepitel, der omslutter stellatretikulumet, en kerne af løst arrangerede epitelceller (figur 3B, C). Der er to cervikale sløjfer i hver forstørrelse (figur 3A), men kun den labiale cervikale sl?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Trowell-typen organkulturmetode er blevet brugt til at optrævle komplekse signalnetværk, der styrer tandudvikling og for nylig til at studere regulering involveret i stamceller i den kontinuerligt voksende musefortænder. Fluorescerende dyremodeller og levende billeddannelsesmetoder letter dybdegående analyser af tandstamceller og deres specifikke nichemikromiljø.

Brug af Trowell-type organkultur til at studere regulering af dental stamceller

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Organkulturen af Trowell-typen bruges til at dyrke vævseksplanter. Her viser vi, hvordan man bruger denne metode til at studere stamcellerne i kontinuerligt voksende tænder. Med denne teknik kan vi studere stamcellerne og deres adfærd i nichen og screene effekten af forskellige molekyler på overlevelse og vedligeholdelse af stamceller.Denne metode kan også anvendes til at studere stamceller fra andre organer, såsom hud eller brystkirtel. Begynd med at placere 30 millimeter metalgitter med huller med en til to millimeter diameter i en 35 millimeter petriskål. Fyld stedet med medier, indtil mediet når gitteroverfladen.Derefter inkuberes pladen ved 37 grader Celsius, indtil vævet er isoleret og klar til dyrkning. Efter halshugning af musen skal du fjerne huden for at udsætte underkæben og skære gennem massetermusklerne for at adskille underkæben fra maxillaen og resten af hovedet. Når underkæben er isoleret, skal du fjerne tungen og det maksimale bløde væv.Del underkæben ved midterlinjen ved at skære gennem symfysen. Anbring underkæben i petriskålen indeholdende PBS på isen. Brug en engangs 20 x 26 gauge hypodermisk nål til at dissekere fortænderne.Rengør derefter blødt væv og muskelvæv fra knogleoverfladen for bedre visualisering. For mandibler opnået fra dyr yngre end 10 dage skal du bruge engangs 20 x 26 gauge hypodermiske nåle til at åbne hver halvdel af underkæben i længderetningen for at udsætte fortænderne. Fjern forsigtigt fortænderne fra den omgivende knogle.Skær den proksimale ende, der indeholder livmoderhalssløjfen, og fjern den mineraliserede emalje- og dentinmatrix. Opbevar de indsamlede proksimale ender i Dulbeccos PBS på is, indtil de er klar til dyrkning. For mus ældre end 10 dage skal du åbne hver halvdel af underkæben i længderetningen for at udsætte fortandet.Brug pincet til at gribe fat i underkæben og bryde knoglen for at udsætte tanden. Skær den proksimale ende, der indeholder livmoderhalssløjfen. Opbevar de indsamlede proksimale ender i Dulbeccos PBS på is, indtil de er klar til dyrkning.Placer forsigtigt rektangelfiltrene oven på gitteret i en forvarmet kulturskål og orienter vævsstykkerne korrekt. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 90 til 95% fugtighed. Skift forsigtigt mediet på alternative dage, undgå dannelse af luftbobler.Overvåg vævsvæksten og tag billeder dagligt. Fjern kulturmediet fra fadet, og tilsæt forsigtigt iskold methanol til vævet. Derefter inkuberes det i fem minutter.Overfør et filter, der bærer vævseksplanten, til prøvetagningsrøret fyldt med fastgørelsesopløsning. Fix explant i 4% paraformaldehyd fremstillet i PBS for maksimalt natten over ved fire grader Celsius. Epitelstamcellerne befinder sig i en niche kaldet livmoderhalssløjfen, der er placeret i den proksimale ende af fortænderne.Den cervikale sløjfe består af et indre og ydre emaljeepitel, der omslutter stellatretikulum, en kerne af løst arrangerede epitelceller. Hver fortænder har en labial og en lingual cervikal loop, men kun labial cervikal loop indeholder stamcellerne. Den proksimale ende af en fortand, isoleret fra to-dages postnatal Sox2-GFP-mus, blev fanget, hvilket muliggjorde identifikation og visualisering af de Sox2-ekspressive incisor epitelstamceller.I cervikale sløjfer isoleret fra Sox2-GFP og Fucci røde transgene mus blev GFP-positive stamceller og Fucci-rød-positive ikke-proliferative celler identificeret. Sox2-GFP-ekspressionen blev brugt som reporter til at analysere effekten af Wnt / beta-catenin-signalaktivator BIO, som negativt påvirkede Sox2-ekspressive stamceller såvel som GFP-ekspressionen. Denne teknik kan optimeres til levende billeddannelse af stamcelleadfærden.Pressede eller dyrkede explants kan også behandles enzymatisk til enkeltcellesuspensioner til yderligere analyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Anvendelse af Teton System til Undersøgelse molekylære mekanismer for zebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Metode til at studere Palatal Fusion hjælp Statisk Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk forordning af Cardiac Differentiering af embryonale stamceller og væv

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metoder til at studere Mrp4-holdige Makromolekylær Komplekser i forordningen af ​​fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolation, formering og Prion Protein ekspression løbet Neuronal differentiering af menneskelige Dental Pulp stamceller

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...