Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Jane and Aatos Erkko Foundation.

Dit protocol omvat het gebruik van dieren en alle procedures zijn goedgekeurd door ethische commissies voor het gebruik en de verzorging van dieren en de dierenfaciliteit aan de Universiteit van Helsinki.
1. Bereiding van de orgelcultuurschaal
<ol><li>Voer alle procedures uit in een laminaire stromingskap. Reinig werkoppervlakken met 70% ethanol en gebruik instrumenten en oplossingen van autoclaved glas. Steriliseer een schaar en andere metalen apparatuur in een sterilisator met glaskralen.<...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

In vitro orgaankweek is op grote schaal gebruikt om inductief potentieel en epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die orgaangroei en morfogenese regelen. Het Thesleff-laboratorium heeft aangetoond hoe de Saxén-modificatie van de Trowell-type orgaancultuur kan worden aangepast en gebruikt om de ontwikkeling van tanden tebestuderen 14. De reproduceerbare omstandigheden en vooruitgang in fluorescerende verslaggevers hebben dit een nuttige methode gemaakt voor het monitoren van ...

Muizensnijtanden groeien continu door levenslang behoud van de stamcellen (SC) die de onophoudelijke productie van tandcomponenten ondersteunen. Deze omvatten epitheliale SC's, die glazuurproducerende ameloblasten genereren, en mesenchymale stamcellen (MSC's), die dentineproducerende odontoblasten genereren, naast andere cellen1. De epitheliale SC's in de continu groeiende snijtanden werden aanvankelijk geïdentificeerd als labelkerende cellen 2,3 en sindsdien is aangetoond dat ze een aantal bekende stamgenen tot expressie brengen, waaronder Sox24. Deze cellen delen gemeenschappelijke kenmerken met epitheliale SC's in andere organen en bevinden zich in de SC-niche die de cervicale lus aan de labiale kant van de snijtand wordt genoemd. De niche is een dynamische entiteit die bestaat uit cellen en extracellulaire matrix die SC-activiteit5 regelen. Afstammingsonderzoeken hebben aangetoond dat Sox2+ epitheliale SC's het hele epitheliale compartiment van de tand kunnen regenereren en dat ze cruciaal zijn voor successietandvorming 6,7. MSC's met dentine herstellend of regeneratief potentieel worden grotendeels van buiten het orgaan gerekruteerd via bloedvaten en zenuwen 8,9,10,11, waardoor een geschikt model wordt geboden om werving, migratie en huisvesting van de MSC-populatie te bestuderen.
Het is niet altijd haalbaar om SC's in vivo te bestuderen, omdat veel van de genetische en /of farmacologische manipulaties de homeostase van organen kunnen beïnvloeden en / of dodelijke gevolgen kunnen hebben. Daarom biedt orgaancultuur een uitstekend hulpmiddel om de regulatie van SC's en hun niches in vitro te bestuderen. Het orgaankweeksysteem dat gebruik maakt van een metalen raster werd aanvankelijk ontwikkeld door Trowell12 om orgaanontwikkeling te bestuderen en is verder aangepast door Saxen13 om inductieve signalen in de nierontwikkeling te bestuderen. Sindsdien is deze in vitro methode om het geheel of een deel van het orgaan te kweken met succes toegepast op verschillende gebieden. Op het gebied van tandontwikkeling is deze methode op grote schaal gebruikt om de epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die de tandontwikkelingregelen 14 en de successietandvorming15. Het werk van het Thesleff-laboratorium heeft het nut van dit systeem aangetoond voor temporele analyse van tandgroei en morfogenese, voor analyse van het effect van verschillende moleculen en groeifactoren op tandgroei, en voor time-lapse live beeldvorming van tandontwikkeling 16,17. Meer recent is deze methode gebruikt om de regulatie van snijtandSC's en hun niche18,19 te bestuderen, die hier in detail wordt beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

Orgaanontwikkeling, functie en regeneratie zijn afhankelijk van stamcellen, die zich bevinden in discrete anatomische ruimtes die stamcelniches worden genoemd. De continu groeiende muizensnijtand biedt een uitstekend model om weefselspecifieke stamcellen te bestuderen. De epitheliale weefselspecifieke stamcellen van de snijtand bevinden zich aan het proximale uiteinde van de tand in een nis die de cervicale lus wordt genoemd. Ze zorgen voor een continue instroom van cellen om de constante slijtage van de zelfslijpende punt van de tand te compenseren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de isolatie en cultuur van het proximale uiteinde van de muizensnijder die stamcellen en hun niche herbergt. Dit is een gemodificeerd Trowell-type orgaankweekprotocol dat in vitro kweek van weefselstukken (explantaten) mogelijk maakt, evenals de dikke weefselplakken op de vloeistof / lucht-interface op een filter ondersteund door een metalen rooster. Het hier beschreven orgaankweekprotocol maakt weefselmanipulaties mogelijk die in vivo niet haalbaar zijn, en in combinatie met het gebruik van een fluorescerende verslaggever (s), biedt het een platform voor de identificatie en tracking van discrete celpopulaties in levende weefsels in de loop van de tijd, inclusief stamcellen. Verschillende regulerende moleculen en farmacologische verbindingen kunnen in dit systeem worden getest op hun effect op stamcellen en hun niches. Dit biedt uiteindelijk een waardevol hulpmiddel om stamcelregulatie en -onderhoud te bestuderen.

De epitheliale SC's bevinden zich in een niche die de cervicale lus wordt genoemd, die zich aan het proximale uiteinde van de snijtand bevindt (figuur 3A). Cervicale lussen zijn morfologisch verschillende structuren die bestaan uit binnenste en buitenste glazuurepitheel die het stellaire reticulum omhullen, een kern van losjes gerangschikte epitheelcellen (figuur 3B,C). Er zijn twee cervicale lussen in elke snijtand (figuur ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

De Trowell-type orgaankweekmethode is gebruikt om complexe signaleringsnetwerken te ontrafelen die de tandontwikkeling regelen en, meer recent, voor het bestuderen van regulatie die betrokken is bij stamcellen van de continu groeiende muizensnijder. Fluorescerende reporter diermodellen en live-imaging methoden vergemakkelijken diepgaande analyses van tandheelkundige stamcellen en hun specifieke niche micro-omgeving.

Gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

De Trowell-type orgaankweek wordt gebruikt om weefselexplantaten te kweken. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om de stamcellen in continu groeiende tanden te bestuderen. Met deze techniek kunnen we de stamcellen en hun gedrag in de niche bestuderen en het effect van verschillende moleculen op de overleving en het onderhoud van stamcellen screenen.Deze methode kan worden toegepast om ook de stamcellen van andere organen te bestuderen, zoals huid of borstklier. Begin met het plaatsen van metalen roosters van 30 millimeter met gaten met een diameter van één tot twee millimeter in een petrischaaltje van 35 millimeter. Vul de plaats met media totdat de media het rasteroppervlak bereiken.Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius totdat het weefsel is geïsoleerd en klaar is om te kweken. Verwijder na het onthoofden van de muis de huid om de onderkaak bloot te leggen en snijd door de kauwspieren om de onderkaak van de maxilla en de rest van het hoofd te scheiden. Zodra de onderkaak is geïsoleerd, verwijdert u de tong en het maximale zachte weefsel.Splits de onderkaak aan de middellijn door de symfyse door te snijden. Plaats de onderkaak in de petrischaal met PBS op het ijs. Gebruik een wegwerpbare injectienaald van 20 bij 26 gauge om de snijtand te ontleden.Reinig vervolgens het zachte weefsel en spierweefsel van het botoppervlak voor een betere visualisatie. Gebruik voor kaken verkregen van dieren jonger dan 10 dagen 20 bij 26 wegwerpbare injectienaalden om elke helft van de onderkaak in de lengterichting te openen om de snijtand bloot te leggen. Maak de snijtand voorzichtig los van het omliggende bot.Snijd het proximale uiteinde dat de cervicale lus bevat en verwijder het gemineraliseerde glazuur en dentinematrix. Bewaar de verzamelde proximale uiteinden in Dulbecco's PBS op ijs totdat ze klaar zijn om te kweken. Voor muizen ouder dan 10 dagen, open elke helft van de onderkaak in de lengterichting om de snijtand bloot te leggen.Gebruik een pincet om de onderkaak vast te pakken en het bot te breken om de tand bloot te leggen. Snijd het proximale uiteinde dat de cervicale lus bevat. Bewaar de verzamelde proximale uiteinden in Dulbecco's PBS op ijs totdat ze klaar zijn om te kweken.Plaats de rechthoekige filters voorzichtig bovenop het rooster in een voorverwarmde kweekschaal en oriënteer de stukjes weefsel goed. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 90 tot 95% vochtigheid. Verander het medium voorzichtig op alternatieve dagen en vermijd de vorming van luchtbellen.Monitor de weefselgroei en leg dagelijks beelden vast. Haal het kweekmedium uit de schaal en voeg voorzichtig ijskoude methanol toe aan het weefsel. Incubeer het vervolgens gedurende vijf minuten.Breng een filter dat de weefselexplant draagt over naar de bemonsteringsbuis gevuld met bevestigingsoplossing. Bevestig de explant in 4% paraformaldehyde bereid in PBS voor maximale nacht op vier graden Celsius. De epitheelstamcellen bevinden zich in een niche die de cervicale lus wordt genoemd, gelegen aan het proximale uiteinde van de snijtand.De cervicale lus bestaat uit een binnen- en buitenste glazuurepitheel dat het stellaire reticulum omhult, een kern van losjes gerangschikte epitheelcellen. Elke snijtand heeft één labiale en één linguale cervicale lus, maar alleen de labiale cervicale lus bevat de stamcellen. Het proximale uiteinde van een snijtand, geïsoleerd uit tweedaagse postnatale Sox2-GFP-muizen, werd gevangen, waardoor de identificatie en visualisatie van de Sox2-expresserende snij-epitheel stamcellen mogelijk werd.In cervicale lussen geïsoleerd uit de Sox2-GFP en Fucci rode transgene muizen, werden GFP-positieve stamcellen en Fucci-rood-positieve niet-proliferatieve cellen geïdentificeerd. De Sox2-GFP-expressie werd gebruikt als een verslaggever om het effect van Wnt / beta-catenine signalering activator BIO te analyseren, die sox2-expresserende stamcellen negatief beïnvloedde, evenals de GFP-expressie. Deze techniek kan worden geoptimaliseerd voor live beeldvorming van het stamcelgedrag.Geperste of gekweekte explantaten kunnen ook enzymatisch worden verwerkt tot eencellige suspensies voor verdere analyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Methoden om-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen studie in de verordening van fibroblast migratie

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...