Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
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Diese Studie wurde von der Jane and Aatos Erkko Foundation unterstützt.

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Tieren und alle Verfahren wurden von den Ethikkommissionen für die Verwendung und Pflege von Tieren und der Tiereinrichtung der Universität Helsinki genehmigt.
1. Zubereitung der Organkulturschale
<ol><li>Führen Sie alle Verfahren in einer Laminar-Flow-Haube durch. Reinigen Sie Arbeitsflächen mit 70% Ethanol und verwenden Sie Instrumente und Lösungen aus autoklaviertem Glas. Sterilisieren Sie Scheren und andere Metallgeräte in einem Glaspe...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

In-vitro-Organkultur wurde ausgiebig verwendet, um induktives Potenzial und epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen zu untersuchen, die das Organwachstum und die Morphogenese steuern. Das Thesleff-Labor hat gezeigt, wie die Saxén-Modifikation der Organkultur vom Trowell-Typ angepasst und zur Untersuchung der Zahnentwicklung verwendet werden kann14. Die reproduzierbaren Bedingungen und Fortschritte bei fluoreszierenden Reportern haben dies zu einer nützlichen Methode zur Überwachung de...

Mausschneidezähne wachsen kontinuierlich aufgrund der lebenslangen Erhaltung der Stammzellen (SC), die die unaufhörliche Produktion von Zahnkomponenten unterstützen. Dazu gehören epitheliale SCs, die unter anderem schmelzproduzierende Ameloblasten erzeugen, und mesenchymale Stammzellen (MSCs), die Dentin produzierende Odontoblasten erzeugen1. Die epithelialen SCs in den kontinuierlich wachsenden Schneidezähnen wurden zunächst als markierungserhaltende Zellen2,3 identifiziert und es wurde seitdem gezeigt, dass sie eine Reihe bekannter Stammnessgene, einschließlich Sox24, exprimieren. Diese Zellen teilen gemeinsame Merkmale mit epithelialen SCs in anderen Organen und befinden sich in der SC-Nische, die als zervikale Schleife auf der labialen Seite des Schneidezahns bezeichnet wird. Die Nische ist eine dynamische Einheit, die aus Zellen und extrazellulärer Matrix besteht, die die SC-Aktivitätsteuern 5. Studien zur Linienverfolgung haben gezeigt, dass Sox2+ epitheliale SCs das gesamte Epithelkompartiment des Zahnes regenerieren können und dass sie für die Sukzessionszahnbildung entscheidend sind 6,7. MSCs mit reparativem oder regenerativem Dentinpotenzial werden größtenteils von außerhalb des Organs über Blutgefäße und Nerven 8,9,10,11 rekrutiert und bieten daher ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Rekrutierung, Migration und Unterbringung der MSC-Population.
Die Untersuchung von SCs in vivo ist nicht immer möglich, da viele der genetischen und/oder pharmakologischen Manipulationen die Organhomöostase beeinträchtigen und/oder tödliche Folgen haben können. Daher bietet die Organkultur ein hervorragendes Werkzeug, um die Regulation von SCs und ihren Nischen in vitro zu untersuchen. Das Organkultursystem, das ein Metallgitter verwendet, wurde ursprünglich von Trowell12 entwickelt, um die Organentwicklung zu untersuchen, und wurde von Saxen13 weiter modifiziert, um induktive Signale in der Nierenentwicklung zu untersuchen. Seitdem wird diese In-vitro-Methode zur Kultivierung des gesamten oder eines Teils des Organs in verschiedenen Bereichen erfolgreich angewendet. Im Bereich der Zahnentwicklung wurde diese Methode häufig verwendet, um die epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Zahnentwicklung14 und die Sukzessionszahnbildung15 steuern. Die Arbeit des Thesleff-Labors hat den Nutzen dieses Systems für die zeitliche Analyse des Zahnwachstums und der Morphogenese, für die Analyse der Wirkung verschiedener Moleküle und Wachstumsfaktoren auf das Zahnwachstum und für die Zeitraffer-Live-Bildgebung der Zahnentwicklung gezeigt16,17. In jüngerer Zeit wurde diese Methode verwendet, um die Regulation von Schneidezahn-SCs und ihrer Nische18,19 zu untersuchen, die hier ausführlich beschrieben wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

Organentwicklung, -funktion und -regeneration hängen von Stammzellen ab, die sich in diskreten anatomischen Räumen befinden, die als Stammzellnischen bezeichnet werden. Der kontinuierlich wachsende Mausschneidezahn bietet ein hervorragendes Modell, um gewebespezifische Stammzellen zu untersuchen. Die epithelgewebespezifischen Stammzellen des Schneidezahns befinden sich am proximalen Ende des Zahnes in einer Nische, der sogenannten Zervixschleife. Sie sorgen für einen kontinuierlichen Zellzustrom, um den ständigen Abrieb der selbstschärfenden Zahnspitze auszugleichen. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur des proximalen Endes des Mausschneidezahns vorgestellt, in dem sich Stammzellen und ihre Nische befinden. Dies ist ein modifiziertes Organkulturprotokoll vom Typ Trowell, das die In-vitro-Kultur von Gewebestücken (Explantaten) sowie der dicken Gewebescheiben an der Flüssig-Luft-Grenzfläche auf einem Filter ermöglicht, der von einem Metallgitter unterstützt wird. Das hier beschriebene Organkulturprotokoll ermöglicht Gewebemanipulationen, die in vivo nicht durchführbar sind, und in Kombination mit der Verwendung eines fluoreszierenden Reporters bietet es eine Plattform für die Identifizierung und Verfolgung diskreter Zellpopulationen in lebenden Geweben im Laufe der Zeit , einschließlich Stammzellen. Verschiedene regulatorische Moleküle und pharmakologische Verbindungen können in diesem System auf ihre Wirkung auf Stammzellen und deren Nischen getestet werden. Dies ist letztendlich ein wertvolles Werkzeug, um die Regulation und Aufrechterhaltung von Stammzellen zu untersuchen.

Die epithelialen SCs befinden sich in einer Nische, die als zervikale Schleife bezeichnet wird und sich am proximalen Ende des Schneidezahns befindet (Abbildung 3A). Zervikale Schleifen sind morphologisch unterschiedliche Strukturen, die aus innerem und äußerem Schmelzepithel bestehen und das Sternretikulum, einen Kern locker angeordneter Epithelzellen, umhüllen (Abbildung 3B,C). Es gibt zwei zervikale Schleifen in jedem Schneidezahn (<strong...

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Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Die Trowell-Typ-Organkulturmethode wurde verwendet, um komplexe Signalnetzwerke zu entschlüsseln, die die Zahnentwicklung steuern, und in jüngerer Zeit zur Untersuchung der Regulation von Stammzellen des kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahns. Fluoreszenzreporter-Tiermodelle und Live-Imaging-Verfahren ermöglichen eingehende Analysen von dentalen Stammzellen und ihrer spezifischen Nischenmikroumgebung.

Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Die Organkultur vom Trowell-Typ wird zur Kultivierung von Gewebeexplantaten verwendet. Hier zeigen wir, wie man mit dieser Methode die Stammzellen in kontinuierlich wachsenden Zähnen untersuchen kann. Mit dieser Technik können wir die Stammzellen und ihr Verhalten in der Nische untersuchen und die Wirkung verschiedener Moleküle auf das Überleben und die Erhaltung von Stammzellen untersuchen.Diese Methode kann auch angewendet werden, um die Stammzellen anderer Organe wie Haut oder Brustdrüse zu untersuchen. Beginnen Sie, indem Sie 30-Millimeter-Metallgitter mit Löchern mit einem bis zwei Millimetern Durchmesser in eine 35-Millimeter-Petrischale legen. Füllen Sie den Ort mit Medien, bis das Medium die Rasteroberfläche erreicht.Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis das Gewebe isoliert und bereit für die Kultur ist. Nachdem Sie die Maus enthauptet haben, entfernen Sie die Haut, um den Unterkiefer freizulegen, und schneiden Sie durch die Massetermuskeln, um den Unterkiefer vom Oberkiefer und dem Rest des Kopfes zu trennen. Sobald der Unterkiefer isoliert ist, entfernen Sie die Zunge und das maximale Weichgewebe.Teilen Sie den Unterkiefer an der Mittellinie, indem Sie die Symphyse durchschneiden. Legen Sie den Unterkiefer in die Petrischale mit PBS auf das Eis. Verwenden Sie eine Einweg-20 x 26 Gauge Injektionsnadel, um den Schneidezahn zu sezieren.Reinigen Sie dann das Weichgewebe und das Muskelgewebe von der Knochenoberfläche für eine bessere Visualisierung. Bei Unterkiefern, die von Tieren stammen, die jünger als 10 Tage sind, verwenden Sie Einweg-Injektionsnadeln von 20 x 26 Gauge, um jede Hälfte des Unterkiefers längs zu öffnen, um den Schneidezahn freizulegen. Lösen Sie den Schneidezahn vorsichtig vom umgebenden Knochen.Schneiden Sie das proximale Ende, das die Zervixschlinge enthält, ab und entfernen Sie den mineralisierten Zahnschmelz und die Dentinmatrix. Bewahren Sie die gesammelten proximalen Enden in Dulbeccos PBS auf Eis, bis sie zur Kultur bereit sind. Bei Mäusen, die älter als 10 Tage sind, öffnen Sie jede Hälfte des Unterkiefers längs, um den Schneidezahn freizulegen.Verwenden Sie eine Pinzette, um den Unterkiefer zu greifen und den Knochen zu brechen, um den Zahn freizulegen. Schneiden Sie das proximale Ende, das die Zervixschleife enthält. Bewahren Sie die gesammelten proximalen Enden in Dulbeccos PBS auf Eis, bis sie zur Kultur bereit sind.Platzieren Sie die Rechteckfilter vorsichtig oben auf dem Gitter in einer vorgewärmten Kulturschale und richten Sie die Gewebestücke richtig aus. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 90 bis 95% Feuchtigkeit. Wechseln Sie das Medium an wechselnden Tagen vorsichtig und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.Überwachen Sie das Gewebewachstum und erfassen Sie täglich Bilder. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Schale und geben Sie vorsichtig eiskaltes Methanol in das Gewebe. Dann inkubieren Sie es für fünf Minuten.Einen Filter, der das Gewebeexplantat trägt, in das mit Fixierlösung gefüllte Probenahmeröhrchen geben. Fixieren Sie die Explantat in 4% Paraformaldehyd, das in PBS für maximal über Nacht bei vier Grad Celsius hergestellt wurde. Die epithelialen Stammzellen befinden sich in einer Nische, die als zervikale Schleife bezeichnet wird und sich am proximalen Ende des Schneidezahns befindet.Die zervikale Schleife besteht aus einem inneren und äußeren Schmelzepithel, das das Sternretikulum, einen Kern locker angeordneter Epithelzellen, umhüllt. Jeder Schneidezahn hat eine labiale und eine linguale Zervixschlinge, aber nur die labiale Zervixschleife enthält die Stammzellen. Das proximale Ende eines Schneidezähnes, isoliert aus zweitägigen postnatalen Sox2-GFP-Mäusen, wurde erfasst, was die Identifizierung und Visualisierung der Sox2-exprimierenden Schneidepithelstammzellen ermöglichte.In zervikalen Schleifen, die aus den transgenen Mäusen Sox2-GFP und Fucci Red isoliert wurden, wurden GFP-positive Stammzellen und Fucci-rot-positive nicht-proliferative Zellen identifiziert. Die Sox2-GFP-Expression wurde als Reporter verwendet, um die Wirkung des Wnt/beta-Catenin-Signalaktivators BIO zu analysieren, der sowohl Sox2-exprimierende Stammzellen als auch die GFP-Expression negativ beeinflusste. Diese Technik kann für die Live-Bildgebung des Stammzellverhaltens optimiert werden.Gepresste oder kultivierte Explantate können auch enzymatisch zu einzelligen Suspensionen zur weiteren Analyse verarbeitet werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...