Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרן ג'יין ואטוס ארקו.

פרוטוקול זה כולל שימוש בבעלי חיים וכל הנהלים אושרו על ידי ועדות אתיות לשימוש וטיפול בבעלי חיים ומתקן בעלי חיים באוניברסיטת הלסינקי.
1. הכנת מנת תרבית האיברים
<ol><li>בצע את כל ההליכים במכסה מנוע זרימה למינרית. נקו משטחי עבודה עם 70% אתנול והשתמשו בכלי זכוכית ותמיסות אוטומטיות. ל...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

תרבית איברים במבחנה שימשה באופן נרחב לחקר פוטנציאל אינדוקטיבי ואינטראקציות אפיתל-מזנכימליות השולטות בגדילת איברים ובמורפוגנזה. מעבדת Thesleff הדגימה כיצד להתאים את שינוי הסקסן של תרבית איברים מסוג טרוול ולהשתמש בה כדי לחקור את התפתחות השיניים14. התנאים הניתנים לשחזור וההת...

החותכות של העכברים גדלות ברציפות הודות לשימור לכל החיים של תאי הגזע (SC) התומכים בייצור בלתי פוסק של רכיבי השן. אלה כוללים SCs אפיתל, אשר מייצרים אמלובלסטים המייצרים אמייל, ותאי גזע מזנכימליים (MSCs), אשר מייצרים אודונטובלסטים המייצרים דנטין, בין תאים אחרים1. ה-SCs האפיתליאליים בחותכות הגדלות ברציפות זוהו בתחילה כתאים שומרי תווית2,3 ומאז הוכחו כמבטאים מספר גני גזע ידועים, כולל Sox24. תאים אלה חולקים תכונות משותפות עם SCs אפיתל באיברים אחרים ושוכנים בתוך נישה SC הנקראת לולאת צוואר הרחם הממוקמת בצד הלאברי של החותך. הנישה היא ישות דינמית המורכבת מתאים ומטריצה חוץ-תאית השולטים בפעילות SC5. מחקרי מעקב אחר שושלת הראו כי Sox2+ אפיתל SCs יכול לחדש את כל תא האפיתל של השן וכי הם חיוניים ליצירת שןרציפה 6,7. MSCs עם פוטנציאל תיקון או התחדשות של דנטין מגויסים ברובם מחוץ לאיבר דרך כלי דם ועצבים 8,9,10,11, ולכן, מספקים מודל מתאים לחקר גיוס, הגירה ודיור של אוכלוסיית MSC.
מחקר SCs in vivo אינו תמיד אפשרי, שכן רבות מהמניפולציות הגנטיות ו / או הפרמקולוגיות יכולות להשפיע על הומאוסטזיס איברים ו / או להיות בעלות השלכות קטלניות. לכן, תרבות איברים מספקת כלי מצוין לחקר הרגולציה של SCs ואת הנישות שלהם במבחנה. מערכת תרבית האיברים המשתמשת ברשת מתכת פותחה בתחילה על ידי Trowell12 כדי לחקור את התפתחות האיברים ושונתה עוד יותר על ידי Saxen13 כדי לחקור אותות אינדוקטיביים בהתפתחות הכליות. מאז, שיטה זו במבחנה של culturing את כל או חלק של האיבר כבר מיושם בהצלחה בתחומים שונים. בתחום התפתחות השן, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימליות השולטות בהתפתחות השן14 והיווצרות שן עוקבת15. עבודתה של מעבדת Thesleff הדגימה את התועלת של מערכת זו לניתוח זמני של צמיחת שיניים ומורפוגנזה, לניתוח ההשפעה של מולקולות שונות וגורמי גדילה על צמיחת השן, ולהדמיה חיה בהילוך מהיר של התפתחות השן16,17. לאחרונה, שיטה זו שימשה כדי ללמוד רגולציה של SCs חותך ואת הנישה שלהם18,19, אשר מתואר בפירוט כאן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

התפתחותם, תפקודם והתחדשותם של איברים תלויים בתאי גזע, השוכנים בתוך מרחבים אנטומיים בדידים הנקראים נישות תאי גזע. חותך העכבר הגדל ללא הרף מספק מודל מצוין לחקר תאי גזע ספציפיים לרקמות. תאי הגזע הספציפיים לרקמת האפיתל של החותך ממוקמים בקצה הפרוקסימלי של השן בנישה הנקראת לולאת צוואר הרחם. הם מספקים זרם מתמשך של תאים כדי לאזן את השחיקה המתמדת של קצה ההשחזה העצמית של השן. מוצג כאן פרוטוקול מפורט לבידוד ולתרבית של הקצה הפרוקסימלי של חותך העכבר המכיל תאי גזע ונישתם. זהו פרוטוקול תרבית איברים שונה מסוג Trowell המאפשר תרבית in vitro של חתיכות רקמה (explants), כמו גם את פרוסות הרקמה העבות בממשק נוזל/אוויר על מסנן הנתמך על ידי רשת מתכת. פרוטוקול תרבית האיברים המתואר כאן מאפשר מניפולציות רקמה שאינן ניתנות לביצוע in vivo , ובשילוב עם שימוש בכתב(ים) פלואורסצנטיים, הוא מספק פלטפורמה לזיהוי ומעקב אחר אוכלוסיות תאים בדידים ברקמות חיות לאורך זמן, כולל תאי גזע. ניתן לבדוק במערכת זו מולקולות רגולטוריות שונות ותרכובות פרמקולוגיות להשפעתן על תאי גזע ועל הנישות שלהם. זה בסופו של דבר מספק כלי רב ערך לחקר ויסות ותחזוקה של תאי גזע.

ה-SCs האפיתליאליים שוכנים בגומחה שנקראת לולאת צוואר הרחם, שנמצאת בקצה הפרוקסימלי של החותך (איור 3A). לולאות צוואר הרחם הן מבנים נבדלים מבחינה מורפולוגית המורכבים מאפיתל אמייל פנימי וחיצוני שעוטפים את הרשתית הכוכבית, ליבה של תאי אפיתל המסודרים באופן רופף (איור 3B,C</s...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

שיטת תרבית האיברים מסוג טרוול שימשה לפענוח רשתות איתות מורכבות השולטות בהתפתחות השיניים, ולאחרונה לחקר הוויסות המעורב בתאי גזע של חותך העכבר הגדל ללא הרף. מודלים של בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים ושיטות הדמיה חיה מאפשרים ניתוח מעמיק של תאי גזע דנטליים ושל המיקרו-סביבה הנישה הספציפית שלהם.

שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

תרבית איברים מסוג טרוול משמשת לתרבית רקמות. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את תאי הגזע בשיניים הגדלות ברציפות. בעזרת טכניקה זו אנו יכולים לחקור את תאי הגזע ואת התנהגותם בנישה ולסנן את ההשפעה של מולקולות שונות על הישרדותם ותחזוקתם של תאי גזע.שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור את תאי הגזע של איברים אחרים גם כן, כגון עור או בלוטת החלב. התחילו בהצבת רשתות מתכת בקוטר 30 מילימטר עם חורים בקוטר של מילימטר עד שניים בצלחת פטרי של 35 מילימטר. מלאו את המקום במדיה עד שהמדיה תגיע למשטח הרשת.לאחר מכן, לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עד הרקמה מבודדת ומוכנה לתרבית. לאחר עריפת העכבר, הסר את העור כדי לחשוף את המנדיבל וחתך דרך שרירי המאסה כדי להפריד את המנדיבל מהמקסילה ושאר הראש. לאחר בידוד המנדיבל, הסר את הלשון ואת הרקמה הרכה המקסימלית.פיצול המנדיבל בקו האמצע על ידי חיתוך דרך הסימפיזה. מניחים את המנדיבל בצלחת פטרי המכילה PBS על הקרח. השתמש במחט היפודרמית חד פעמית בגודל 20 על 26 כדי לנתח את החותך.לאחר מכן, נקו את הרקמה הרכה ורקמת השריר מפני השטח של העצם להדמיה טובה יותר. עבור מנדיבלים המתקבלים מבעלי חיים מתחת לגיל 10 ימים, השתמש במחטים היפודרמיות חד פעמיות בגודל 20 על 26 כדי לפתוח כל מחצית מהמנדיבל לאורכו כדי לחשוף את השן החותכת. יש לנתק בעדינות את החותך מהעצם שמסביב.חותכים את הקצה הפרוקסימלי המכיל את לולאת צוואר הרחם ומסירים את האמייל המינרלי ואת מטריצת הדנטין. שמור את הקצוות הפרוקסימליים שנאספו ב- PBS של דולבקו על הקרח עד שיהיה מוכן לתרבית. לעכברים שגילם עולה על 10 ימים, יש לפתוח כל מחצית מהמנדיבל לאורכו כדי לחשוף את השן החותכת.השתמש בפינצטה כדי לאחוז את המנדיבל ולשבור את העצם כדי לחשוף את השן. חותכים את הקצה הפרוקסימלי המכיל את לולאת צוואר הרחם. שמור את הקצוות הפרוקסימליים שנאספו ב- PBS של דולבקו על הקרח עד שיהיה מוכן לתרבית.מניחים בזהירות את מסנני המלבן על גבי הרשת בצלחת תרבית שחוממה מראש ומכוונים כראוי את חתיכות הרקמה. יש לדגור על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ולחות של 90%-95%. בזהירות לשנות את המדיום בימים חלופיים, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.עקוב אחר צמיחת הרקמות ולכוד תמונות מדי יום. מוציאים את מדיום התרבית מהמנה ומוסיפים בזהירות מתנול קר כקרח לרקמה. לאחר מכן, לדגור אותו במשך חמש דקות.העבירו מסנן הנושא את יציאת הרקמה לצינור הדגימה המלא בתמיסת קיבוע. לתקן את explant ב 4% paraformaldehyde מוכן PBS עבור לילה מקסימלי בארבע מעלות צלזיוס. תאי הגזע האפיתליאליים שוכנים בנישה הנקראת לולאת צוואר הרחם, הממוקמת בקצה הפרוקסימלי של החותך.הלולאה הצווארית כוללת אפיתל אמייל פנימי וחיצוני העוטף את הרשתית הסטלית, ליבה של תאי אפיתל המסודרים באופן רופף. לכל חותך יש לולאת צוואר רחם אחת ולולאה צווארית לשונית אחת, אך רק לולאת צוואר הרחם הלבבית מכילה את תאי הגזע. הקצה הפרוקסימלי של החותך, שבודד מעכברי Sox2-GFP לאחר הלידה, נלכד, מה שאפשר זיהוי והדמיה של תאי גזע אפיתל חותכים המבטאים Sox2.בלולאות צוואר הרחם שבודדו מהעכברים המהונדסים האדומים Sox2-GFP ו-Fucci, זוהו תאי גזע חיוביים ל-GFP ותאי פוצ'י-אדומים-חיוביים שאינם מתרבים. הביטוי Sox2-GFP שימש ככתב לניתוח ההשפעה של מפעיל האיתות Wnt/beta-catenin BIO, שהשפיע לרעה על תאי גזע המבטאים Sox2, כמו גם על ביטוי ה-GFP. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת להדמיה חיה של התנהגות תאי הגזע.ניתן גם לעבד צמחים דחוסים או בתרבית באופן אנזימטי לתרחיפים חד-תאיים לצורך ניתוח נוסף.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...