Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
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이 연구는 Jane and Aatos Erkko Foundation의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 동물의 사용을 포함하며 모든 절차는 헬싱키 대학의 동물 사용 및 관리에 관한 윤리위원회 및 동물 시설의 승인을 받았습니다.
1. 장기 배양 접시의 준비
<ol><li>층류 후드에서 모든 절차를 수행하십시오. 70 % 에탄올로 작업 표면을 청소하고 고압 멸균 유리기구와 용액을 사용하십시오. 유리 구슬 살균기에서 가위 및 기타 금속 장비를 소독하십시오.</li>
	<li>일?...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

체외 장기 배양은 장기 성장 및 형태 형성을 제어하는 유도 잠재력 및 상피-중간엽 상호 작용을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Thesleff 실험실은 Trowell 유형 장기 배양의 Saxén 변형을 적용하고 치아 발달을 연구하는 데 사용하는 방법을 보여주었습니다14. 형광 리포터의 재현 가능한 조건과 발전으로 인해 치아 형태 형성과 그 안의 뚜렷한 세포 집단을 모니터링하...

마우스 앞니는 치아 구성 요소의 끊임없는 생산을 지원하는 줄기 세포 (SC)의 평생 보존으로 인해 지속적으로 성장합니다. 여기에는 법랑질 생성 흑색 모세포를 생성하는 상피 SC와 다른 세포중에서 상아질 생성 치모 세포를 생성하는 중간엽 줄기 세포(MSC)가 포함됩니다1. 지속적으로 성장하는 앞니의 상피 SC는 처음에는 표지 유지 세포 2,3으로 확인되었으며 이후 Sox24를 포함한 여러 잘 알려진 줄기 유전자를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이 세포는 다른 기관의 상피 SC와 공통된 특징을 공유하며 앞니의 순음쪽에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 SC 틈새 내에 있습니다. 틈새는 SC 활성을 조절하는 세포와 세포외 기질로 구성된 동적 실체입니다5. 계통 추적 연구에 따르면 Sox2+ 상피 SC는 치아의 전체 상피 구획을 재생할 수 있으며 연속적인치아 형성에 중요합니다6,7. 상아질 회복 또는 재생 잠재력을 가진 MSC는 혈관 및 신경 8,9,10,11을 통해 기관 외부에서 주로 모집되므로 MSC 인구의 모집, 이동 및 주거를 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다.
생체 내에서 SC를 연구하는 것은 많은 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작이 장기 항상성에 영향을 미치거나 치명적인 결과를 초래할 수 있기 때문에 항상 가능한 것은 아닙니다. 따라서 장기 배양은 SC의 조절과 그 틈새를 시험관 내에서 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다. 금속 격자를 사용하는 장기 배양 시스템은 처음에 장기 발달을 연구하기 위해 Trowell12에 의해 개발되었으며 신장 발달에서 유도 신호를 연구하기 위해 Saxen13에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로, 장기의 전체 또는 일부를 배양하는이 시험관 내 방법은 다른 분야에서 성공적으로 적용되었습니다. 치아 발달 분야에서이 방법은 치아 발달14 및 연속 치아 형성15을 제어하는 상피-중간 엽 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되었습니다. Thesleff 실험실의 연구는 치아 성장 및 형태 형성의 시간적 분석, 치아 성장에 대한 다양한 분자 및 성장 인자의 영향 분석, 치아 발달의 시간 경과 라이브 이미징을 위해이 시스템의 유용성을 입증했습니다16,17. 보다 최근에이 방법은 앞니 SC 및 그 틈새18,19의 조절을 연구하는 데 활용되었으며, 이는 여기에 자세히 설명되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

장기 발달, 기능 및 재생은 줄기 세포 틈새라고하는 별개의 해부학 적 공간 내에있는 줄기 세포에 의존합니다. 지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 조직 특이적 줄기 세포를 연구하기 위한 우수한 모델을 제공합니다. 앞니의 상피 조직 특이 적 줄기 세포는 자궁 경부 루프라고하는 틈새에서 치아의 근위 끝에 있습니다. 그들은 치아의 자체 날카롭게하는 팁의 지속적인 마모를 상쇄하기 위해 세포의 지속적인 유입을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 줄기 세포와 그 틈새를 수용하는 마우스 앞니의 근위 말단의 분리 및 배양에 대한 자세한 프로토콜입니다. 이것은 금속 격자로 지지되는 필터의 액체/공기 계면에 있는 두꺼운 조직 조각뿐만 아니라 조직 조각(체외이식편)의 체외 배양을 가능하게 하는 수정된 Trowell 유형 장기 배양 프로토콜입니다. 여기에 설명된 장기 배양 프로토콜은 생체 내에서 불가능한 조직 조작을 가능하게 하며, 형광 리포터의 사용과 결합하면 줄기 세포를 포함하여 시간이 지남에 따라 살아있는 조직에서 개별 세포 집단을 식별하고 추적할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 다양한 조절 분자 및 약리학 적 화합물이이 시스템에서 줄기 세포 및 그 틈새에 미치는 영향을 테스트 할 수 있습니다. 이것은 궁극적으로 줄기 세포 조절 및 유지를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

상피 SC는 절치의 근위 끝에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 틈새에 있습니다 (그림 3A). 자궁 경부 루프는 느슨하게 배열 된 상피 세포의 핵심 인 별 모양의 세망을 감싸는 내부 및 외부 법랑질 상피로 구성된 형태 학적으로 구별되는 구조입니다 (그림 3B, C). 각 절치에는 두 개의 자궁 경부 루프가 있지만 (그림 3A) 순순...

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Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.

치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Trowell 형 장기 배양은 조직 외식편을 배양하는 데 사용됩니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 지속적으로 성장하는 치아의 줄기 세포를 연구하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 통해 우리는 틈새 시장에서 줄기 세포와 그 행동을 연구하고 줄기 세포의 생존 및 유지에 대한 다양한 분자의 영향을 스크리닝 할 수 있습니다.이 방법은 피부나 유선과 같은 다른 기관의 줄기 세포를 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 35mm 페트리 접시에 1-2mm 직경의 구멍이있는 30mm 금속 격자를 배치하여 시작하십시오. 미디어가 그리드 표면에 도달할 때까지 미디어로 위치를 채웁니다.그런 다음 조직이 분리되고 배양할 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 마우스를 참수 한 후 피부를 제거하여 하악을 노출시키고 교근을 절단하여 하악골을 상악과 나머지 머리에서 분리합니다. 하악골이 분리되면 혀와 최대 연조직을 제거하십시오.symphysis를 절단하여 정중선에서 하악을 분할하십시오. 얼음 위의 PBS가 들어있는 페트리 접시에 하악골을 놓습니다. 일회용 20 x 26 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 절치를 해부하십시오.그런 다음 더 나은 시각화를 위해 뼈 표면에서 연조직과 근육 조직을 청소하십시오. 10 일 미만의 동물에서 얻은 하악골의 경우 일회용 20 x 26 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 하악의 각 절반을 세로로 열어 앞니를 노출시킵니다. 주변 뼈에서 절치를 부드럽게 분리하십시오.자궁 경부 루프가 포함 된 근위 끝을 자르고 미네랄 화 된 법랑질과 상아질 기질을 제거합니다. 배양 준비가 될 때까지 Dulbecco의 PBS에서 수집 된 근위 끝을 얼음 위에 보관하십시오. 10 일 이상 된 마우스의 경우, 하악의 각 절반을 세로로 열어 절치 치아를 노출시킵니다.핀셋을 사용하여 하악을 잡고 뼈를 부러 뜨려 치아를 노출시킵니다. 자궁 경부 루프가 포함 된 근위 끝을 자릅니다. 배양 준비가 될 때까지 Dulbecco의 PBS에서 수집 된 근위 끝을 얼음 위에 보관하십시오.예열 된 배양 접시의 그리드 위에 직사각형 필터를 조심스럽게 놓고 조직 조각의 방향을 올바르게 지정하십시오. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 90-95%에서 배양합니다. 기포의 형성을 피하면서 격일로 조심스럽게 매체를 교체하십시오.조직 성장을 모니터링하고 매일 이미지를 캡처합니다. 접시에서 배양 배지를 제거하고 조심스럽게 얼음처럼 차가운 메탄올을 조직에 첨가하십시오. 그런 다음 5 분 동안 배양하십시오.조직 체외이식편을 운반하는 필터를 고정 용액으로 채워진 샘플링 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 밤새 최대로 PBS에서 준비된 4 % 파라 포름 알데히드로 체외 이식편을 고정하십시오. 상피 줄기 세포는 앞니의 근위 끝에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 틈새에 있습니다.자궁 경부 루프는 느슨하게 배열 된 상피 세포의 핵심 인 별 모양의 세망을 감싸는 내부 및 외부 법랑질 상피로 구성됩니다. 각 앞니에는 하나의 순순 및 하나의 설측 경추 루프가 있지만 순순 자궁 경부 루프에만 줄기 세포가 포함되어 있습니다. 출생 후 2일 Sox2-GFP 마우스에서 분리한 앞니의 근위 말단을 캡처하여 Sox2 발현 앞니 상피 줄기 세포를 식별하고 시각화할 수 있었습니다.Sox2-GFP 및 Fucci 적색 형질전환 마우스에서 분리된 자궁경부 루프에서 GFP 양성 줄기세포 및 Fucci-적색 양성 비증식성 세포가 확인되었습니다. Sox2-GFP 발현은 Wnt/베타-카테닌 신호 전달제 BIO의 효과를 분석하기 위한 리포터로 사용되었으며, 이는 GFP 발현뿐만 아니라 Sox2 발현 줄기세포에 부정적인 영향을 미쳤습니다. 이 기술은 줄기 세포 행동의 라이브 이미징에 최적화 될 수 있습니다.압착 또는 배양된 체외이식편은 또한 추가 분석을 위해 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 처리될 수 있습니다.

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Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...