Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Jane og Aatos Erkko Foundation.

Denne protokollen innebærer bruk av dyr og alle prosedyrene ble godkjent av etiske komiteer for bruk og stell av dyr og dyreavdelingen ved Helsingfors universitet.
1. Tilberedning av organkulturretten
<ol><li>Utfør alle prosedyrer i en laminær strømningshette. Rengjør arbeidsflater med 70% etanol og bruk autoklaverte glassinstrumenter og løsninger. Steriliser saks og annet metallutstyr i en glassperlesterilisator.</li>
	<li>Forbered filtre som normalt lagres i 70% etanol ved å vaske d...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

In vitro organkultur har blitt mye brukt til å studere induktivt potensial og epitel-mesenkymale interaksjoner som styrer organvekst og morfogenese. Thesleff-laboratoriet har vist hvordan man kan tilpasse Saxén-modifikasjonen av Trowell-typen organkultur og bruke den til å studere tannutvikling14. De reproduserbare forholdene og fremskrittene i fluorescerende reportere har gjort dette til en nyttig metode for overvåking av tannmorfogenese og de forskjellige cellepopulasjonene innenfor...

Musens fortenner vokser kontinuerlig på grunn av livslang bevaring av stamceller (SC) som støtter uopphørlig produksjon av tannkomponenter. Disse inkluderer epiteliale SCs, som genererer emaljeproduserende ameloblaster, og mesenkymale stamceller (MSCs), som genererer dentinproduserende odontoblaster, blant andre celler1. Epiteliale SCs i de kontinuerlig voksende snittene ble opprinnelig identifisert som etikettbevarende celler2,3 og har siden vist seg å uttrykke en rekke kjente stammegener, inkludert Sox24. Disse cellene deler fellestrekk med epiteliale SCs i andre organer og ligger innenfor SC-nisjen kalt livmorhalssløyfen som ligger på labialsiden av snittet. Nisjen er en dynamisk enhet sammensatt av celler og ekstracellulær matrise som styrer SC-aktivitet5. Lineage-tracing-studier har vist at Sox2+ epiteliale SCs kan regenerere hele epitelrommet i tannen, og at de er avgjørende for suksessiv tanndannelse 6,7. MSC-er med dentinreparativt eller regenerativt potensial rekrutteres i stor grad fra utsiden av organet gjennom blodkar og nerver 8,9,10,11, og gir derfor en passende modell for å studere rekruttering, migrasjon og bolig for MSC-befolkningen.
Å studere SCs in vivo er ikke alltid mulig, siden mange av de genetiske og / eller farmakologiske manipulasjonene kan påvirke organhomeostase og / eller ha dødelige konsekvenser. Derfor er organkultur et utmerket verktøy for å studere regulering av SCs og deres nisjer in vitro. Organkultursystemet som benytter et metallgitter ble opprinnelig utviklet av Trowell12 for å studere organutvikling og har blitt ytterligere modifisert av Saxen13 for å studere induktive signaler i nyreutvikling. Siden da har denne in vitro-metoden for dyrking av hele eller deler av orgelet blitt brukt på forskjellige felt. Innen tannutvikling har denne metoden blitt mye brukt til å studere epithelial-mesenkymale interaksjoner som styrer tannutvikling14 og suksessional tanndannelse15. Arbeidet til Thesleff-laboratoriet har vist nytten av dette systemet for tidsmessig analyse av tannvekst og morfogenese, for analyse av effekten av forskjellige molekyler og vekstfaktorer på tannvekst, og for time-lapse levende avbildning av tannutvikling16,17. Mer nylig har denne metoden blitt brukt til å studere regulering av snitt SCs og deres nisje18,19, som er beskrevet i detalj her.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

Organutvikling, funksjon og regenerering er avhengig av stamceller, som ligger innenfor diskrete anatomiske rom kalt stamcellenisjer. Det kontinuerlig voksende musefortennet gir en utmerket modell for å studere vevsspesifikke stamceller. De epitelvevsspesifikke stamcellene i snittet befinner seg i den proksimale enden av tannen i en nisje kalt livmorhalssløyfen. De gir en kontinuerlig tilstrømning av celler for å motvirke den konstante slitasjen av tannens selvslipende spiss. Presentert her er en detaljert protokoll for isolasjon og kultur av den proksimale enden av musesnittet som huser stamceller og deres nisje. Dette er en modifisert Trowell-type organkulturprotokoll som muliggjør in vitro-kultur av vevsstykker (eksplanter), samt de tykke vevsskivene ved væske/luft-grensesnittet på et filter støttet av et metallgitter. Organkulturprotokollen som er beskrevet her, muliggjør vevsmanipulasjoner som ikke er gjennomførbare in vivo , og når den kombineres med bruk av en fluorescerende reporter (er), gir den en plattform for identifisering og sporing av diskrete cellepopulasjoner i levende vev over tid, inkludert stamceller. Ulike regulatoriske molekyler og farmakologiske forbindelser kan testes i dette systemet for deres effekt på stamceller og deres nisjer. Dette gir til slutt et verdifullt verktøy for å studere stamcelleregulering og vedlikehold.

Epiteliale SCs ligger i en nisje kalt cervical loop, som ligger i den proksimale enden av snittet (figur 3A). Cervikale sløyfer er morfologisk distinkte strukturer sammensatt av indre og ytre emaljeepitel som omslutter stellatretikulumet, en kjerne av løst arrangerte epitelceller (figur 3B, C). Det er to cervikale sløyfer i hvert fortenn (figur 3A), men bare labial cervikal sløyfe inneholder SCs. Epiteliale SCs ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Trowell-type organkulturmetode har blitt brukt til å avdekke komplekse signalnettverk som styrer tannutvikling og, mer nylig, for å studere regulering involvert i stamceller i det kontinuerlig voksende musesnittet. Fluorescerende reporter dyremodeller og live-imaging metoder muliggjør grundige analyser av dental stamceller og deres spesifikke nisje mikromiljø.

Bruk av Trowell-type organkultur for å studere regulering av dental stamceller

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Trowell-type organkultur brukes til å dyrke vevseksplanter. Her viser vi hvordan du bruker denne metoden til å studere stamceller i kontinuerlig voksende tenner. Med denne teknikken kan vi studere stamceller og deres oppførsel i nisje og skjerme effekten av ulike molekyler på overlevelse og vedlikehold av stamceller.Denne metoden kan brukes til å studere stamceller i andre organer også, for eksempel hud eller brystkjertel. Begynn med å plassere 30 millimeter metallgitter med hull på en til to millimeter i diameter i en 35 millimeter petriskål. Fyll stedet med media til mediet når rutenettoverflaten.Deretter inkuberer platen ved 37 grader Celsius til vevet er isolert og klar til å dyrke. Etter å ha halshugget musen, fjern huden for å eksponere mandibelen og skjær gjennom massetermusklene for å skille mandibelen fra maxillaen og resten av hodet. Når mandibelen er isolert, fjern tungen og maksimalt bløtvev.Del mandibelen ved midtlinjen ved å skjære gjennom symfysen. Legg mandibelen i petriskålen som inneholder PBS på isen. Bruk en engangs 20 x 26 gauge hypodermic nål for å dissekere snittet.Rengjør deretter bløtvevet og muskelvevet fra beinoverflaten for bedre visualisering. For mandibler hentet fra dyr yngre enn 10 dager, bruk engangs 20 x 26 gauge hypodermiske nåler for å åpne hver halvdel av mandibelen i lengderetningen for å eksponere snittetannen. Løsne snittet forsiktig fra det omkringliggende beinet.Klipp den proksimale enden som inneholder livmorhalssløyfen og fjern den mineraliserte emalje- og dentinmatrisen. Hold de oppsamlede proksimale endene i Dulbeccos PBS på is til de er klare til å dyrke. For mus eldre enn 10 dager, åpne hver halvdel av mandibelen i lengderetningen for å eksponere snitttannen.Bruk pinsett til å gripe tak i mandibelen og brekke beinet for å eksponere tannen. Klipp den proksimale enden som inneholder livmorhalssløyfen. Hold de oppsamlede proksimale endene i Dulbeccos PBS på is til de er klare til å dyrke.Plasser rektangelfiltrene forsiktig på toppen av rutenettet i en forvarmet kulturskål og orienter vevsstykkene riktig. Inkuber platen ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 90 til 95% fuktighet. Bytt forsiktig mediet på alternative dager, unngå dannelse av luftbobler.Overvåk vevsveksten og ta bilder daglig. Fjern kulturmediet fra parabolen og tilsett forsiktig iskald metanol i vevet. Deretter inkuberer du den i fem minutter.Overfør et filter som bærer vevseksplanten til prøvetakingsrøret fylt med festeløsning. Fest eksplanten i 4% paraformaldehyd tilberedt i PBS for maksimalt over natten ved fire grader Celsius. Epitelstamceller ligger i en nisje kalt livmorhalssløyfen, som ligger i den proksimale enden av snittet.Cervikalsløyfen består av et indre og ytre emaljeepitel som omslutter stellatretikulumet, en kjerne av løst arrangerte epitelceller. Hver fortenn har en labial og en lingual cervical loop, men bare labial cervical loop inneholder stamceller. Den proksimale enden av et fortenn, isolert fra to-dagers postnatale Sox2-GFP-mus, ble fanget, noe som muliggjorde identifisering og visualisering av Sox2-uttrykkende snittepitelstamceller.I cervikale sløyfer isolert fra Sox2-GFP og Fucci røde transgene mus, ble GFP-positive stamceller og Fucci-rød-positive ikke-proliferative celler identifisert. Sox2-GFP-uttrykket ble brukt som reporter for å analysere effekten av Wnt / beta-catenin-signalaktivatoren BIO, som negativt påvirket Sox2-uttrykkende stamceller så vel som GFP-uttrykket. Denne teknikken kan optimaliseres for levende avbildning av stamcelleadferd.Pressede eller dyrkede eksplanter kan også behandles enzymatisk til enkeltcellesuspensjoner for videre analyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Bruk av Teton system for å studere molekylære mekanismer av Sebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Metode for å studere Palatal Fusion bruker Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metoder for å studere Mrp4 holdige makromolekylær Komplekser i forskrift av fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolasjon, overføring og Prion Protein uttrykk under Neuronal differensiering av menneskelig tannlegekontoret masse stammen celler

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...