Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
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Este estudo foi apoiado pela Fundação Jane e Aatos Erkko.

Este protocolo envolve o uso de animais e todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês de Ética sobre o Uso e Cuidado de Animais e o Animal Facility da Universidade de Helsinque.
1. Preparação do prato de cultura de órgãos
<ol><li>Realizar todos os procedimentos em um exaustor de fluxo laminar. Limpe as superfícies de trabalho com etanol a 70% e utilize instrumentos e soluções de vidro autoclavado. Esterilize tesouras e outros equipamentos de metal em um esterilizador de con...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

A cultura de órgãos in vitro tem sido amplamente utilizada para estudar o potencial indutivo e as interações epitelial-mesenquimais que governam o crescimento e a morfogênese dos órgãos. O laboratório Thesleff demonstrou como adaptar a modificação de Saxén da cultura de órgãos do tipo Trowell e usá-la para estudar o desenvolvimento dentário14. As condições reprodutíveis e os avanços nos repórteres fluorescentes tornaram este um método útil para monitorar a morfogêne...

Os incisivos de camundongos crescem continuamente devido à preservação ao longo da vida das células-tronco (SC) que suportam a produção incessante de componentes dentários. Estes incluem SCs epiteliais, que geram ameloblastos produtores de esmalte, e células-tronco mesenquimais (MSCs), que geram odontoblastos produtores de dentina, entre outras células1. Os SCs epiteliais nos incisivos de crescimento contínuo foram inicialmente identificados como células de retenção de rótulo2,3 e, desde então, demonstraram expressar uma série de genes de caule bem conhecidos, incluindo Sox24. Essas células compartilham características comuns com SCs epiteliais em outros órgãos e residem dentro do nicho SC chamado alça cervical localizado no lado labial do incisivo. O nicho é uma entidade dinâmica composta por células e matriz extracelular que controlam a atividade da SC5. Estudos de traçado de linhagem demonstraram que os SCs epiteliais Sox2+ podem regenerar todo o compartimento epitelial do dente e que são cruciais para a formação sucessional do dente 6,7. As CTMs com potencial reparador ou regenerativo dentinário são em grande parte recrutadas de fora do órgão através de vasos sanguíneos e nervos 8,9,10,11, fornecendo, portanto, um modelo adequado para estudar o recrutamento, a migração e o alojamento da população de CTM.
Estudar SCs in vivo nem sempre é viável, uma vez que muitas das manipulações genéticas e/ou farmacológicas podem afetar a homeostase dos órgãos e/ou ter consequências letais. Portanto, a cultura de órgãos fornece uma excelente ferramenta para estudar a regulação das SCs e seus nichos in vitro. O sistema de cultura de órgãos que utiliza uma grade de metal foi inicialmente desenvolvido por Trowell12 para estudar o desenvolvimento de órgãos e foi modificado por Saxen13 para estudar sinais indutivos no desenvolvimento renal. Desde então, este método in vitro de cultura da totalidade ou parte do órgão tem sido aplicado com sucesso em diferentes campos. No campo do desenvolvimento dentário, esse método tem sido amplamente utilizado para estudar as interações epitelial-mesenquimais que regem o desenvolvimento dentário14 e a formação sucessional dentária15. O trabalho do laboratório Thesleff demonstrou a utilidade desse sistema para a análise temporal do crescimento e morfogênese dentária, para a análise do efeito de várias moléculas e fatores de crescimento no crescimento dentário e para a imagem ao vivo em tempo de lapso temporal do desenvolvimento dentário16,17. Mais recentemente, esse método tem sido utilizado para estudar a regulação de SCs incisivos e seu nicho18,19, o que é descrito em detalhes aqui.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

O desenvolvimento, a função e a regeneração dos órgãos dependem das células-tronco, que residem em espaços anatômicos discretos chamados nichos de células-tronco. O incisivo de camundongo em crescimento contínuo fornece um excelente modelo para estudar células-tronco específicas de tecidos. As células-tronco específicas do tecido epitelial do incisivo estão localizadas na extremidade proximal do dente em um nicho chamado alça cervical. Eles fornecem um influxo contínuo de células para contrabalançar a abrasão constante da ponta auto-afiada do dente. Apresenta-se aqui um protocolo detalhado para o isolamento e cultura da extremidade proximal do incisivo de camundongo que abriga células-tronco e seu nicho. Este é um protocolo de cultura de órgãos do tipo Trowell modificado que permite a cultura in vitro de pedaços de tecido (explantes), bem como as fatias de tecido espesso na interface líquido/ar em um filtro suportado por uma grade metálica. O protocolo de cultura de órgãos descrito aqui permite manipulações teciduais inviáveis in vivo e, quando combinado com o uso de um repórter fluorescente, fornece uma plataforma para a identificação e rastreamento de populações de células discretas em tecidos vivos ao longo do tempo, incluindo células-tronco. Várias moléculas reguladoras e compostos farmacológicos podem ser testados neste sistema quanto ao seu efeito sobre as células-tronco e seus nichos. Isso, em última análise, fornece uma ferramenta valiosa para estudar a regulação e a manutenção das células-tronco.

Os SCs epiteliais residem em um nicho denominado alça cervical, que se localiza na extremidade proximal do incisivo (Figura 3A). As alças cervicais são estruturas morfologicamente distintas compostas de epitélio interno e externo do esmalte que envolvem o retículo estrelado, um núcleo de células epiteliais frouxamente dispostas (Figura 3B,C). Existem duas alças cervicais em cada incisivo (Figura 3A), mas ape...

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Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

A cultura de órgãos do tipo Trowell é usada para cultivar explantes de tecidos. Aqui, mostramos como usar esse método para estudar as células-tronco em dentes de crescimento contínuo. Com esta técnica, podemos estudar as células-tronco e seu comportamento no nicho e rastrear o efeito de várias moléculas na sobrevivência e manutenção das células-tronco.Este método pode ser aplicado para estudar as células-tronco de outros órgãos também, como a pele ou a glândula mamária. Comece colocando grades metálicas de 30 milímetros com orifícios de um a dois milímetros de diâmetro em uma placa de Petri de 35 milímetros. Preencha o local com mídia até que a mídia atinja a superfície da grade.Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius até que o tecido esteja isolado e pronto para a cultura. Depois de decapitar o rato, remova a pele para expor a mandíbula e corte os músculos masseteres para separar a mandíbula da maxila e do resto da cabeça. Uma vez que a mandíbula esteja isolada, remova a língua e o máximo de tecidos moles.Divida a mandíbula na linha média, cortando a sínfise. Coloque a mandíbula na placa de Petri contendo PBS no gelo. Use uma agulha hipodérmica descartável de calibre 20 por 26 para dissecar o incisivo.Em seguida, limpe o tecido mole e o tecido muscular da superfície óssea para uma melhor visualização. Para mandíbulas obtidas de animais com menos de 10 dias, use agulhas hipodérmicas descartáveis de calibre 20 por 26 para abrir cada metade da mandíbula longitudinalmente para expor o dente incisivo. Separe suavemente o incisivo do osso circundante.Corte a extremidade proximal que contém a alça cervical e remova o esmalte mineralizado e a matriz dentinária. Mantenha as extremidades proximais coletadas no PBS de Dulbecco no gelo até que estejam prontas para a cultura. Para ratos com mais de 10 dias, abra cada metade da mandíbula longitudinalmente para expor o dente incisivo.Use uma pinça para segurar a mandíbula e quebrar o osso para expor o dente. Corte a extremidade proximal que contém a alça cervical. Mantenha as extremidades proximais coletadas no PBS de Dulbecco no gelo até que estejam prontas para a cultura.Coloque cuidadosamente os filtros retângulos em cima da grade em um prato de cultura pré-aquecido e oriente adequadamente as peças de tecido. Incubar a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 90 a 95% de umidade. Troque cuidadosamente o meio em dias alternados, evitando a formação de bolhas de ar.Monitore o crescimento do tecido e capture imagens diariamente. Retire o meio de cultura do prato e adicione cuidadosamente metanol gelado ao tecido. Em seguida, incube-o por cinco minutos.Transfira um filtro que transporte o explante de tecido para o tubo de amostragem preenchido com solução de fixação. Fixar o explante em paraformaldeído a 4% preparado em PBS durante a noite máxima a quatro graus Celsius. As células-tronco epiteliais residem em um nicho chamado alça cervical, localizado na extremidade proximal do incisivo.A alça cervical compreende um epitélio de esmalte interno e externo que envolve o retículo estrelado, um núcleo de células epiteliais frouxamente arranjadas. Cada incisivo tem uma alça cervical labial e uma lingual, mas apenas a alça cervical labial contém as células-tronco. A extremidade proximal de um incisivo, isolado de camundongos Sox2-GFP pós-natais de dois dias, foi capturada, permitindo a identificação e visualização das células-tronco epiteliais incisivas expressoras de Sox2.Em alças cervicais isoladas dos camundongos transgênicos vermelhos Sox2-GFP e Fucci, células-tronco positivas para GFP e células não proliferativas positivas para vermelho de Fucci foram identificadas. A expressão de Sox2-GFP foi utilizada como relator para analisar o efeito do ativador de sinalização Wnt/beta-catenina BIO, que afetou negativamente as células-tronco que expressam Sox2, bem como a expressão de GFP. Essa técnica pode ser otimizada para imagens ao vivo do comportamento das células-tronco.Explantes prensados ou cultivados também podem ser processados enzimaticamente em suspensões unicelulares para análise posterior.

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Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...