Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Studien stöddes av Jane och Aatos Erkkos stiftelse.

Detta protokoll omfattar användning av djur och alla förfaranden har godkänts av etiska kommittéer för användning och skötsel av djur och djuranläggningen vid Helsingfors universitet.
1. Beredning av orgelodlingsskålen
<ol><li>Utför alla procedurer i en laminär flödeshuv. Rengör arbetsytor med 70% etanol och använd autoklaverade glasinstrument och lösningar. Sterilisera sax och annan metallutrustning i en glaspärlsterilisator.</li>
	<li>Förbered filter som normalt lagras i 7...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

In vitro-organodling har använts i stor utsträckning för att studera induktiv potential och epitel-mesenkymala interaktioner som styr organtillväxt och morfogenes. Thesleff-laboratoriet har visat hur man kan anpassa Saxén-modifieringen av orgelkulturen av Trowell-typ och använda den för att studera tandutveckling14. De reproducerbara förhållandena och framstegen hos fluorescerande reportrar har gjort detta till en användbar metod för övervakning av tandmorfogenes och de distin...

Musframtänder växer kontinuerligt på grund av livslångt bevarande av stamcellerna (SC) som stöder den oupphörliga produktionen av tandkomponenter. Dessa inkluderar epitel-SC, som genererar emaljproducerande ameloblaster, och mesenkymala stamceller (MSC), som genererar dentinproducerande odontoblaster, bland andra celler1. Epitel-SCs i de kontinuerligt växande framtänderna identifierades ursprungligen som etiketthållande celler2,3 och har sedan dess visat sig uttrycka ett antal välkända stamhetsgener, inklusive Sox24. Dessa celler delar gemensamma drag med epitel-SC i andra organ och ligger inom SC-nischen som kallas livmoderhalsslingan som ligger på labialsidan av snittet. Nischen är en dynamisk enhet som består av celler och extracellulär matris som styr SC-aktivitet5. Lineage-tracing-studier har visat att Sox2+ epitel-SCs kan regenerera hela epitelfacket i tanden och att de är avgörande för successionell tandbildning 6,7. MSC med dentinreparativ eller regenerativ potential rekryteras till stor del utanför organet genom blodkärl och nerver 8,9,10,11, vilket ger en lämplig modell för att studera rekrytering, migration och boende av MSC-befolkningen.
Att studera SCs in vivo är inte alltid genomförbart, eftersom många av de genetiska och/eller farmakologiska manipulationerna kan påverka organhomeostas och/eller få dödliga konsekvenser. Därför ger organkultur ett utmärkt verktyg för att studera reglering av SCs och deras nischer in vitro. Orgelodlingssystemet som använder ett metallnät utvecklades ursprungligen av Trowell12 för att studera organutveckling och har modifierats ytterligare av Saxen13 för att studera induktiva signaler vid njurutveckling. Sedan dess har denna in vitro-metod för odling av hela eller delar av organet framgångsrikt tillämpats inom olika områden. Inom tandutveckling har denna metod använts i stor utsträckning för att studera epitelial-mesenkymala interaktioner som styr tandutveckling14 och successionell tandbildning15. Thesleff-laboratoriets arbete har visat nyttan av detta system för tidsanalys av tandtillväxt och morfogenes, för analys av effekten av olika molekyler och tillväxtfaktorer på tandtillväxt och för time-lapse live imaging av tandutveckling16,17. På senare tid har denna metod använts för att studera reglering av snitt-SCs och deras nisch18,19, som beskrivs i detalj här.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

Organutveckling, funktion och regenerering beror på stamceller, som finns i diskreta anatomiska utrymmen som kallas stamcellsnischer. Den kontinuerligt växande mussnittet ger en utmärkt modell för att studera vävnadsspecifika stamceller. De epitelvävnadsspecifika stamcellerna i snittet är belägna vid den proximala änden av tanden i en nisch som kallas livmoderhalsslingan. De ger en kontinuerlig tillströmning av celler för att motverka den konstanta nötningen av tandens självslipande spets. Här presenteras ett detaljerat protokoll för isolering och odling av den proximala änden av mussnittet som rymmer stamceller och deras nisch. Detta är ett modifierat organodlingsprotokoll av Trowell-typ som möjliggör in vitro-odling av vävnadsbitar (explanter), liksom de tjocka vävnadsskivorna vid vätske- / luftgränssnittet på ett filter som stöds av ett metallgaller. Organodlingsprotokollet som beskrivs här möjliggör vävnadsmanipulationer som inte är genomförbara in vivo , och i kombination med användning av fluorescerande rapportörer ger det en plattform för identifiering och spårning av diskreta cellpopulationer i levande vävnader över tid, inklusive stamceller. Olika regulatoriska molekyler och farmakologiska föreningar kan testas i detta system för deras effekt på stamceller och deras nischer. Detta ger i slutändan ett värdefullt verktyg för att studera stamcellsreglering och underhåll.

Epitel-SC: erna finns i en nisch som kallas livmoderhalsslingan, som ligger vid den proximala änden av snittet (figur 3A). Cervikala slingor är morfologiskt distinkta strukturer som består av inre och yttre emaljepitel som omsluter stellatretikulum, en kärna av löst arrangerade epitelceller (figur 3B, C). Det finns två livmoderhalsslingor i varje framtand (figur 3A), men endast den labiala livmoderhalsslingan ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Trowell-typ organodlingsmetod har använts för att avslöja komplexa signalnätverk som styr tandutveckling och, på senare tid, för att studera reglering involverad i stamceller i den kontinuerligt växande musens framtänd. Fluorescerande reporterdjurmodeller och levande avbildningsmetoder underlättar djupgående analyser av tandstamceller och deras specifika nischmikromiljö.

Användning av organodling av Trowell-typ för att studera reglering av tandstamceller

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Organkulturen av Trowell-typ används för att odla vävnadsutplanteringar. Här visar vi hur man använder denna metod för att studera stamcellerna i kontinuerligt växande tänder. Med denna teknik kan vi studera stamcellerna och deras beteende i nischen och screena effekten av olika molekyler på överlevnad och underhåll av stamceller.Denna metod kan tillämpas för att studera stamceller från andra organ också, såsom hud eller bröstkörtel. Börja med att placera 30-millimeters metallgaller med hål med en till två millimeter diameter i en 35-millimeters petriskål. Fyll platsen med media tills mediet når gallerytan.Inkubera sedan plattan vid 37 grader Celsius tills vävnaden är isolerad och redo att odlas. Efter halshuggning av musen, ta bort huden för att exponera underkäken och skär genom massörmusklerna för att skilja underkäken från maxillan och resten av huvudet. När underkäken är isolerad, ta bort tungan och maximal mjukvävnad.Dela underkäken vid mittlinjen genom att skära genom symfysen. Placera underkäken i petriskålen som innehåller PBS på isen. Använd en engångsnål på 20 x 26 gauge för att dissekera snittet.Rengör sedan mjukvävnaden och muskelvävnaden från benytan för bättre visualisering. För mandiblar som erhållits från djur yngre än 10 dagar, använd engångs 20 x 26 gauge hypodermiska nålar för att öppna varje hälft av underkäken i längdriktningen för att exponera snitttanden. Lossa försiktigt snittet från det omgivande benet.Skär den proximala änden som innehåller livmoderhalsslingan och ta bort den mineraliserade emaljen och dentinmatrisen. Håll de uppsamlade proximala ändarna i Dulbeccos PBS på is tills de är redo att odlas. För möss äldre än 10 dagar, öppna varje hälft av underkäken i längdriktningen för att exponera snitttanden.Använd pincett för att greppa underkäken och bryta benet för att exponera tanden. Skär den proximala änden som innehåller livmoderhalsslingan. Håll de uppsamlade proximala ändarna i Dulbeccos PBS på is tills de är redo att odlas.Placera rektangelfiltren försiktigt ovanpå gallret i en förvärmd odlingsskål och orientera vävnadsbitarna ordentligt. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid och 90 till 95% fuktighet. Byt försiktigt mediet på alternativa dagar och undvik bildandet av luftbubblor.Övervaka vävnadstillväxten och ta bilder dagligen. Ta bort odlingsmediet från skålen och tillsätt försiktigt iskall metanol i vävnaden. Inkubera sedan det i fem minuter.Överför ett filter som transporterar vävnadsutväxten till provtagningsröret fyllt med fixeringslösning. Fixa explanten i 4% paraformaldehyd beredd i PBS för maximalt över natten vid fyra grader Celsius. Epitelstamcellerna finns i en nisch som kallas livmoderhalsslingan, belägen vid den proximala änden av snittet.Den livmoderhalsiga slingan består av ett inre och yttre emaljepitel som omsluter stellatretikulum, en kärna av löst arrangerade epitelceller. Varje framtand har en labial och en lingual cervikal slinga men endast labial cervikal slinga innehåller stamcellerna. Den proximala änden av en framtänd, isolerad från två dagars postnatal Sox2-GFP-möss, fångades, vilket möjliggjorde identifiering och visualisering av de Sox2-uttryckande snittepitelstamcellerna.I livmoderhalsslingor isolerade från Sox2-GFP och Fucci röda transgena möss identifierades GFP-positiva stamceller och Fucci-röd-positiva icke-proliferativa celler. Sox2-GFP-uttrycket användes som reporter för att analysera effekten av Wnt/beta-catenin-signalaktivatorn BIO, vilket negativt påverkade Sox2-uttryckande stamceller samt GFP-uttrycket. Denna teknik kan optimeras för levande avbildning av stamcellsbeteendet.Pressade eller odlade explanter kan också bearbetas enzymatiskt till encelliga suspensioner för vidare analys.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Användning av Teton system att studera molekylära mekanismer Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Metod för att studera Palatal Fusion använder statiska orgel kultur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metoder för att studera Mrp4 innehållande Makromolekylär i regleringen av Fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolering, förökning och Prion proteinuttryck under Neuronal differentiering av mänskliga Tandpulpan stamceller

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...