Name: use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol hayvanların kullanımını içerir ve tüm prosedürler Helsinki Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Etik Kurulları ve Hayvan Tesisi tarafından onaylanmıştır.
1. Organ kültürü yemeğinin hazırlanması
<ol><li>Tüm prosedürleri laminer bir akış davlumbazında gerçekleştirin. Çalışma yüzeylerini %70 etanol ile temizleyin ve otoklavlanmış cam aletler ve çözeltiler kullanın. Makası ve diğer metal ekipmanları bir cam boncuk sterilizatöründe ...

<ol>
	<li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration:+A+mini-review.">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine.">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li><li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal.">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles.">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li><li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5++progenitors.">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li><li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair.">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo.">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro.">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li><li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro.">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li><li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions.">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li><li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-catenin+signaling+limits+tooth+number.">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis.">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li><li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues:+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression.">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li><li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Wnt/beta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10.">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche.">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling.">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor.">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li><li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter.">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li><li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos:+a+review.">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li><li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).</li><li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor.">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li></ol>

İn vitro organ kültürü, organ büyümesini ve morfogenezi yöneten endüktif potansiyeli ve epitelyal-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Thesleff laboratuvarı, Trowell tipi organ kültürünün Saxén modifikasyonunun nasıl uyarlanacağını ve diş gelişimini incelemek için nasıl kullanılacağını göstermiştir14. Floresan muhabirlerindeki tekrarlanabilir koşullar ve ilerlemeler, bunu diş morfogenezini ve içindeki farklı hücre po...

Fare kesici dişleri, diş bileşenlerinin kesintisiz üretimini destekleyen kök hücrelerin (SC) ömür boyu korunması nedeniyle sürekli büyür. Bunlar, diğer hücrelerin yanı sıra emaye üreten ameloblastlar üreten epitel SC'leri ve dentin üreten odontoblastlar üreten mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) içerir1. Sürekli büyüyen kesici dişlerdeki epitel SC'leri başlangıçta etiket tutucu hücreler 2,3 olarak tanımlandı ve o zamandan beri Sox24 de dahil olmak üzere bir dizi iyi bilinen kök genini ifade ettiği gösterildi. Bu hücreler, diğer organlardaki epitel SC'leri ile ortak özellikleri paylaşır ve kesici dişin labial tarafında bulunan servikal döngü adı verilen SC nişi içinde bulunur. Niş, SC aktivitesini kontrol eden hücrelerden ve hücre dışı matristen oluşan dinamik bir varlıktır5. Soy izleme çalışmaları, Sox2+ epitel SC'lerinin dişin tüm epitel bölmesini yenileyebildiğini ve ardışık diş oluşumu için çok önemli olduğunu göstermiştir 6,7. Dentin onarıcı veya rejeneratif potansiyeli olan MSC'ler büyük ölçüde organ dışından kan damarları ve sinirler yoluyla işe alınır 8,9,10,11, bu nedenle MSC popülasyonunun işe alımını, göçünü ve barınmasını incelemek için uygun bir model sağlar.
SC'leri in vivo olarak incelemek her zaman mümkün değildir, çünkü genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonların çoğu organ homeostazını etkileyebilir ve / veya ölümcül sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle, organ kültürü, SC'lerin ve nişlerinin in vitro olarak düzenlenmesini incelemek için mükemmel bir araç sağlar. Metal bir ızgara kullanan organ kültürü sistemi başlangıçta organ gelişimini incelemek için Trowell12 tarafından geliştirildi ve böbrek gelişiminde endüktif sinyalleri incelemek için Saxen13 tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, organın tamamını veya bir kısmını kültürlemek için bu in vitro yöntem, farklı alanlarda başarıyla uygulanmıştır. Diş gelişimi alanında, bu yöntem diş gelişimini yöneten epitel-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır14 ve ardışık diş oluşumu15. Thesleff laboratuvarının çalışması, bu sistemin diş büyümesi ve morfogenezinin zamansal analizi, çeşitli moleküllerin ve büyüme faktörlerinin diş büyümesi üzerindeki etkisinin analizi ve diş gelişiminin hızlandırılmış canlı görüntülenmesi için faydasını göstermiştir16,17. Daha yakın zamanlarda, bu yöntem kesici SC'lerin ve burada ayrıntılı olarak açıklanan niş18,19'un düzenlenmesini incelemek için kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South American (CE)</td>
			<td>LifeTechn.</td>
			<td>10270106</td>
			<td>divide in aliquotes, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td>
			<td>Simon Keller Ltd</td>
			<td>4AJ-6285884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td>Store in 70% ethanol at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascobic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25g</td>
			<td>diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20&#956;l aliquotes, store at dark, -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>TopVision</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>9170442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 35 mm, with vent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>237554008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish 90 mm, no vent classic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>101RT/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of trowell-type organ culture to study regulation of dental stem cells

Organ gelişimi, işlevi ve yenilenmesi, kök hücre nişleri adı verilen ayrı anatomik boşluklarda bulunan kök hücrelere bağlıdır. Sürekli büyüyen fare kesici dişi, dokuya özgü kök hücreleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. Kesici dişin epitel dokusuna özgü kök hücreleri, dişin proksimal ucunda, servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur. Dişin kendiliğinden keskinleşen ucunun sürekli aşınmasını dengelemek için sürekli bir hücre akışı sağlarlar. Burada, kök hücreleri ve nişlerini barındıran fare kesici dişinin proksimal ucunun izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu, doku parçalarının (eksplantlar) in vitro kültürünün yanı sıra metal bir ızgara tarafından desteklenen bir filtre üzerindeki sıvı/hava arayüzündeki kalın doku dilimlerini sağlayan modifiye edilmiş bir Trowell tipi organ kültürü protokolüdür. Burada açıklanan organ kültürü protokolü , in vivo olarak mümkün olmayan doku manipülasyonlarına olanak tanır ve floresan muhabir (ler) in kullanımı ile birleştirildiğinde, kök hücreler de dahil olmak üzere zaman içinde canlı dokulardaki ayrık hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izlenmesi için bir platform sağlar. Bu sistemde çeşitli düzenleyici moleküller ve farmakolojik bileşikler, kök hücreler ve nişleri üzerindeki etkileri açısından test edilebilir. Bu sonuçta kök hücre düzenleme ve bakımını incelemek için değerli bir araç sağlar.

Epitel SC'leri, kesici dişin proksimal ucunda bulunan servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur (Şekil 3A). Servikal döngüler, gevşek düzenlenmiş epitel hücrelerinin bir çekirdeği olan stellat retikulumu çevreleyen iç ve dış emaye epitelinden oluşan morfolojik olarak farklı yapılardır (Şekil 3B, C). Her kesici dişte iki servikal döngü vardır (Şekil 3A), ancak sadece labial servik...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells at JoVE.com

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Trowell tipi organ kültürü yöntemi, diş gelişimini yöneten karmaşık sinyal ağlarını çözmek ve daha yakın zamanlarda, sürekli büyüyen fare kesici dişinin kök hücrelerinde yer alan düzenlemeleri incelemek için kullanılmıştır. Floresan muhabir hayvan modelleri ve canlı görüntüleme yöntemleri, dental kök hücrelerin ve bunların spesifik niş mikro çevrelerinin derinlemesine analizini kolaylaştırır.

Trowell Tipi Organ Kültürünün Diş Kök Hücrelerinin Düzenlenmesini Incelemek İçin Kullanılması

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Trowell tipi organ kültürü, doku eksplantlarını kültürlemek için kullanılır. Burada, sürekli büyüyen dişlerdeki kök hücreleri incelemek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu teknikle, kök hücreleri ve niş içindeki davranışlarını inceleyebilir ve çeşitli moleküllerin kök hücrelerin hayatta kalması ve bakımı üzerindeki etkisini tarayabiliriz.Bu yöntem, cilt veya meme bezi gibi diğer organların kök hücrelerini incelemek için de uygulanabilir. 35 milimetrelik bir Petri kabına bir ila iki milimetre çapında delikler içeren 30 milimetrelik metal ızgaralar yerleştirerek başlayın. Ortam ızgara yüzeyine ulaşana kadar yeri ortamla doldurun.Daha sonra, doku izole edilene ve kültüre hazır olana kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Farenin kafasını kestikten sonra, mandibulayı açığa çıkarmak için cildi çıkarın ve mandibulayı maksilladan ve başın geri kalanından ayırmak için masseter kaslarını kesin. Mandibula izole edildikten sonra, dili ve maksimum yumuşak dokuyu çıkarın.Simfizisi keserek orta hattaki mandibulayı bölün. Mandibulayı buzun üzerine PBS içeren Petri kabına yerleştirin. Kesici dişleri diseke etmek için tek kullanımlık 20 x 26 gauge hipodermik iğne kullanın.Ardından, daha iyi görselleştirme için yumuşak dokuyu ve kas dokusunu kemik yüzeyinden temizleyin. 10 günden küçük hayvanlardan elde edilen mandibulalar için, kesici dişi açığa çıkarmak için mandibulanın her yarısını uzunlamasına açmak için tek kullanımlık 20 x 26 gauge hipodermik iğneler kullanın. Kesici kesiciyi çevreleyen kemikten yavaşça ayırın.Servikal döngüyü içeren proksimal ucu kesin ve mineralize emaye ve dentin matrisini çıkarın. Dulbecco'nun PBS'sinde toplanan proksimal uçları kültüre hazır olana kadar buz üzerinde tutun. 10 günden eski fareler için, kesici dişi açığa çıkarmak için mandibulanın her yarısını uzunlamasına açın.Mandibulayı kavramak için cımbız kullanın ve dişi açığa çıkarmak için kemiği kırın. Servikal döngüyü içeren proksimal ucu kesin. Dulbecco'nun PBS'sinde toplanan proksimal uçları kültüre hazır olana kadar buz üzerinde tutun.Dikdörtgen filtreleri ızgaranın üstüne önceden ısıtılmış bir kültür kabına dikkatlice yerleştirin ve doku parçalarını uygun şekilde yönlendirin. Plakayı 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte ve% 90 ila% 95 nemde inkübe edin. Hava kabarcığı oluşumunu önleyerek alternatif günlerde ortamı dikkatlice değiştirin.Doku büyümesini izleyin ve günlük görüntüler yakalayın. Kültür ortamını çanaktan çıkarın ve dokuya buz gibi soğuk metanolü dikkatlice ekleyin. Ardından, beş dakika boyunca kuluçkaya yatırın.Doku eksplantını taşıyan bir filtreyi, sabitleme çözeltisi ile doldurulmuş numune alma tüpüne aktarın. Eksplantı, PBS'de hazırlanan% 4'lük paraformaldehit içinde, maksimum gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Epitel kök hücreleri, kesici dişin proksimal ucunda bulunan servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur.Servikal döngü, gevşek düzenlenmiş epitel hücrelerinin bir çekirdeği olan yıldız retikulumunu kaplayan bir iç ve dış emaye epitelini içerir. Her kesici dişin bir labial ve bir lingual servikal döngüsü vardır, ancak sadece labial servikal döngü kök hücreleri içerir. İki günlük doğum sonrası Sox2-GFP farelerinden izole edilen bir kesici dişin proksimal ucu yakalandı ve Sox2 eksprese eden kesici epitel kök hücrelerinin tanımlanması ve görselleştirilmesi sağlandı.Sox2-GFP ve Fucci kırmızı transgenik farelerden izole edilen servikal döngülerde, GFP-pozitif kök hücreler ve Fucci-kırmızı-pozitif proliferatif olmayan hücreler tanımlandı. Sox2-GFP ekspresyonu, Sox2 ekspresyonunu ve GFP ekspresyonunu olumsuz yönde etkileyen Wnt / beta-katenin sinyal aktivatörü BIO'nun etkisini analiz etmek için bir muhabir olarak kullanıldı. Bu teknik, kök hücre davranışının canlı görüntülenmesi için optimize edilebilir.Preslenmiş veya kültürlenmiş eksplantlar, daha fazla analiz için enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara da işlenebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Yöntemler Fibroblast Göç Yönetmeliği Mrp4 içeren makromoleküler kompleksler Eğitim için

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...