이 프로토콜은 세포 주기 단계를 고려하여 DNA 손상 복구 단백질의 공간 및 측두적인 모집을 이해하는 데 도움이됩니다. 세포 주기 차별을 위해, 우리는 다른 세포 주기 동기화 방법에 의해 소개된 유물을 우회하는 S 단계의 마커로 형광 단백질 태그 PCNA를 이용합니다. 이것은 레이저 기지를 둔 미세 조사와 결합된 DNA 손상 복구 단백질 운동학에 비교할 수 없는 현면 적 해결책을 줍니다.
프로토콜의 일상적인 활용에 성공하면 공초점 이미징에 대한 기본적인 지식이 구축됩니다. 마이크로 조사 24시간 전에, 500마이크로리터에서 네 번째 세포에 총 8x10을 4웰 챔버 커버 글래스에 1밀리리터의 미디어에 플레이트. 미세 조사 1시간 전에 일반 성장 배지를 olaparib 또는 DMSO와 같은 차량 제어를 포함하는 이미징 매체와 교환합니다.
이미징 하기 전에 적어도 4 시간, 환경 챔버와 현미경 구성 요소를 켭니다. 난방, 이산화탄소 공급 및 습도 조절장치를 켭합니다. 현미경으로 세포를 전송하기 전에 적어도 1 시간 레이저 라인과 함께 광원을 초기화.
현미경 목표를 오일과 현미경 아래에 챔버 커버 유리를 배치합니다. 비동기 집단에서 S 상 세포를 선택하려면, S 단계에서 태그된 PCNA의 고유한 국소화 패턴을 위해 안구를 살펴보고 미세 조사를 위한 충분한 S 상 세포가 있는 시야를 선택한다. 관련 소프트웨어를 사용하여 이진 선을 삽입하여 미세 조사에 대한 관심 영역을 설정합니다.
원하는 라인 수와 간격을 설정하려면 바이너리를 클릭한 다음 원하는 라인 수를 그리기 위해 인서트 라인, 원 및 타원을 선택한 다음 ROI를 클릭하여 이러한 이진 선을 자극 ROI로 변환한 다음 이진선을 ROI로 이동한 다음 ROI로 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 활성화 ROI S1로 사용을 선택합니다. 이 선을 시야에 배치하여 세포의 핵을 통과합니다. 마이크로 조사 전에, 이후 분석을 위해 PCNA foci를 식별하기 위해, A1 LFOV 컴팩트 GUI및 A1 LFOV 스캔 영역 창에 필요한 매개 변수를 설정하여 시야의 고해상도 이미지를 가져 와서 캡처 버튼을 누르십시오. 마이크로 조사를 설정하려면 ND 자극 탭을 열고 시간 일정 창에 액세스하여 일련의 사전 자극 이미지를 획득한 다음 Galvano 스캐너를 사용하여 일련의 자극 후 이미지를 수집합니다.
시간 예약 창에 세 단계를 설정합니다. 인수 및 자극 열에서 3단계에 대해 각각 인수, 자극 및 인수를 선택합니다. 자극 단계의 경우 S1을 ROI로 설정합니다.
Galvano XY 창에서 405 나노미터 레이저 라인에 대해 100% 레이저 출력을 설정하고 미세 조사를 위한 거주 시간을 설정합니다. 원하는 시간 경과 이미징을 원하는 시간 경과 및 간격에 설정하려면 시간 일정 A1 LFOV 컴팩트 GUI 및 A1 LFOV 스캔 영역 창을 사용합니다. A1 LFOV 컴팩트 GUI 창에서 이미징 중에 사진 표백을 줄이기 위해 레이저 전력 백분율, 게인 및 오프셋 설정을 최적화합니다.
단백질의 역학에 따라 시간 일정 창에서 제 3 상 획득 행에 대해 원하는 간격과 기간을 설정하여 이미지 또는 총 타임랩스의 간격을 연장또는 단축한다. 마이크로 조사 및 후속 타임랩스 이미징을 실행하려면 지금 실행하십시오. 타임랩스 이미징의 끝에서 자극 ROI를 별도의 이미지로 저장하여 분석에 사용되는 다운스트림 소프트웨어에서 미세 조사 좌표를 식별하는 데 유용합니다.
PCNA는 G1 및 G2 상에서 핵에 완전히 균일한 분포를 가지고 있습니다. S 단계에서 PCNA는 핵에서 밝은 반점으로 시각화할 수 있는 DNA 복제 부위를 국소화합니다. 초기 S 상 세포에서, 반점은 세포의 핵을 통해 상대적으로 작고 동등하게 분포된다.
S 단계 중반으로 진행되는 동안, 반점은 흐리게되고 핵과 핵의 둘레를 향해 더 국한된다. 후반 S 단계에서는 스팟이 줄어들지만 PCNA가 후반 복제 사이트에 집중됨에 따라 점점 더 커집니다. 1, 000 마이크로초의 저용량 에너지는 이중 파손 대응자인 EGFP-FBXL10의 모집을 유도하지 않지만 산화 DNA 손상 부위에 모집되는 기본 절제 수리 경로 단백질인 NTHL1-mCherry의 모집을 유도하기에 충분합니다.
3, 000 마이크로초가 거주하면서 EGFP-FBXL10과 NTHL1-mCherry가 모두 모집되어 산화 병변과 이중 좌초 된 휴식을 모두 생성하는 레이저 출력을 시연합니다. EXO1b는 1분 전후의 축적 및 미세 조사 부위의 최대 수준에 도달한 다음 DNA 병변에서 서서히 분리하기 시작합니다. olaparib의 존재에서, 1 분에 레이저 스트라이프에 EXO1b의 축적은 차량 제어에 비해 상당히 적습니다.
현미경은 가열할 충분한 시간이 주어지며, 일관된 결과를 보장하기 위해 각 실험에 문화와 조건이 최적이라는 것이 중요합니다. 또한, 특정 DNA 병변을 테스트 하기 위해 다른 DNA 손상 기자와 레이저 설정을 최적화 하는 것이 중요 하다. 미세 조사에 따라 분획, 면역 침전 또는 ChIP와 같은 고전적인 생화학 적 방법으로 결과를 검증하는 것이 좋습니다.
이러한 접근은 더 큰 세포 인구를 샘플링하여 통계적 강도를 제공합니다.
