Name: a generalized method for determining free soluble phenolic acid composition and antioxidant capacity of cereals and legumes
Uploaded: 2022-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes at JoVE.com

המחברים מכירים בהכרת תודה על התמיכה הטכנית של גב ' אליסון סר וגב ' האנה אודורו-אובנג, כמו גם על התמיכה בעריכת וידאו על ידי גב 'ג'ניס פג'רדו ומר מיגל דל רוסאריו.

1. סוג הדגימות
<ol><li>השתמש בחמש דגימות דגנים מלאים, הכוללות שני דגנים (למשל, חיטת דורום ותירס צהוב) ושלוש קטניות (למשל, שעועית פרה שחורה, סויה ושעועית אדומה) לצורך מחקר זה.</li>
	<li>טוחנים 50 גרם של כל גרגר במשולש לקמח, באמצעות מטחנת קפה, ומעבירים אותם דרך מסננת של 500 מיקרומטר.</li>
	<li>אחסן או?...

<ol>
	<li>Huitu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon,+endophytes+and+secondary+metabolites+as+grass+defenses+against+mammalian+herbivores.">Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).</li><li>Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+phenolic+acids+affect+the+virulence+of+Pectobacterium+aroidearum+and+P.+carotovorum+ssp.+brasiliense+via+quorum+sensing+regulation.">Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).</li><li>Dykes, L., Rooney, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenolic+compounds+in+cereal+grains+and+their+health+benefits.">Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits.</a> Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).</li><li>Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+phenolic+compounds+and+antioxidant+activity+of+finger+millet+varieties.">Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties.</a> Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).</li><li>Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+properties+of+commercial+wild+rice+and+analysis+of+soluble+and+insoluble+phenolic+acids.">Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids.</a> Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).</li><li>Beverly, R. L., Motarjemi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).</li><li>FAO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+Outlook+-+Biannual+report+on+global+food+markets.">Food Outlook - Biannual report on global food markets.</a> Food and Agriculture Organization. , (2020).</li><li>Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+in+human+nutrition.+Nutrient+content+and+protein+quality+of+pulses.">Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses.</a> Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).</li><li>Due&#241;as, M., Hern&#225;ndez, T., Estrella, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+in+vitro+antioxidant+capacity+of+the+seed+coat+and+the+cotyledon+of+legumes+in+relation+to+their+phenolic+contents.">Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents.</a> Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).</li><li>Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenolic+profiles+and+antioxidant+activity+of+germinated+legumes.">Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes.</a> Foods. 5 (2), 27 (2016).</li><li>Hefni, M. E., Amann, L. S., Witth&#246;ft, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HPLC-UV+method+for+the+quantification+of+phenolic+acids+in+cereals.">A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals.</a> Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).</li><li>AOAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).</li><li>Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrothermal+extraction,+a+promising+method+for+concentrating+phenolic+antioxidants+from+red+osier+dogwood+(Cornus+stolonifer)+leaves+and+stems.">Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems.</a> Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).</li><li>Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorghum-cowpea+composite+porridge+as+a+functional+food,+Part+II:+Antioxidant+properties+as+affected+by+simulated+in+vitro+gastrointestinal+digestion.">Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion.</a> Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).</li><li>Robbins, R. J., Bean, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+high-performance+liquid+chromatography-photodiode+array+detection+measurement+system+for+phenolic+acids.">Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids.</a> Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).</li><li>Singleton, V. L., Rossi, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetry+of+total+phenolics+with+phosphomolybdic-phosphotungstic+acid+reagents.">Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).</li><li>Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+methods+for+the+determination+of+antioxidant+capacity+and+phenolics+in+foods+and+dietary+supplements.">Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).</li><li>Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+total+phenolic+content+and+other+oxidation+substrates+in+plant+tissues+using+Folin-Ciocalteu+reagent.">Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent.</a> Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).</li><li>Waterhouse, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+total+phenolics.">Determination of total phenolics.</a> Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).</li><li>Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+behind+antioxidant+capacity+assays.">The chemistry behind antioxidant capacity assays.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).</li><li>Esterbauer, H., W&#228;g, G., Puhl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+peroxidation+and+its+role+in+atherosclerosis.">Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis.</a> British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).</li><li>Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., J&#252;rgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lipid+peroxidation+and+antioxidants+in+oxidative+modification+of+LDL.">The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL.</a> Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).</li><li>Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenolic+composition+and+antioxidant+properties+of+Koose,+a+deep-fat+fried+cowpea+cake.">Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake.</a> Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).</li></ol>

הדגנים המלאים נבחרו כדגני דגנים וקטניות מייצגים שמוצאים שימושים נרחבים במזון ברחבי העולם. בעוד ששינויים עשויים להתקיים בין זנים של כל גרגר, מוקד המחקר הזה היה להדגים שיטה כללית למיצוי ואנליזה של חומצה פנולית בחינם עבור דגנים מלאים. שיטת המיצוי שונתה על ידי הפחתה משמעותית של כמויות הדגימו...

חומצות פנוליות הן בין הפיטוכימיקלים החשובים ביותר שנחקרו בצמחים בשל התפקיד החיוני שהם ממלאים בהגנה על הצמחים מפני זיהום עשבוני ופטרייתי, כמו גם בשמירה על תמיכה מבנית ושלמות ברקמות הצמח 1,2. הם מצויים בשפע בסובין של דגנים ובמעיל זרעים של קטניות3. מבחינה מבנית, הם מחולקים לשתי קבוצות: החומצות ההידרוקסיבנזואיות (איור 1) וחומצות הידרוקסיצינמיות (איור 2). החומצות ההידרוקסיבנזואיות הנפוצות בדגנים ובקטניות כוללות חומצות גאליות, p-הידרוקסיבנזואיות, 2,4-דיהידרוקסיבנזואיות, פרוטוקאצ'ואיות, וניליות וסירינגיות, בעוד שהחומצות ההידרוקסיצינמיות הנפוצות כוללות חומצות קפאיות, p-קומרית, פרוליות וסינפיות3. לחומצות פנוליות יש גם תכונות נוגדות חמצון, שכן הן מסוגלות לטרוף רדיקלים חופשיים, הגורמים לעופש חמצוני בשומנים, וליזום ולהפיץ עקה חמצונית הנגרמת על ידי רדיקלים במערכות פיזיולוגיות 4,5. בשל תפקיד פיזיולוגי חיוני זה כמו נוגדי חמצון, הם הנושא של המחקר האחרון. הסיבה לכך היא שכאשר הם נצרכים כמרכיבים של מזונות צמחיים, הם יכולים להפעיל הגנה נוגדת חמצון.
דגנים ומוצרי דגנים הם מקורות מזון עיקריים לפחמימות עבור בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם6. דגנים כוללים חיטה, אורז, תירס (תירס), שעורה, טריטיקל, דוחן וסורגום. ביניהם, התירס הוא המנוצל ביותר, עם ניצול עולמי מוערך של 1,135.7 מיליון טון בשנת 2019/2020, ואחריו חיטה עם ניצול עולמי מוערך של 757.5 מיליון טון באותה תקופה7. מזונות דגנים הם מקורות אנרגיה נהדרים לצרכנים שכן הם מקורות עשירים של פחמימות. הם גם מספקים קצת חלבון, שומן, סיבים, ויטמינים ומינרלים6. בנוסף לערכם התזונתי, דגנים הם מקורות טובים לנוגדי חמצון פיטוכימיים, במיוחד חומצות פנוליות, שיש להן פוטנציאל להגן על המערכת הפיזיולוגית מפני נזקי חמצון הנגרמים על ידי רדיקלים3. קטניות הן גם מקורות טובים של חומרים מזינים והן בדרך כלל עשירות יותר בחלבון מאשר דגנים. הם מכילים גם ויטמינים ומינרלים ומשמשים להכנת מזונות שונים8. בנוסף, קטניות הן מקורות טובים למגוון נוגדי חמצון פיטוכימיים, כולל חומצות פנוליות, פלבנואידים, אנתוציאנינים ופרואנתוציאנידינים 9,10. זנים שונים של דגנים וקטניות עשויים להיות בעלי הרכב שונה של חומצה פנולית. לכן יש צורך לחקור את הרכב החומצה הפנולית של דגנים וקטניות ואת הזנים שלהם, על מנת לדעת את היתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלהם ביחס לנוגדי חמצון פנוליים.
מספר בדיקות דווחו על מדידת כמות החומצות הפנוליות בדגנים ובגרגרי קטניות, וקביעת פעילותן נוגדת החמצון. שיטות הניתוח הנפוצות ביותר עבור חומצות פנוליות מדגנים מלאים הן ספקטרופוטומטריה וכרומטוגרפיה נוזלית11. מטרת עבודה זו הייתה להדגים שיטה כרומטוגרפית נוזלית כללית בלחץ גבוה לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה חופשית, ושיטות ספקטרופוטומטריות לקביעת התכולה הפנולית הכוללת והיכולת נוגדת החמצון של חלק מדגנים מלאים וקטניות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber glass ID Surestop vial</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C5000-2W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440914-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#39;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) &#8805;98%,</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1888-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D913-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), &#8805;98%</td>
			<td>Fluka Chemika</td>
			<td>56510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>60180-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioTek ELx800 microplate reader</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BT-ELX800NB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance SI-114</td>
			<td>Denver Instrument</td>
			<td>SI-114.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler, Waters 717 Plus</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT078900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z245143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Filter (0.45 &#181;m PVDF Membrane)</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>HVLP04700&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Membrane Filters (0.45 &#181;m HV)</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>HVHP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 0.5-5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 10-100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E195-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferulic acid standard</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>128708-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC119245000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin &#38; Ciocalteu phenol reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 99%</td>
			<td>Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a</td>
			<td>27048-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic acid standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695</td>
			<td>Waters</td>
			<td>960402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipet tips, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>21-197-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 &#181;L</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode array detector, Waters 2996</td>
			<td>Waters</td>
			<td>720000350EN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 1-5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82018-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium persulfate (K2S2O8), &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216224-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4321-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17326-103030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roto evaporator, IKA RV 10</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0010005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S263-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Mallinckrodt AR&#174;</td>
			<td>7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4)</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardization pipet tips 0-200&#181;L</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Driven Filter unit (0.22 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Millex&#174;-GV</td>
			<td>SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target micro-serts vial insert (400 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZRQSVP030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a generalized method for determining free soluble phenolic acid composition and antioxidant capacity of cereals and legumes

חומצות פנוליות הן סוג של תרכובות אורגניות הנושאות הן קבוצה פנולית והן קבוצה קרבוקסילית. הם נמצאים בדגנים ומתרכזים בסובין של דגנים או בציפוי זרעים של קטניות. הם בעלי תכונות נוגדות חמצון שעוררו עניין מחקרי רב בשנים האחרונות, על תפקודי הבריאות המגנים הפוטנציאליים שלהם. עבודה זו מציגה שיטה כללית למיצוי של חומצות פנוליות מסיסות בחינם מדגנים מלאים וניתוח של יכולת נוגדת החמצון שלהם. נעשה שימוש בחמש דגימות מדגנים מלאים שכללו שני דגנים (חיטה ותירס צהוב) ושלוש קטניות (שעועית פרה, שעועית כליה וסויה). הדגנים נטחנו לקמח והחומצות הפנוליות המסיסות בחופשיות שלהם הופקו באמצעות מתנול מימי. לאחר מכן זוהו התרכובות באמצעות כרומטוגרף נוזלי בלחץ גבוה (HPLC). שיטת Folin-Ciocalteu שימשה לקביעת התכולה הפנולית הכוללת שלהם, בעוד שיכולות נוגדות החמצון שלהם נקבעו באמצעות יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH, יכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC) ויכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC). החומצות הפנוליות שזוהו כללו חומצות וניליות, קפאיות, p-קומרית ופרולית. חומצה ונילית זוהתה רק ב-cowpea בעוד שחומצה קפאית זוהתה רק בפולים בכליות. חומצה p-Coumaric זוהתה בתירס צהוב, פרה וסויה, בעוד שחומצה פרולית זוהתה בכל הדגימות. חומצה פרולית הייתה החומצה הפנולית השלטת שזוהתה. הריכוז הכולל של חומצות פנוליות בדגימות ירד בסדר הבא: פולי סויה > שעועית פרה > תירס צהוב = שעועית כליה > חיטה. היכולת נוגדת החמצון הכוללת (סכום הערכים של מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC) ירדה באופן הבא: פולי סויה > שעועית כליות > תירס צהוב = שעועית פרה > חיטה. מחקר זה הגיע למסקנה כי ניתוח HPLC, כמו גם מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC מספקים מידע שימושי על הרכב החומצה הפנולית ועל התכונות נוגדות החמצון של דגנים מלאים.

טבלה 2 מציגה את החומצות הפנוליות שזוהו בדגנים ובגרגרי הקטניות. בהתבסס על סטנדרטים אותנטיים זמינים, ארבע חומצות פנוליות זוהו בדגימות והן: חומצות וניליות, קפאיות, p-קומרית ופרוליות. חומצה ונילית היא חומצה הידרוקסיבנזואית ואילו שלוש האחרות הן חומצות הידרוקסיצינמיות. חומצה וניל...

Watch this Scientific Journal Video about A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes at JoVE.com

A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes

חומצות פנוליות הן פיטוכימיקלים חשובים הנמצאים בדגנים מלאים. יש להם תכונות ביו-אקטיביות כגון פונקציות הגנה נוגדות חמצון. עבודה זו נועדה לדווח על שיטה כללית לזיהוי HPLC, הערכת תכולה פנולית כוללת וקביעת היכולת נוגדת החמצון של חומצות פנוליות בדגנים וקטניות.

שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה באופן חופשי ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות

Phenolic acids are a class of organic compounds that bear both a phenolic group, and a carboxylic group. They are found in grains and concentrate in the ...

שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה חופשית ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות. דגנים מלאים, כולל דגנים וקטניות, מהווים חלק ניכר מהתזונה האנושית. הרלוונטיות התזונתית שלהם לבני אדם הוכרה זה מכבר.עם זאת, לאחרונה דווח על היתרונות הבריאותיים המגנים נוגדי החמצון שלהם. חומצות פנוליות הנמצאות בשכבות הדגנים החיצוניות של הדגנים ובציפוי הזרעים של הקטניות תורמות לתכונות נוגדות החמצון של דגנים מלאים. הם שולפים רדיקלים חופשיים שגורמים נזק חמצוני לביו-מולקולות.שני הסוגים של חומצות פנוליות הנמצאות בדגנים מלאים הן חומצות הידרוקסיבנזואיות וחומצות הידרוקסיצינמיות. מחקר זה מספק שיטה פשוטה למיצוי חומצות פנוליות מדגנים מלאים וקביעת יכולת נוגדת החמצון במבחנה שלהן. השתמש בחמש דגימות דגנים מלאים למחקר זה, חיטת דורום, תירס צהוב, שעועית פרה שחורת עיניים, סויה ושעועית כליה אדומה.שקלו במדויק 100 מיליגרם של דגימת הקמח המלא ישירות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בצבע ענבר, בעל קיבולת של שני מיליליטרים. הצבע הכהה של הצינור מסייע למנוע חשיפה של התערובת לאור. הוסיפו מיליליטר אחד של 80% מתנול מימי לכל אחד מהצינורות המכילים דוגמאות.מערבולת לזמן קצר כדי לערבב את תמיסת מתנול ואת המדגם. Sonicate את הדגימות במשך 60 דקות כדי לחלץ את התרכובות הפנוליות המסיסות בחינם. שים כיסוי על הדגימות למשך משך הסוניקה להגנה נוספת מפני אור.לאחר הסוניקציה, צנטריפוגה התערובות ב 20, 000 פעמים G במשך חמש דקות כדי להקדיש את שאריות מוצק, משאיר את supernatant על גבי. תרכובות פנוליות חופשיות יהיו קיימות בסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה. יש לסנן את ה-supernatant לפני ההזרקה למכשיר ה-HPLC.כדי לסנן את המזרק, הסר את הבוכנה של מזרק 3 מ"ל והצמד מסנן מזרק. המסנן צריך להיות בגודל נקבובית לא גדול מ 0.22 מיקרומטר. פיפטה כ-0.4 מיליליטרים של ה-supernatant לתוך החלק העליון של המזרק.הכנס מחדש את הבוכנה ודחף את הנוזל דרך המסנן לתוך בקבוקון HPLC המכיל תוספת בקבוקון. לאחר שהמכשיר הוגדר להפעלת השיטה המתוארת בכתב היד לניתוח HPLC, טען את הבקבוקונים לתוך הקרוסלה כדי להתאים לרשימת הדגימות. קבל כרומטוגרמות HPLC ב-320 ננומטר ו-280 ננומטר, המציגות פסגות שונות המייצגות תרכובות פנוליות שונות.באמצעות עקומות סטנדרטיות מתאימות, כימתו חומצות הידרוקסיצינמיות ב-320 ננומטר מכיוון שיש להן ספיגה מקסימלית באורך גל זה. על פי אותו עיקרון, לכמת חומצות הידרוקסיבנזואיות ב 280 ננומטר. השתמשו ב-Trolox, אנלוגיה מסיסה במים של ויטמין E, כסטנדרט כדי להעריך את היכולת נוגדת החמצון במבחנה של תמציות הדגנים המלאים.שקלו במדויק מיליגרם אחד של טרלוקס לתוך צינור פלקון. להמיס עם ארבעה מיליליטרים של 50% מתנול מימי כדי להכין תמיסת מלאי של מילימול אחד לליטר, שזהה ל 1000 מיקרומול לליטר. הכינו שישה ריכוזים של Trolox שהם 50, 100, 200, 400, 600 ו-800 מיקרומול לליטר כדי להתוות עקומות סטנדרטיות להערכת יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH והיכולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox, TEAC.באופן דומה, הכינו ריכוזי Trolox של 6.25, 12.5, 25 ו-50 מיקרומול לליטר להערכת יכולת הספיגה של רדיקלי חמצן, ORAC. הרכיבו את הנפח הכולל של כל ריכוז ל-500 מיקרוליטרים, כפי שמוצג בטבלה הראשונה. דיללו את תמציות הדגימה עם מתנול לפני הניתוח.כאן, תמציות תירס צהוב ופרות דוללו פעמיים. תמציות החיטה ופולי הכליה דוללו חמש פעמים, בעוד תמצית הסויה דוללה 10 פעמים במתנול. שקלו 8.23 מיליגרם של ABTS לתוך צינור צנטריפוגות מיקרו ענברי נקי בעל קיבולת של שני מיליליטרים.לאחר מכן, שקלו 1.62 מיליגרם של אשלגן פרסולפט לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו-צנטריפוגה נקי של שני מיליליטרים. ממיסים כל אחד מהכימיקלים השקולים במים מזוקקים מיליליטר אחד על ידי מערבולת. התוצאה היא תמיסת ABTS של 16 מילימולר ותמיסת פרסולפט של שישה מילימולרים.הכן את תמיסת מלאי ABTS על ידי ערבוב תמיסות ABTS ואשלגן פרסולפט בכמויות שוות. הפתרון ישתנה מיד לצבע כהה. אפשרו לתערובת זו לדגור בחושך במשך 12 עד 16 שעות.דיללו את תמיסת המניות של ABTS פי 30 עם 200 מילולרית עם תמיסת מחיצת פוספט כדי ליצור את פתרון העבודה של ABTS. לשם כך, הוסף 58 מיליליטרים של 200 מילימולר PBS לשני מיליליטרים של פתרון העבודה ABTS. תמיסת העבודה תכיל 0.27 מילימולאר ABTS ו-0.1 מילימולאר אשלגן פרסולפט.לצורך הניתוח, יש למקם 10 מיקרוליטרים של כל תמצית מדוללת במיקרו-לוחית של 96 בארות. הוסיפו 190 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה ABTS לכל באר ודגרו למשך 60 דקות. מדוד את הספיגה של תערובות התגובה ב-750 ננומטר בקורא מיקרו-לוחות.השתמש בתקני Trolox בריכוזים הנעים בין 100 ל-800 מיקרומול לליטר כדי להתוות עקומת כיול. הבדיקה נוגדת החמצון DPPH דורשת תרכובת יוצרת רדיקלים, DPPH. שקלו 1.2 מיליגרם של DPPH לתוך צינור צנטריפוגה ריק בקיבולת של 15 מיליליטר.ממיסים את ה-DPPH במתנול כדי להכין תמיסה של 60 מיקרומולרים. בדיקת ה-DPPH בודקת את היכולת של תמציות הדגימה לנטרל רדיקלים חופשיים המיוצרים על ידי DPPH. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תמצית דגימה לבארות המיקרו-פלטה.לאחר מכן, הוסף 195 מיקרוליטרים של 60 מיקרומולר DPPH תמיסה מתאנולית ודגירה למשך 60 דקות. מדוד את הספיגה ב-515 ננומטר. השתמש בתקני Trolox כדי להתוות עקומת כיול.איור ראשון מראה את המבנה של חומצות הידרוקסיבנזואיות שנמצאות בדגנים המלאים. במחקר הנוכחי, חומצה ונילית הייתה החומצה ההידרוקסיבנזואית היחידה שזוהתה. איור 2 מראה את המבנה של חומצות הידרוקסיצינמיות שנמצאות בדגנים מלאים.במחקר הנוכחי זוהו בדגימות חומצות p-coumaric, caffeic וחומצות פרוליות. טבלה 2 מציגה את החומצות הפנוליות שזוהו בדגימות. כפי שצוין קודם לכן, חומצה ונילית הייתה החומצה ההידרוקסיבנזואית היחידה שזוהתה בדגימות.הוא זוהה בתמצית הפרה בלבד. החומצה ההידרוקסיצינמית קפאית זוהתה רק בפולים בכליות, בעוד שחומצה p-קומרית זוהתה בתירס צהוב, פרה וסויה. חומצה פרולית זוהתה בכל הדגימות והייתה החומצה הפנולית השלטת בדגימות.הריכוז הכולל של החומצות הפנוליות לפי הסדר מהגדול ביותר לפחות היה בסדר סויה, פרה, תירס צהוב ושעועית כליה או שווה ערך, ואחריו חיטה. טבלה 3 הראתה את התכולה הפנולית הכוללת ואת היכולת נוגדת החמצון של הדגימות. היכולת נוגדת החמצון כללה את יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH, TEAC, ORAC, והיכולת נוגדת החמצון הכוללת של הדגימות.היכולת נוגדת החמצון הכוללת היא סכום הערכים DPPH, TEAC ו-ORAC. בדומה לטבלה השנייה, לסויה הייתה היכולת נוגדת החמצון הכוללת הגבוהה ביותר. עם זאת, במקום cowpea, זה היה דווקא שעועית הכליה כי היה השני הגבוה ביותר קיבולת נוגדת חמצון הכוללת, אם כי cowpea היה השני הגבוה ביותר תוכן חומצה פנולית הכוללת.אנומליה זו קשורה למבנים של חומצות פנוליות בודדות ולהשפעה האנטגוניסטית האפשרית של החומצה ההידרוקסיבנזואית הווניל על ההשפעות נוגדות החמצון של חומצות הידרוקסיצינמיות ב cowpea. מחקר זה הגיע למסקנה כי דגנים מלאים שונים בהרכבי החומצה הפנולית שלהם. מבין הדגנים המלאים שנחקרו, סויה יש את הכמות הכוללת הגבוהה ביותר של חומצות פנוליות, ובהתאם, את היכולת נוגדת החמצון הגבוהה ביותר.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

הכנה של חלקיקי סיליקה באמצעות חומצה קטליזה בסיוע מיקרוגל

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Towards Biomimicking Wood: Fabricated Free-standing Films of Nanocellulose, Lignin, and a Synthetic Polycation

לקראת Biomimicking עץ: סרטים מפוברק חופשי עומדים בNanocellulose, ליגנין, וPolycation סינטטי

Woody materials are comprised of plant cell walls that contain a layered secondary cell wall composed of structural polymers of polysaccharides and ...

Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications

סינתזה של Cd-חינם InP / ZnS Quantum Dots מתאים עבור יישומים ביו

Fluorescent nanocrystals, specifically quantum dots, have been a useful tool for many biomedical applications. For successful use in biological systems, ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

סינתזה של מערך מורכב מתכת-אורגנית נמס במים

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

קביעת ההרכב הכימי של ממשקי קורוזיה מונעים / מתכת עם XPS: חמצון טבילת הודעת מזעור

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Synthesis Method for Cellulose Nanofiber Biotemplated Palladium Composite Aerogels

שיטת הסינתזה של הננו-סיבים תאית ביותבניות פלדיום מרוכבים

Here, a method to synthesize cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented. Noble metal aerogel synthesis methods often ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides