Name: a generalized method for determining free soluble phenolic acid composition and antioxidant capacity of cereals and legumes
Uploaded: 2022-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes at JoVE.com

Os autores agradecem o apoio técnico da Sra. Alison Ser e da Sra. Hannah Oduro-Obeng, bem como o apoio de edição de vídeo da Sra. Janice Fajardo e do Sr. Miguel del Rosario.

1. Tipo de amostras
<ol><li>Use cinco amostras integrais de grãos, compreendendo dois cereais (por exemplo, trigo durum e milho amarelo) e três leguminosas (por exemplo, feijão-de-vaca-preto, soja e feijão-rim vermelho) para este estudo.</li>
	<li>Moinho 50 g de cada grão em triplicado em farinha, usando um moedor de café, e passá-los através de uma peneira de 500 μm.</li>
	<li>Armazená-los a -20 °C.</li>
</ol>2. Preparação da amostra
<ol><li>
<st...

<ol>
	<li>Huitu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon,+endophytes+and+secondary+metabolites+as+grass+defenses+against+mammalian+herbivores.">Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).</li><li>Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+phenolic+acids+affect+the+virulence+of+Pectobacterium+aroidearum+and+P.+carotovorum+ssp.+brasiliense+via+quorum+sensing+regulation.">Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).</li><li>Dykes, L., Rooney, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenolic+compounds+in+cereal+grains+and+their+health+benefits.">Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits.</a> Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).</li><li>Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+phenolic+compounds+and+antioxidant+activity+of+finger+millet+varieties.">Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties.</a> Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).</li><li>Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+properties+of+commercial+wild+rice+and+analysis+of+soluble+and+insoluble+phenolic+acids.">Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids.</a> Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).</li><li>Beverly, R. L., Motarjemi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).</li><li>FAO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+Outlook+-+Biannual+report+on+global+food+markets.">Food Outlook - Biannual report on global food markets.</a> Food and Agriculture Organization. , (2020).</li><li>Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+in+human+nutrition.+Nutrient+content+and+protein+quality+of+pulses.">Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses.</a> Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).</li><li>Due&#241;as, M., Hern&#225;ndez, T., Estrella, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+in+vitro+antioxidant+capacity+of+the+seed+coat+and+the+cotyledon+of+legumes+in+relation+to+their+phenolic+contents.">Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents.</a> Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).</li><li>Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenolic+profiles+and+antioxidant+activity+of+germinated+legumes.">Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes.</a> Foods. 5 (2), 27 (2016).</li><li>Hefni, M. E., Amann, L. S., Witth&#246;ft, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HPLC-UV+method+for+the+quantification+of+phenolic+acids+in+cereals.">A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals.</a> Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).</li><li>AOAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).</li><li>Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrothermal+extraction,+a+promising+method+for+concentrating+phenolic+antioxidants+from+red+osier+dogwood+(Cornus+stolonifer)+leaves+and+stems.">Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems.</a> Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).</li><li>Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorghum-cowpea+composite+porridge+as+a+functional+food,+Part+II:+Antioxidant+properties+as+affected+by+simulated+in+vitro+gastrointestinal+digestion.">Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion.</a> Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).</li><li>Robbins, R. J., Bean, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+high-performance+liquid+chromatography-photodiode+array+detection+measurement+system+for+phenolic+acids.">Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids.</a> Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).</li><li>Singleton, V. L., Rossi, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetry+of+total+phenolics+with+phosphomolybdic-phosphotungstic+acid+reagents.">Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).</li><li>Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+methods+for+the+determination+of+antioxidant+capacity+and+phenolics+in+foods+and+dietary+supplements.">Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).</li><li>Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+total+phenolic+content+and+other+oxidation+substrates+in+plant+tissues+using+Folin-Ciocalteu+reagent.">Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent.</a> Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).</li><li>Waterhouse, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+total+phenolics.">Determination of total phenolics.</a> Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).</li><li>Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+behind+antioxidant+capacity+assays.">The chemistry behind antioxidant capacity assays.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).</li><li>Esterbauer, H., W&#228;g, G., Puhl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+peroxidation+and+its+role+in+atherosclerosis.">Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis.</a> British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).</li><li>Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., J&#252;rgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lipid+peroxidation+and+antioxidants+in+oxidative+modification+of+LDL.">The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL.</a> Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).</li><li>Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenolic+composition+and+antioxidant+properties+of+Koose,+a+deep-fat+fried+cowpea+cake.">Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake.</a> Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).</li></ol>

Os grãos integrais foram selecionados como grãos de cereais e leguminosas representativas que encontram amplas aplicações alimentares em todo o mundo. Embora possam existir variações entre cultivares de cada grão, o foco deste estudo foi demonstrar um método generalizado de extração e análise de ácido fenólico gratuito para grãos integrais. O método de extração foi modificado reduzindo substancialmente as quantidades de amostras e solventes, a fim de reduzir a quantidade de produtos químicos que seriam ...

Os ácidos fenólicos estão entre os fitoquímicos mais importantes estudados nas plantas devido ao papel vital que desempenham na defesa vegetal contra a infecção herbívora e fúngica, bem como a manutenção do suporte estrutural e integridade nos tecidos vegetais 1,2. Eles são abundantes no farelo de cereais e sementes de leguminosas3. Estruturalmente, eles são divididos em dois grupos: os ácidos hidroxibenóicos (Figura 1) e os ácidos hidroxicinâmicos (Figura 2). Os ácidos hidroxibenóicos comuns em cereais e leguminosas incluem ácidos gálicos, p-hidroxibenóicos, 2,4-dihidroxibenóicos, protocatecáricos, vanlícías e seringéricos, enquanto os ácidos hidroxicinnômicos comuns incluem ácidos caficos, p-coumaric, ferulicos e sinapicácidos 3. Os ácidos fenólicos também possuem propriedades antioxidantes, pois são capazes de ressarcimento de radicais livres, que causam ranço oxidativo nas gorduras, e iniciam e propagam estresse oxidativo induzido por radicais nos sistemas fisiológicos 4,5. Devido a esse papel fisiológico vital como antioxidantes, eles são objeto de pesquisas recentes. Isso porque quando consumidos como componentes de alimentos vegetais, eles podem exercer proteção antioxidante.
Cereais e produtos cereais são as principais fontes de alimentos carboidratos para humanos e animais em todo o mundo6. Os cereais incluem trigo, arroz, milho (milho), cevada, triticale, milhetas e sorgo. Entre eles, o milho é o mais utilizado, com uma utilização global estimada de 1.135,7 milhões de toneladas em 2019/2020, seguido pelo trigo com uma utilização global estimada de 757,5 milhões de toneladas no mesmo período7. Os alimentos cereais são ótimas fontes de energia para os consumidores, uma vez que são fontes ricas de carboidratos. Eles também fornecem algumas proteínas, gorduras, fibras, vitaminas e minerais6. Além de seu valor nutricional, os cereais são boas fontes de antioxidantes fitoquímicos, particularmente ácidos fenólicos, que têm o potencial de proteger o sistema fisiológico de danos oxidativos induzidos por radicais3. As leguminosas também são boas fontes de nutrientes e geralmente são mais altas em proteínas do que os cereais. Eles também contêm vitaminas e minerais e são usados na preparação de vários alimentos8. Além disso, as leguminosas são boas fontes de uma variedade de antioxidantes fitoquímicos, incluindo ácidos fenólicos, flavonoides, antocianinas e proanthocyanidins 9,10. Diferentes variedades de cereais e leguminosas podem ter uma composição diferente de ácido fenólico. Há, portanto, a necessidade de estudar a composição do ácido fenólico de cereais e leguminosas e suas variedades, a fim de conhecer seus potenciais benefícios para a saúde em relação aos antioxidantes fenólicos.
Uma série de ensaios foram relatados para medir a quantidade de ácidos fenólicos em grãos de cereais e leguminosas, e determinar suas atividades antioxidantes. Os métodos de análise mais comuns para ácidos fenólicos de grãos integrais são espectrofotometria e cromatografia líquida11. O objetivo deste trabalho foi demonstrar um método cromatógrafo líquido de alta pressão generalizado para determinar a composição livre de ácido fenólico solúvel e métodos espectrofotométricos para determinar o teor fenólico total e a capacidade antioxidante de alguns cereais e leguminosas de grãos integrais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber glass ID Surestop vial</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C5000-2W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440914-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#39;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) &#8805;98%,</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1888-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D913-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), &#8805;98%</td>
			<td>Fluka Chemika</td>
			<td>56510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>60180-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioTek ELx800 microplate reader</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BT-ELX800NB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance SI-114</td>
			<td>Denver Instrument</td>
			<td>SI-114.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler, Waters 717 Plus</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT078900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z245143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Filter (0.45 &#181;m PVDF Membrane)</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>HVLP04700&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Membrane Filters (0.45 &#181;m HV)</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>HVHP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 0.5-5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#160;plus, 10-100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E195-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferulic acid standard</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>128708-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC119245000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin &#38; Ciocalteu phenol reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 99%</td>
			<td>Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a</td>
			<td>27048-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic acid standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695</td>
			<td>Waters</td>
			<td>960402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipet tips, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>21-197-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 &#181;L</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode array detector, Waters 2996</td>
			<td>Waters</td>
			<td>720000350EN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 1-5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82018-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium persulfate (K2S2O8), &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216224-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4321-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17326-103030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roto evaporator, IKA RV 10</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0010005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S263-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Mallinckrodt AR&#174;</td>
			<td>7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4)</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardization pipet tips 0-200&#181;L</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Driven Filter unit (0.22 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Millex&#174;-GV</td>
			<td>SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target micro-serts vial insert (400 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZRQSVP030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a generalized method for determining free soluble phenolic acid composition and antioxidant capacity of cereals and legumes

Ácidos fenólicos são uma classe de compostos orgânicos que carregam tanto um grupo fenólico, quanto um grupo carboxílico. Eles são encontrados em grãos e se concentram no farelo de cereais ou sementes de leguminosas. Possuem propriedades antioxidantes que geraram muito interesse de pesquisa nos últimos anos, sobre suas potenciais funções de proteção antioxidante. Este trabalho apresenta um método generalizado para a extração de ácidos fenólicos solúveis livres de grãos integrais e análise de sua capacidade antioxidante. Foram utilizadas cinco amostras integrais de grãos compostos por dois cereais (trigo e milho amarelo) e três leguminosas (feijão-de-vaca, feijão-rim e soja). Os grãos foram moídos em farinha e seus ácidos fenólicos solúveis livres extraídos usando metanol aquoso. Os compostos foram então identificados por meio de um cromatógrafo líquido de alta pressão (HPLC). O método Folin-Ciocalteu foi usado para determinar seu teor fenólico total, enquanto suas capacidades antioxidantes foram determinadas usando a capacidade radical de limpeza do DPPH, capacidade antioxidante equivalente trolox (TEAC) e ensaios de capacidade de absorção radical de oxigênio (ORAC). Os ácidos fenólicos identificados incluíam ácidos vanlícíacos, cafeíacos, p-coumaricos e ferúlicos. O ácido vanlícía foi identificado apenas em cowpea, enquanto o ácido cafeico foi identificado apenas no feijão renal. p-coumíaco ácido foi identificado em milho amarelo, vaquinha e soja, enquanto o ácido ferúlico foi identificado em todas as amostras. O ácido ferúlico foi o ácido fenólico predominante identificado. A concentração total de ácidos fenólicos nas amostras diminuiu na seguinte ordem: soja > feijão-de-couro > milho amarelo = feijão-rim > trigo. A capacidade antioxidante total (soma dos valores dos ensaios DPPH, TEAC e ORAC) diminuiu da seguinte forma: soja > feijão-rim > milho amarelo = feijão de ervilha > trigo. Este estudo concluiu que a análise do HPLC, bem como os ensaios DPPH, TEAC e ORAC fornecem informações úteis sobre a composição do ácido fenólico e propriedades antioxidantes de grãos integrais.

A Tabela 2 mostra os ácidos fenólicos identificados nos grãos de cereais e leguminosas. Com base nos padrões autênticos disponíveis, foram identificados quatro ácidos fenólicos nas amostras e são eles: ácidos vanlícíacos, cafeíacos, p-coumaricos e ferúlicos. O ácido vanlícía é um ácido hidroxibenómico, enquanto os outros três são ácidos hidroxicinnâmicos. O ácido vanlícía foi identificado apenas no feijão cowpea blackeye, enquanto o ácido cafeína foi identificado a...

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A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes

Ácidos fenólicos são fitoquímicos importantes que estão presentes em grãos integrais. Possuem propriedades bioativas, como funções protetoras antioxidantes. Este trabalho teve como objetivo relatar um método generalizado para a identificação do HPLC, estimativa total de teor fenólico e determinação da capacidade antioxidante de ácidos fenólicos em cereais e leguminosas.

Um método generalizado para determinar a composição livre de ácido fenólico solúvel e capacidade antioxidante de cereais e leguminosas

Phenolic acids are a class of organic compounds that bear both a phenolic group, and a carboxylic group. They are found in grains and concentrate in the ...

Método generalizado para determinar a composição livre de ácido fenólico solúvel e capacidade antioxidante de cereais e leguminosas. Grãos integrais, incluindo cereais e leguminosas, formam uma parte substancial das dietas humanas. Sua relevância nutricional para os seres humanos tem sido reconhecida há muito tempo.No entanto, mais recentemente, seus benefícios antioxidantes para a saúde protetora foram relatados. Os ácidos fenólicos encontrados nas camadas externas de grãos de cereais e a camada de sementes de leguminosas contribuem para as propriedades antioxidantes dos grãos integrais. Eles escolúngem radicais livres que causam danos oxidativos às biomoléculas.As duas classes de ácidos fenólicos encontrados em grãos integrais são ácidos hidroxibenómicos e ácidos hidroxicinâmicos. Este estudo fornece um método simples para extrair ácidos fenólicos de grãos integrais e determinar sua capacidade antioxidante in vitro. Use cinco amostras de grãos integrais para este estudo, trigo durum, milho amarelo, feijão-de-olho-preto, soja e feijão-rim vermelho.Pesar com precisão 100 miligramas de farinha de grão inteira diretamente em um tubo de micro centrífuga de capacidade mililiter, de cor âmbar. A cor escura do tubo ajuda a evitar a exposição da mistura à luz. Adicione um mililitro de metanol aquoso de 80% aquoso a cada um dos tubos que contenham exemplos.Vórtice brevemente para misturar a solução de metanol e a amostra. Sonicar as amostras por 60 minutos para extrair os compostos fenólicos solúveis livres. Coloque uma tampa sobre as amostras durante a sônica para obter proteção adicional contra a luz.Após a sônicação, centrifufique as misturas a 20.000 vezes G durante cinco minutos para sedimentar os resíduos sólidos, deixando o sobrenatante em cima. Compostos fenólicos gratuitos estarão presentes no supernasce após centrifugação. O supernatante precisa ser filtrado antes de injetar no instrumento HPLC.Para filtrar o supernaspe, remova o êmbolo de uma seringa de 3 mL e conecte um filtro de seringa. O filtro deve ter um tamanho de poros não maior que 0,22 micrômetros. Pipeta aproximadamente 0,4 mililitros do supernatante no topo da seringa.Reinserir o êmbolo e empurrar o líquido através do filtro em um frasco HPLC contendo uma pastilha de frasco. Uma vez que o instrumento tenha sido configurado para executar o método descrito no manuscrito para análise hplc, carregue os frascos no carrossel para corresponder à lista de amostras. Obtenha cromatógramas HPLC a 320 nanômetros e 280 nanômetros, mostrando picos distintos representando diferentes compostos fenólicos.Usando curvas padrão apropriadas, quantifique ácidos hidroxicinnômicos a 320 nanômetros, uma vez que eles têm uma absorvância máxima neste comprimento de onda. Pelo mesmo princípio, quantifique ácidos hidroxibenóicos a 280 nanômetros. Use Trolox, um análogo solúvel em água de vitamina E, como padrão para estimar a capacidade antioxidante in vitro de extratos inteiros de grãos.Pesar com precisão um miligrama de Trolox em um tubo Falcon. Dissolva com quatro mililitros de metanol aquoso de 50% para preparar uma solução de estoque de um milimole por litro, que é o mesmo que 1000 micromole por litro. Prepare seis concentrações de Trolox que é de 50, 100, 200, 400, 600 e 800 micromole por litro para traçar curvas padrão para a estimativa da capacidade radical de limpeza do DPPH e da capacidade antioxidante equivalente ao Trolox, TEAC.Da mesma forma, prepare 6,25, 12,5, 25 e 50 micromole por litro concentrações trolox para estimar a capacidade de absorção radical de oxigênio, ORAC. Compõem o volume total de cada concentração para 500 microliters, como mostrado na tabela um. Diluir os extratos amostrais com metanol antes da análise.Aqui, os extratos de milho amarelo e ervilha foram diluídos duas vezes. Os extratos de trigo e feijão foram diluídos cinco vezes, enquanto o extrato de soja foi diluído 10 vezes com metanol. Pesar 8,23 miligramas de ABTS em uma capacidade limpa, dois mililitros, tubo de micro centrífuga âmbar.Em seguida, pese 1,62 miligramas de persulfato de potássio em uma capacidade limpa de dois mililitros, tubo de micro centrífuga âmbar. Dissolva cada um dos produtos químicos pesados em um mililitro destilado água por vórtice. Isso resulta em uma solução ABTS milimililar e uma solução de persulfeto de potássio de seis milimólares.Prepare a solução de estoque ABTS misturando as soluções de persulfeto de ABTS e potássio em volumes iguais. A solução mudará imediatamente para uma cor escura. Deixe essa mistura incubar na escuridão por 12 a 16 horas.Diluir a solução de estoque ABTS 30 vezes com salina tamponada com fosfato de 200 milimilas para formar a solução de trabalho ABTS. Para isso, adicione 58 mililitros de 200 mililitros PBS a dois mililitros da solução de trabalho ABTS. A solução de trabalho conterá ABTS de 0,27 milimão e persulfeto de potássio milimão.Para a análise, coloque 10 microlitadores de cada extrato diluído em uma microplacão de 96 poços. Adicione 190 microliters de solução de trabalho ABTS a cada poço e incubar por 60 minutos. Meça a absorvência das misturas de reação em 750 nanômetros em um leitor de microplaca.Use os padrões Trolox em concentrações que variam de 100 a 800 micromole por litro para traçar uma curva de calibração. O ensaio antioxidante DPPH requer um composto gerador radical, DPPH. Pesar 1,2 miligramas de DPPH em um tubo vazio de centrífuga de capacidade de 15 mililitros.Dissolva o DPPH em metanol para preparar uma solução de 60 micromolares. O ensaio DPPH testa a capacidade dos extratos amostrais de coletar radicais livres produzidos pela DPPH. Adicione cinco microliters de extrato de amostra nos poços de microplacão.Em seguida, adicione 195 microliters de 60 micromolar solução methanolic DPPH e incubar por 60 minutos. Meça a absorvância em 515 nanômetros. Use os padrões Trolox para traçar uma curva de calibração.A figura um mostra a estrutura dos ácidos hidroxibenóicos encontrados em grãos inteiros. Neste estudo atual, o ácido vanlícía foi o único ácido hidroxibenómico identificado. A figura dois mostra a estrutura dos ácidos hidroxicinamâmicos encontrados em grãos integrais.No presente estudo, foram identificados ácidos p-coumarico, cafeic e ferúlico nas amostras. A tabela dois mostra os ácidos fenólicos identificados nas amostras. Como mencionado anteriormente, o ácido vanillico foi o único ácido hidroxibenómico identificado nas amostras.Foi identificado apenas no extrato de ervilha. O ácido hidroxcinnâmico ácido cafeína foi identificado apenas em feijão renal, enquanto o ácido p-coumérico foi identificado em milho amarelo, vaquinha e soja. O ácido ferúlico foi identificado em todas as amostras e foi o ácido fenólico predominante nas amostras.A concentração total dos ácidos fenólicos em ordem de maior para o mínimo foi na ordem soja, vaqueiro, milho amarelo e feijão-rim ou equivalente, seguido pelo trigo. A tabela três mostrou o teor fenólico total e a capacidade antioxidante das amostras. A capacidade antioxidante compreendeu a capacidade radical de limpeza do DPPH, TEAC, ORAC e capacidade antioxidante total das amostras.A capacidade antioxidante total é a soma dos valores DPPH, TEAC e ORAC. Semelhante à tabela dois, a soja apresentou a maior capacidade antioxidante total. No entanto, em vez de ervilha, foi sim feijão-rim que tinha a segunda maior capacidade antioxidante total, embora a ervilha tivesse o segundo maior teor total de ácido fenólico.Esta anomalia está relacionada com as estruturas dos ácidos fenólicos individuais e o possível efeito antagônico do ácido vanlícíaco ácido hidroxibenómico sobre os efeitos antioxidantes dos ácidos hidroxicinnômicos em cowpea. Este estudo concluiu que os grãos integrais diferem em suas composições de ácido fenólico. Entre os grãos integrais estudados, a soja possui a maior quantidade total de ácidos fenólicos e, correspondentemente, a maior capacidade antioxidante.

Research

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