Name: functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by ussing chamber technique
Uploaded: 2021-05-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique at JoVE.com

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Todos os animais utilizados nesses experimentos foram mantidos na unidade de cuidados com animais da Universidade de Shizuoka e os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para pesquisas em animais estabelecidas pela Universidade de Shizuoka. Todos os experimentos foram realizados com aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Shizuoka (Licenças #205272 e #656-2303).
1. Preparação de eletrodos NaCl
NOTA: Os eletrodos uti...

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+conductances+of+extracellular+shunt+pathway+in+rabbit+ileum.">Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum.</a> Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).</li><li>Otani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+and+JAM-A+coordinately+regulate+tight+junction+formation+and+epithelial+polarity.">Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity.</a> Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).</li></ol>

Neste experimento, as câmaras de Ussing foram usadas para medir os parâmetros elétricos da linha de base e o potencial de diluição de NaCl no intestino delgado de camundongos Cldn15-/- e WT. É muito importante ao fazer experimentos de câmara de Ussing para verificar se a preparação da membrana usada nos experimentos é viável. Isso geralmente é feito adicionando glicose ou o ativador de cíclase adenílato forskolin e vendo se há um aumento apropriado no Isc (100-300 μ...

O método da câmara de Ussing foi desenvolvido pela primeira vez pelo cientista dinamarquês Hans Ussing. Ussing primeiro o usou para medir a corrente de curto-circuito do transporte de sódio através da pele de sapo depois que foi observado que NaCl poderia ser transportado através da pele contra um gradiente de concentração íngreme1. Seu sistema consistia na pele do sapo montada entre duas câmaras com acesso a ambos os lados da pele. Cada câmara continha a solução de Ringer que foi circulada e arejada. Duas pontes estreitas de ágar anéis situadas perto da pele e conectadas a eletrodos Saturados KCl-calomel mediram a diferença potencial como lido por um potencializador. Um segundo par de pontes de ágar ringer estavam situadas na extremidade oposta de cada câmara conectada a béquers com KCl saturado com AgCl para aplicar uma força eletromotiva fornecida por uma bateria. Um divisor potencial foi usado para ajustar a tensão de modo que a diferença potencial entre a pele permaneceu zero, criando assim condições de curto-circuito. Um medidor de microampere também foi conectado para ler a corrente que passa pela pele (ver a figura no ref.1 para o desenho original da câmara).
Ao longo dos últimos 70 anos, essa técnica tem sido aplicada a muitos tecidos diferentes, particularmente o tecido intestinal, para estudar o transporte de nutrientes e íons. Por exemplo, o mecanismo de diarreia induzida pela cólera foi estudado pela montagem de íleo de coelho nessas câmaras, e descobriu-se que a diarreia induzida por toxina de cólera é mediada por cAMP2. Além disso, essas câmaras também foram utilizadas para estudar o mecanismo subjacente ao transporte de glicose via cotransportador Na+-Glicose 1 (SGLT1)3. Nosso laboratório se concentra no transporte transcelular e paracelular em células epiteliais intestinais. Utilizando o método da câmara de Ussing, o transporte de peptídeos foi avaliado em Claudin 15 camundongos nocauteados, que têm prejudicado o transporte paracelular de sódio, usando câmaras de Ussing para medir a absorção da glicitsarcosina de dipeptídeo não-higidivelmente. Descobriu-se que a homeostase Luminal Na+ é importante para o transporte de peptídeos acoplado a prótons4. Além disso, essas câmaras também foram usadas para investigar a secreção de ânion no ceco murino em resposta à ativação submucosal do receptor ativado proteinase 1 pelo serino protease trypsin5.
Câmaras de ussing também foram usadas recentemente para avaliar as vias paracelulares no tecido epitelial. As vias paracelulares são reguladas por junções apertadas, que são complexos de proteínas que se formam no ponto onde duas ou mais células se encontram6. A função de barreira e seletividade de íons (se os ânions ou cáations são seletivamente capazes de passar pela junção apertada) é determinada pela presença de proteínas da família Claudin; alguns dos quais atuam como barreiras (claudin 3 e 7), poros de anion (claudin 10a), ou poros de cáção (claudin 2, 10b e 15)7. Outros métodos têm sido utilizados para avaliar a via paracelular, como gavage oral do FITC acompanhado de concentração FITC de plasma de sangue8, ou EDTA-Cr9; no entanto, essas técnicas são de menor resolução e não podem avaliar a seletividade de íons ou uma seção específica das seções do trato intestinal. As câmaras de ussing, no entanto, podem ser usadas para avaliar o potencial de diluição dos íons-alvo e, portanto, determinar a seletividade de íons das junções apertadas. Por exemplo, com NaCl, a seletividade das junções apertadas para Na+ e Cl- pode ser calculada diluindo um lado da membrana (geralmente o lado mucosal) e medindo a mudança na diferença potencial transepitetelial. As permeabilidades relativas de Na+ e Cl- podem ser estimadas pela equação Goldman-Hodgkin-Katz10 e a seletividade da junção apertada pode ser estimada usando a equação Kimizuka-Koketsu11. Essas câmaras, portanto, têm a vantagem de medir os parâmetros eletrofisiológicos do tecido e, como resultado, fornecem mais informações sobre a passagem de íons através das junções apertadas do que outros métodos de resolução mais baixa.
O método da câmara de Ussing não se limita apenas ao trato intestinal, embora seja amplamente utilizado em estudos relativos ao intestino, ele tem muitas outras aplicações também. Por exemplo, essas câmaras têm sido usadas para estudar fibrose cística, e especificamente o regulador de condutância de fibrose transmembrana de fibrose cisticida do canal cloreto (CFTR)12. A Fibrose Cística é causada por uma mutação no CFTR13, que resulta em secreção de cloreto prejudicada e transporte de fluidos por células epiteliais respiratórias, e uma camada mucosa mais espessa e seca14. Estudo da CFTR epitelial das vias aéreas tem sido realizado com essas câmaras para não só entender a doença, mas para descobrir formas de tratar a doença. Por exemplo, em pacientes com mutações raras que causam fibrose cística, a análise de células epiteliais respiratórias do paciente tem sido usada para testar terapias como Orkambi e uma coterapia amplificadora15.
Câmaras ussing também têm sido usadas para estudar rotas de entrega de medicamentos, como com tecido de biópsia humana para estudar a absorção de drogas e farmacocinética16. A absorção intestinal não é a única rota de entrega de drogas. Essas câmaras também têm sido usadas para estudar sistemas de entrega de drogas nasais17. Estudos de entrega de drogas com câmaras de Ussing também foram realizados para o olho. Na córnea do coelho, foram realizados estudos de permeabilidade e absorção com Labrasol, uma droga projetada para aumentar a absorção de drogas entre tecidos18. Outro estudo analisou o efeito do cloreto de benzilaalkonium na entrega de drogas transesclerais na esclera do coelho19.
O método de câmara de Ussing é útil porque o tecido nativo pode ser usado. Como tal, é preferível sobre modelos in vitro, como linhas celulares Caco-2. No entanto, a técnica requer habilidade e tempo para preparar espécimes, por isso não é adequada para aplicações de alto rendimento. As propriedades eletrofisiológicas das monocamadas celulares podem ser estudadas usando pastilhas de cultura celular nessas câmaras. Descobertas recentes permitiram a cultura de organoides que são mini-órgãos cultivados na cultura a partir da colheita de células-tronco epiteliais ou endoteliais20. A cultura organoide pode ser manipulada para ser cultivada em uma monocamadas, tornando possível montar organoides em uma câmara de Ussing21. Organoides de vários tecidos epiteliais e endoteliais podem ser estudados, diminuindo o número de animais necessários, pois a cultura organoide pode ser mantida a longo prazo. Isso também aumentará o rendimento, uma vez que não serão necessárias etapas de dissecção e preparação de tecidos demorados e trabalhosos. No futuro, os estudos de câmara de Ussing continuarão a ser muito úteis para estudar o transporte de tecidos e serão especialmente importantes no campo da medicina personalizada.
O protocolo a seguir demonstra a aplicação do método de câmara de Ussing para avaliar a permseletividade e a função de barreira das junções apertadas no intestino delgado de Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) ratos e controles do tipo selvagem (WT) medindo o potencial de diluição de NaCl. Junções apertadas (TJ) são formadas no ponto onde duas ou mais células se encontram em tecido epitelial e endotelial. Acredita-se que as junções apertadas bicelulares (bTJ), particularmente as proteínas da família Claudin encontradas dentro do bTJ, determinem a função da barreira e a permseletividade do TJ7. Os camundongos têm um mega intestino delgado22 e capacidade reduzida de absorção de nutrientes devido à perda da reciclagem intestinal na+ que ocorre através de claudin 154,23,24. Cldn15-/- camundongos têm prejudicado a homeostase Na+, o que os torna um modelo interessante para estudar a permeseletividade do TJ. O protocolo a seguir avalia a permeabilidade do TJ para a LCA medindo o potencial de diluição de NaCl (PNa/PCl) no intestino delgado médio. Resumidamente, a mudança na diferença potencial da membrana que ocorre diluindo um lado da membrana (lado M ou lado S, ambos são medidos no protocolo abaixo) pode ser usada para calcular a permeabilidade de Na+ (PNa) e Cl- (PCl), e o potencial de diluição (PNa/PCl) mostrará se a junção apertada tem uma seletividade cônica ou aniônica.
Os experimentos neste protocolo foram realizados utilizando uma câmara ussing personalizada (Figura 1A), que consiste em duas metades, entre as quais a preparação intestinal é montada verticalmente, amplificador de grampo de tensão, gravador elétrico, eletrodos, pontes de sal, solução de Ringer, tampão HEPES (150 mM NaCl), tampão HEPES diluído (75 mM NaCl), preparação intestinal (para detalhes sobre o equipamento ver a Tabela de Materiais).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#3 polyethyl tubing</td>
			<td>Hibiki</td>
			<td></td>
			<td>outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#7 polyethyl tubing</td>
			<td>Hibiki</td>
			<td></td>
			<td>outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL locking syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10LZ</td>
			<td>Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 g needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-1938R</td>
			<td>Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 g needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2332R</td>
			<td>Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm punch</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use to punch holes in filter paper and parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acupuncture needles</td>
			<td>Seirin</td>
			<td>NS</td>
			<td>Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>010-15815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alligator clips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Connects the electrode to the amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>038-00445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-)-Mannitol</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>133-00845</td>
			<td>This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>You will need, scissors and curved forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301-500ML</td>
			<td>For making forskolin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical recorder</td>
			<td>TOA Electronics</td>
			<td>PRR-5041</td>
			<td>Other equivalent electrical recorders are available commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial voltage clamp amplifier</td>
			<td>Nihon Kohden</td>
			<td>CEZ9100</td>
			<td>Other equivalent amplifiers are available commerically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper, cut into squares</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fast Gene</td>
			<td>FG-B50476</td>
			<td>For blunt dissection of the muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>F-500</td>
			<td>Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7338-5G</td>
			<td>Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl/calomel electrode</td>
			<td>Asch Japan Co.</td>
			<td>SCE-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Kanto chemical</td>
			<td>32379-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Glutamine</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>074-00522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed Gas (95% O2/5% CO2)</td>
			<td>Shizuoka Oxygen Company</td>
			<td></td>
			<td>Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fujifilm Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Gas</td>
			<td>Shizuoka Oxygen Company</td>
			<td></td>
			<td>Used for bubbling chambers when using HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Used to help seal Ussing chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>DKK-TOA Corp</td>
			<td>HM-305</td>
			<td>HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter electrode</td>
			<td>DKK-TOA Corp</td>
			<td>GST-5311C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone rubber</td>
			<td>Shinetsu Chemical</td>
			<td>KE-12</td>
			<td>Used to fill dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for making NaCl electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small jars w/ plastic lids</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use for NaCl electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td>A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing chambers</td>
			<td>Sanki Kagaku Kougei</td>
			<td></td>
			<td>These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump and heating system</td>
			<td>Tokyo Rikakikai Co. Ltd.</td>
			<td>NTT-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by ussing chamber technique

A técnica da câmara de Ussing foi inventada pela primeira vez pelo cientista dinamarquês Hans Ussing em 1951 para estudar o transporte transcelular de sódio através da pele de sapo. Desde então, essa técnica tem sido aplicada a muitos tecidos diferentes para estudar os parâmetros fisiológicos do transporte através de membranas. O método de câmara de Ussing é preferível a outros métodos porque o tecido nativo pode ser usado, tornando-o mais aplicável ao que está acontecendo in vivo. No entanto, como o tecido nativo é usado, o rendimento é baixo, o tempo é limitado, e a preparação do tecido requer habilidade e treinamento. Essas câmaras têm sido utilizadas para estudar proteínas específicas de transporte em diversos tecidos, entender a fisiopatologia da doença, como na Fibrose Cística, estudar o transporte e a absorção de medicamentos, e especialmente contribuír para a compreensão do transporte de nutrientes no intestino. Dado todo o processo de transporte epitelial de um tecido, não apenas vias transepiteliais, mas também caminhos paracelulares são importantes. Junções apertadas são um determinante chave da permeabilidade paracelular específica do tecido em todo o intestino. Neste artigo, a técnica da câmara de Ussing será usada para avaliar a permseletividade paracelular dos íons, medindo os potenciais de condução transeptelial e diluição.

Os resultados apresentados neste artigo são resultados que fizeram parte de um projeto maior que foi concluído (ver ref.4,23,24).
A condutância elétrica transeptelial do intestino delgado é diminuída em cldn15-/- camundongos. A condutância transmucosal da linha de base (sob condições de curto-circuito) ...

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Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

O epitélio intestinal confere não apenas absorção de nutrientes, mas proteção contra substâncias nocivas. A junção intercelular mais epitelial apical, ou seja, a junção apertada, regula soluto paracelular e permeabilidade de íons. Aqui, é descrito um protocolo para a preparação de folhas mucosas e avaliação da seletividade de íons de junções apertadas usando a técnica da câmara de Ussing.

Avaliação funcional da barreira de junção apertada intestinal e permeabilidade de íons em tecido nativo pela técnica da câmara de ussing

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

Este protocolo é usado para estudar as qualidades de transporte de junções apertadas. Usando potenciais de diluição, você pode medir a permeseletividade e obter uma compreensão de junções apertadas em um tecido. Esta técnica é específica e utiliza tecidos nativos para estudos funcionais de epithelia.Além disso, essa técnica mede as propriedades fisiológicas em tempo real de um tecido, o que é muito útil. O maior desafio é a preparação de tecidos. Praticar a técnica, além de assistir a este vídeo vai ajudar.para confirmar a viabilidade tecidual também é um passo importante. Para começar, coloque os segmentos desejados de tecido intestinal coletados de camundongos claudin-15 em bolhas geladas da solução de Ringer e corte a gordura e tecido conjuntivo. Depois de cortar a gordura e o tecido conjuntivo, corte ao longo dos acessórios mesentéricos para abrir cada segmento longitudinalmente, em seguida, devolva os segmentos para a solução de Ringer frio de gelo e lave as peças completamente.Para retirar a camada muscular, despeje de dois a três mililitros de gelo fresco e borbulhando a solução de Ringer em uma placa de dissecção coberta de borracha de silicone sob um microscópio de dissecção e use os pinos para fixar as extremidades de um segmento de tecido intestinal no prato com o lado mucosal voltado para baixo. Usando fórceps finos, disseca sem rodeios a camada muscular da mucosa subjacente, tomando cuidado para não rasgar ou introduzir quaisquer orifícios no tecido. Uma vez que a camada muscular tenha sido removida, corte um pedaço grande o suficiente para uma abertura de cinco milímetros de diâmetro e coloque o tecido em um pedaço de papel filtro perfurado de cinco milímetros molhado com o lado mucosal solução ringer para baixo usando um fundo preto para garantir que a abertura no papel filtro esteja completamente coberta pelo tecido sem rugas.Para montar as preparações intestinais em uma câmara de Ussing, primeiro remova qualquer solução da câmara antes de dissimá-la. Coloque o papel filtro com o lado mucosal de preparação intestinal para baixo na câmara lateral mucosa usando as marcas pretas para alinhar a janela da câmara com o orifício no papel do filtro. Conecte cuidadosamente a câmara lateral serosal à câmara lateral mucosa sem mover a folha intestinal.Reabastecer rapidamente ambas as câmaras com o tampão HEPES e coloque as borbulhantes na extremidade oposta de cada câmara longe da membrana. Reconecte as pontes de sal e verifique se a tensão está estável e, em seguida, pulso a corrente para garantir que as conexões estejam bem antes de permitir que o sistema se equilibre por cerca de 15 minutos. Para realizar um experimento potencial de diluição, primeiro lave ambos os lados da câmara com cinco mililitros de tampão HEPES pré-aquecido fresco por lado.Ligue o sistema de gravação e defina o alcance para 250 milvolts. Defina as posições do marcador, defina o sistema de gravação para medir e ajuste os sistemas de câmara de Ussing para o modo de fixação. Uma vez estabilizado o potencial de medição, use os dados para medições.Substitua rapidamente o tampão HEPES do lado mucosal da câmara por cinco mililitros de tampão HEPES de diluição aquecida complementado com cloreto de sódio de 75 milimilas. Uma vez que o potencial da membrana tenha atingido o pico, substitua o tampão de diluição do lado mucosal por um novo buffer HEPES. Para garantir que o tecido seja viável, adicione 10 micromolar Forskolin ao lado seroso.Uma vez que a diferença potencial da membrana atingiu um pico e está começando a diminuir, o experimento acabou. Para medir a condutância elétrica transepitelial e a corrente de curto-circuito da linha de base, depois de lavar ambos os lados da câmara como demonstrado, adicione cinco mililitros de solução de Ringer bolha fresca para cada lado e defina o alcance do sistema de gravação para 2,5 volts. Defina as posições do marcador, defina o sistema de gravação para medir e ajuste o sistema de câmara de Ussing para o modo de fixação.Uma vez estabilizada a corrente de curto circuito e a condutura, use os dados para medições de linha de base. Para garantir que o tecido seja viável, adicione Forskolin ao lado serosal como demonstrado. Uma vez que a diferença potencial da membrana atingiu um pico e começou a diminuir, o experimento acabou.Nesta análise representativa, a condutância transmucosal de base do segmento intestinal médio pequeno foi menor nos camundongos claudin-15 em condições de curto-circuito em comparação com a observada em camundongos do tipo selvagem, enquanto a corrente de curto-circuito da linha de base foi maior. Após a diluição do cloreto de sódio luminal, observou-se uma diferença potencial positiva em relação ao lado sorosal em camundongos do tipo selvagem, mas a diferença foi diminuída nos camundongos eliminados claudin-15. Da mesma forma, a permeabilidade relativa do cloreto de sódio também foi diminuída nos animais de nocaute.O cálculo das permeabilidades absolutas revelou que a permeabilidade absoluta do sódio diminuiu nos camundongos claudin-15, enquanto a permeabilidade absoluta do cloreto não, sugerindo que a diminuição da permeabilidade relativa deve-se à diminuição da permeabilidade do sódio. Como esperado, a adição de Forskolin ao lado serosal da câmara não causou uma diferença significativa na mudança da corrente de curto-circuito entre o nocaute e ratos do tipo selvagem. Uma vez que os segmentos intestinais demonstraram uma resposta grande o suficiente à Forskolin, as preparações da membrana foram consideradas viáveis.É importante realizar a remoção adequada da camada muscular e garantir que o tecido seja viável. Por favor, enxágue a seção de dissecção dos camundongos se a preparação é viável.

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologia

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Extracção do Tissue Antigens para Ensaios Funcionais

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Avaliar defeitos de obstrução do trato urinário junção por injeção de corante azul de metileno

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Avaliação do esperma de peixe utilizando Software e dispositivos de refrigeração

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...