Name: nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery
Uploaded: 2021-05-16T15:00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery at JoVE.com

"Dette arbejde nød godt af adgang til NKI Protein Facility, et Instruct-ERIC center. Der er ydet finansiel støtte fra iNEXT, projektnummer 653706 og iNEXT-Discovery, projektnummer 871037, finansieret af Europa-Kommissionens Horizon 2020-program".

BEMÆRK: De proteiner, der anvendes i nano-DSF-eksperimenter, skal være rene (>95 %) og homogene som bedømt af natrium dodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese. Før fragmentskærmen udføres, skal proteinernes stabilitet bestemmes under forskellige bufferforhold. En lav ionisk styrke, lav salt buffer, der forstyrrer minimalt med proteinet bør anvendes for ikke at påvirke sin direkte interaktion med fragmenter. De buffere, der typisk bruges i denne protokol til kontrol af stabilitet, vises i supplerende tabel S1. Koncentrationen af det protein , der skal anvendes til dette eksperiment som lageropløsning, er typisk 0,2 mg mL-1. Til screening af hele DSi-Klar bibliotek (768 forbindelser), i alt ~ 12 mL protein i denne koncentration, i alt ~ 2,5 mg, er nødvendig. Det DSi-Poised-bibliotek, der blev anvendt i disse eksperimenter, blev leveret i 96-brøndsformat (figur 1). Koncentrationen af fragmenterne blev justeret til 100 mM i 20% v/v dimethylsulfoxid (DMSO). Det skal bemærkes, at den blandingsprotokol, der er beskrevet her, resulterer i lave endelige DMSO-koncentrationer på 0,4% v/v; Selv om dette højst sandsynligt vil påvirke proteinets stabilitet, bør virkningen af DMSO kontrolleres for hvert nyt protein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig1v11.jpg"> Figur 1: De plader, der anvendes til disse forsøg. (B) 96-brønd plade. (C) Et nærbillede af 96-brøndspladen, der viser underhuset 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig1v11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
1. Pladeforberedelse
<ol><li>Tag en fragmentplade ud af fryseren -20 °C/-80 °C, og lad den tø op ved stuetemperatur med blid rysten på en ryster på en bænk. Centrifuge pladen ved 500 × g i 30 s for at samle eventuelle dråber, der klæber til siden af brøndene. BEMÆRK: Da fragmentbiblioteket er tilgængeligt opløst i DMSO-d6 (smeltepunkt 19 °C), er det vigtigt at sikre, at hver forbindelse er helt optøet og opløses.</li>
	<li>Tag en MRC 2-brønd krystalliseringsplade (Figur 1A) og pipette 14,7 μL af proteinlageropløsningen i hver del-brønd. For at gøre dette på en tidseffektiv måde skal proteinet opbevares i et reagenseservoir (Materialetabel) og bruge en multikanalpipette til dispensering (Figur 2A, B). BEMÆRK: For DSi-Klar bibliotek, afhængigt af formatet, ikke alle brønde af 96-brønd plade indeholder forbindelser. Række A, H og kolonne 1, 12 udfyldes typisk med DMSO. Således må række A, H og kolonne 1, 12 ikke fyldes med protein, da disse brønde ikke vil indeholde fragmenter i slutningen af næste trin; kun DMSO vil blive overført dertil af robotten. Bemærk, at de tomme rækker og kolonner er forskellige i nogle plader.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig2v11.jpg"> Figur 2: Omrids af fragmentscreeningsproceduren. (A) Brug af en multikanalpipette og reagenseservoir til udlevering af proteinet. (B) Udlevering af proteinet i 96-brøndspladen. (C) Dispenserrobotpens fragmentudsentning. (D) Pålæsning af proteinet i kapillærerne. (E) Skuffe, der viser kapillærholderen. (F) Nærbillede af kapillærholderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig2v11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig3v11.jpg"> Figur 3: Oversigt over det udstyr, der anvendes i disse forsøg. Pladepositioner er angivet. (B) Programgrænseflade til definition af en ny plade. (C) Grænseflade af dispenseringsprogrammet. (D) Det dispenserprogram, der anvendes til at dispensere fragmenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig3v11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
2. Fragment nano-dispensering af Mosquito robot
<ol><li>Kontroller den type plade, hvor fragmenter leveres (Materialetabel).</li>
	<li>Tjek fragment og protein plade definitioner på Mosquito.<ol>
<li>Tænd for nanodispenseren (figur 3A). Sørg for, at der ikke er forhindringer omkring de bevægelige komponenter.</li>
		<li>Åbn den grafiske brugergrænseflade, klik på fanen Opsætning, og kontroller under Konfiguration af dæk, om den type plade, hvor forbindelserne leveres, og den, hvor proteinet er overført i afsnit 1, allerede findes på listen over tilgængelige plader. Hvis ikke, skal du klikke på Indstillinger| Plader og oprette en ny pladedefinition ved at udfylde de korrekte værdier for egenskabstypen (Figur 3B). BEMÆRK: Disse værdier for MRC 2-brøndspladen og den 96-brøndsplade, der anvendes i dette eksperiment, er vist i henholdsvis supplerende tabel S2 og supplerende tabel S3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispenserprogrammet<ol>
<li>Angiv pladepositionerne under Konfiguration af dækunder fanen Opsætning . BEMÆRK: Myggen, der bruges i dette eksperiment, har to pladepositioner på dækket. Position 1 defineres som kildepladen, og position 2 er destinationspladen.</li>
		<li>Brug rullemenuen til Greiner U bundpladen til position 1 og MRC 2-brøndplade til position 2 (Figur 2C). Gem protokollen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fragmentudstedning<ol>
<li>Anbring fragmentpladen på position 1 og proteinpladen på position 2 på dækket (figur 3A).</li>
		<li>Klik på Filer under fanen Protokol (Figur 3D), og vælg den protokol, der er gemt i afsnit 2.3 til udlevering af fragmenterne. Definer mængden af de fragmenter, der skal udleveres. bruge 0,3 μL. For en typisk plade, hvor kolonne 1 og 12 ikke indeholder fragmenter, skal du definere startplaceringen til kolonne 2 og slutplaceringen til kolonne 11. Hvis kolonne 2 eller 11 er tomme i nogle plader, skal du bruge kolonne 3 og 10 som henholdsvis start- og slutværdier. BEMÆRK: På grund af mygopsætningen kan kun kolonner springes over, ikke rækker; for rækkerne vil myggen pipette DMSO. Sørg for, at indstillingen Ændring af tip er valgt som Altidfor ikke at krydsforurene fragmentbiblioteket.</li>
		<li>Klik på Kør for at starte programmet. Efter dispensering, som tager ~ 2 min, er afsluttet, fjerne protein og fragment plader fra robotten, og forsegle dem tilbage med en klæbende forsegling film. Centrifug proteinpladen (500 × g, 30 s) for at samle dråber, der klæber til brøndenes sider, før du fortsætter til næste trin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Måling af nano-DSF
BEMÆRK: En detaljeret beskrivelse af at udføre TSA'er ved hjælp af Prometheus NT.48 er tidligere blevet offentliggjort20. Vigtige punkter i forbindelse med fragmentscreening nævnes her.
<ol><li>Pladeinspektion før målingen<ol>
<li>Undersøg visuelt proteinpladens brønde for nedbør, der kunne have fundet sted på grund af tilsætning af fragmenter. Hvis nedbør observeres i mange brønde, reducere koncentrationen af fragmenter, og gentag eksperimentet. BEMÆRK: Det anbefales at holde proteinpladen ved stuetemperatur; fragmenter tendens til at blive uopløselige ved lavere temperaturer.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse af Prometheus<ol>
<li>Tænd Prometheus-instrumentet. Tryk på Åbn skuffe på berøringsskærmen for at få adgang til instrumentets kapillærbelastningsmodul. Fjern magnetstriben fra lastemodulet, og rengør spejlet med ethanol for at fjerne støvpartikler.</li>
	</ol></li>
	<li>Overførsel fra proteinfragmenterne plade til kapillærer BEMÆRK: Dette trin indebærer overførsel af den blandede protein/fragmentprøve fra hver brønd i proteinpladen til kapillærerne til brug sammen med Prometheus. Til dette, selvom standard kapillærtypen typisk anvendes, er det muligt at bruge højfølsomhedskapillærerne til meget lave proteinkoncentrationer.<ol>
<li>Placer proteinpladen og kapillærerne ved siden af instrumentet for at få nem adgang til kapillærbelastningsmodulet.</li>
		<li>Tag en kapillær, hold den i den ene ende, og rør ved opløsningen i proteinpladen med den fjerneste ende af kapillæren for at overføre prøven ved kapillær handling. Brug altid handsker, og sørg for ikke at røre kapillæren i midten, da urenheder (f.eks.støvpartikler) fra handskerne ville påvirke målingen.</li>
		<li>Placer kapillæren i holderens udpegede position, og sørg for, at den er korrekt justeret og centreret.</li>
		<li>Gentag trin 3.3.2 og 3.3.3, hvorved alle positioner i lastemodulet fyldes op. Læg alle kapillærer, du skal bruge til måling. BEMÆRK: For et enkelt løb kan der maksimalt indlæses 48 kapillærer.</li>
		<li>I slutningen skal du placere magnetstriben oven på kapillærerne for at holde dem på plads og trykke på Luk skuffe for at starte eksperimentet.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør nano-DSF eksperimentet<ol>
<li>Fluorescensscanning<ol>
<li>Åbn Prometheus-program-PR. ThermControl, og opret et nyt projekt ved at klikke på Start ny session ved hjælp af navnet ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Først skal du lave en Discovery Scan for at opdage eksescensen af prøverne. BEMÆRK: Fluorescensniveauet skal ideelt set være over 3.000 tællinger for hver prøve. Prøver med fluorescens over instrumentets mætningsgrænse (20.000 tællinger) vil ikke blive målt.</li>
			<li>Ændre eksescenssignalet for prøverne ved at justere excitationseffekten af laseren (Figur 4).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Termisk denaturering<ol>
<li>Klik på fanen Smeltende scanning. Hvis du vil udføre forsøget, skal du indstille starttemperaturen til 20 °C, sluttemperaturen til 95 °C og temperaturskråningen til 1 °Cmin.-1. Klik på Start måling.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kommentere eksperimentet<ol>
<li>Når eksperimenterne er startet, skal du klikke på fanen Anmærkning og Resultater. Anmærke hver kapillær ved at give det en unik plade- og godt nummer. BEMÆRK: For eksempel ville kapillær 1B2 svare til plade 1 og godt B2. I denne fane kan der tilsættes ekstra kolonner til eksperimentet, f.eks. Når eksperimentet er færdigt, vises resultaterne også under denne fane. Dette er et godt tidspunkt at holde pause i slutningen af dagen; forsøgene finder sted natten over, kan resultaterne indsamles den næste dag.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Datavisualisering og eksport<ol>
<li>Når eksperimentet er færdigt, skal du klikke på fanen Smeltende scanning for at få vist smelte- og spredningskurverne for prøverne. Hvis du vil eksportere resultaterne i et regneark, skal du klikke på fanen Smeltende scanning, klikke på Eksporterog vælge Eksporter behandlede data i rullemenuen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig4v11.jpg"> Figur 4: Justering af excitationseffekten og fluorescenssignalet. (A) Ved 80 % excitationseffekt er fluorescenssignalet for de fleste prøver over mætningsgrænsen. (B) Fluorescenssignalet reduceres til målbare niveauer ved at reducere excitationseffekten til 60%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig4v11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
4. Gentagelse
<ol><li>Gentag trin 1-3 for at udføre 16 kørsler på hele Enamine-biblioteket med 768 forbindelser (16 × 48 = 768).</li>
	<li>Da målingen af hver plade tager ~ 1,5 timer at fuldføre, skal du udfylde anmærkningen (3.4.3) og forberede den næste proteinfragmenter plade ved at gentage trin i afsnit 1 og 2. BEMÆRK: På en typisk arbejdsdag kan man måle 4-6 plader afhængigt af erfaringen. Screeningen af hele DSi-biblioteket kan afsluttes på i alt 3-4 dage.</li>
</ol>5. Dataanalyse
<ol><li>Undersøgelse af de genererede data<ol>
<li>Når hver kørsel er fuldført, skal du klikke på fanen Anmærkninger og Resultater for at få vist resultaterne. For hver prøve skal du fokusere på to beregnede værdier, der er vigtigst i denne oversigt: 1) Spredningsdebuttemperaturen (Debut #1 for Spredning), som angiver temperaturen i starten af øgede spredningshændelser for stikprøver og er karakteristisk for sammenlægningen. 2) Tm (Bøjningspunkt # 1 for Ratio) værdi udvundet fra forholdet mellem fluorescens begivenheder på 330 og 350 nm-værdier, der typisk svarer til de maksimale ændringer af tryptofan fluorescens ved ændringer i dens miljø.</li>
		<li>Sørg for at kontrollere spredningen og smeltekurverne for hver kapillær under fanen Smeltescanning for at sikre, at disse værdier er pålidelige.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksportere og inspicere til et regneark<ol>
<li>Eksporter dataene fra alle forskellige kørsler til inspektion til et regnearkssoftware som beskrevet i 3.4.4, og for at oprette oversigtstabeller og plots. Klik på de forskellige ark i regnearksfilen for at notere oplysningerne i hvert ark.<ol>
<li>Bemærk, at hver række svarer til ét eksperiment, i oversigtsarket. Langs en oversigt over parametre (f.eks.start- og sluttemperatur) skal du observere de beregnede værdier for Tm og spredningsdebuten (se 5.1 ovenfor for navne og forklaring og supplerende fil 1 og 2 for et eksempel). Da softwaren beregner to eller flere Tm værdier (Bøjningspunkt # 1 og # 2 for Ratio) for nogle prøver, se på den smeltende overgangskurve for at bestemme, hvilken af Tm-værdierne der er korrekte.</li>
			<li>Bemærk i ratioarket, at hver kolonne svarer til et eksempel, og hver række til dataene, der læses ved hvert temperaturtrin. Overhold de fluorescenstællingsværdier, der svarer til hvert temperaturtrin, og brug dem til at afbilde smeltekurverne for specifikke prøver og afbilde temperaturkolonnen mod kolonnen fluorescenstælling. Bemærk, at dataene i forholdet (første derivat), 330 nm, 330 nm (første derivat), 350 nm, 350 nm (første derivat) bruges til at beregne forholdet og dets første derivat (som har et maksimum ved den maksimale ændringshastighed) i et lignende format.</li>
			<li>Overhold lignende data til spredning i spredningsarket. Generer spredningskurven for hvert eksempel ved at afbilde temperaturkolonnen i forhold til spredningskolonnen. Kig efter arket for spredning første derivat.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oprette og validere en global oversigt for alle fragmenter<ol>
<li>Når du har kontrolleret de korrekte Tm-værdier for fragmenterne, skal du kombinere kolonnerne Eksempel-id og bøjningspunkt på 330/350 nm ratio (Tm)fra alle kørsler i en enkelt ny resultatfil og kopiere disse kolonner fra hver kørsel.</li>
		<li>Brug den gennemsnitlige Tm-værdi af det oprindelige protein (typisk beregnet over ti kørsler) og træk det fra Tm-værdierne for hver prøve for at få ΔTm. Sorter resultaterne over ΔTm i faldende rækkefølge for at identificere de prøver, der resulterer i det største skift.</li>
		<li>Del fragmenterne op i placeringer afhængigt af ΔT m-skiftet, og opret en frekvenstabel for hele biblioteket ved at afbilde ΔT-m for hver placering i forhold til antallet af fragmenter (Figur 5). Vis for nemheds skyld den akse, der repræsenterer antallet af fragmenter i logskalaen. Bin prøven med ΔTm ±1, og tilpasse de andre placeringer til hver køre for at justere antallet af outliers empirisk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-driven+hit-to-lead+optimization+guided+by+structure-based+approaches.">Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches.</a> Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059 (2018).</li><li>Lamoree, B., Hubbard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+in+fragment-based+lead+discovery+(FBLD).">Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD).</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).</li><li>Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment-based+lead+discovery.">Fragment-based lead discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).</li><li>Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment-based+lead+discovery:+Leads+by+design.">Fragment-based lead discovery: Leads by design.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).</li><li>Bradley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SGC+beyond+structural+genomics:+Redefining+the+role+of+3D+structures+by+coupling+genomic+stratification+with+fragment-based+discovery.">The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery.</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).</li><li>Davies, T. G., Tickle, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+screening+using+X-ray+crystallography.">Fragment screening using X-ray crystallography.</a> Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).</li><li>Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+of+fragment-based+lead+discovery+-+A+perspective+from+NMR.">Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR.</a> Molecules. 21 (7), 854 (2016).</li><li>Troelsen, N. S., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+design+strategies+to+accelerate+fragment-based+drug+discovery.">Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery.</a> Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).</li><li>Shi, Y., von Itzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+size+matters:+Diversity+for+fragment+library+design.">How size matters: Diversity for fragment library design.</a> Molecules. 24 (15), 2838 (2019).</li><li>Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+fragment-screening+library.">Design of a fragment-screening library.</a> Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).</li><li>Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+methods+for+identifying+fragment-based+inhibitors+of+protein-protein+interactions.">Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).</li><li>Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment-based+approach+to+drug+lead+discovery:+Overview+and+advances+in+various+techniques.">Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques.</a> Drugs in R &amp; D. 9 (4), 217-227 (2008).</li><li>Winter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+computational+fragment-based+approaches+to+targeting+protein-protein+interactions:+Applications+in+structure-guided+drug+discovery.">Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).</li><li>Boelens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNEXT:+a+European+facility+network+to+stimulate+translational+structural+biology.">iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology.</a> FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).</li><li>Zhang, R., Monsma, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+thermal+shift+assays.">Fluorescence-based thermal shift assays.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).</li><li>Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+purification+and+characterization+using+Thermofluor+screens.">Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens.</a> Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay:+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies.">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+stabilize+protein:+stability+screens+for+thermal+shift+assays+and+nano+differential+scanning+fluorimetry+in+the+Virus-X+Project.">How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666 (2019).</li></ol>

Der er ingen oplysninger.

Denne protokol beskriver en mellem-til-høj gennemløbsmetode til screening af fragmentbiblioteker ved hjælp af nogle almindelige robotteknologi- og måleinstrumenter. Skærme som dem, der er beskrevet i denne protokol, kan rutinemæssigt udføres af NKI Protein Facility i Amsterdam, for eksempel som en iNEXT-Discovery-tjeneste, ofte endda gratis for brugere efter forslagsansøgning og peer review. I sådanne tilfælde kan det DSi-Poised-bibliotek leveres af faciliteten, men brugen af andre biblioteker kan også diskuteres i forbindelse med hver enkelt brugeransøgning og serviceaftale. Valget af instrumenter i denne protokol repræsenterer praktiske løsninger for mange laboratorier, men bør ikke betragtes som en guldstandard. Etiketfrie metoder anbefales til måling af målproteinets termiske stabilitet til fragmentscreening i stedet for metoder, der anvender miljøfølsomme etiketter til at registrere sig i en termocykel af omvendt transskriptionskædereaktion.
Etiketfrie metoder, som den, der præsenteres her ved hjælp af Prometheus-instrumentet, har nogle fordele: de bruger lave mængder protein, ofte et par størrelsesordener mindre; de kan anvendes til samtidig at måle spredningen af prøven og dermed sammenlægningen og de etiketter, der bruges til at registrere udfoldning i andre tilgange, kan interagere forskelligt med hvert fragment, hvilket resulterer i måleartefakter. Denne protokol er blevet beskrevet i forbindelse med Mosquito-robotten, som gør det muligt at pipettere en meget lille mængde prøve (0,3 μL), som ikke kan udføres manuelt. Mosquito er en populær robot, der er til stede i mange laboratorier, der arbejder på strukturelle biologi- og lægemiddelopdagelsesprojekter; Protokollen kan dog klart bruge alternative tilgange til pipettering med lav volumen.
Fragmentbiblioteker indeholder forbindelser, der er opløst i DMSO. En af de første udfordringer er at finde den optimale DMSO-koncentration, hvor proteinet forbliver stabilt, og forbindelserne forbliver opløselige. Dette indebærer udførelse af målingerne ved forskellige DMSO-koncentrationer for at bestemme de optimale betingelser for screening. Proteinet til fragment fortynding, der anvendes her resulterer i DMSO koncentrationer på 0,2%; de fleste proteiner er ret stabile under disse forhold. Den mængde protein, der kræves til at udføre screeningen for 768-sammensatte bibliotek er ~ 2-3 mg i alt, da målingerne typisk udføres ved lave proteinkoncentrationer (0,2 mg mL-1). At arbejde med sådanne relativt lave proteinkoncentrationer reducerer ikke kun proteinproduktionsomkostningerne, men reducerer også chancerne for proteinudfældning. Den lave proteinkoncentration påvirker ikke påvisning af fragmentbinding, da koncentrationen af fragmenterne i eksperimentet er ~ 2 mM, hvilket gør det muligt også at identificere svage bindemidler.
Da den smeltende overgang detektion i disse eksperimenter er baseret på fluorescens intensitet, et kritisk aspekt er at bestemme excitation magt laseren til at udføre målingerne. Samspillet mellem forbindelserne og proteinet kan (i) ikke have nogen effekt på dets iboende fluorescens, ii) resultere i slukning eller (iii) øge dets iboende fluorescens. Derudover betyder arbejdet med lave proteinkoncentrationer, at fluorescenstallet for det oprindelige protein ville være lavt. Excitationseffekten skal derfor justeres på en sådan måde, at de fleste prøver kan måles. Spredningsprofilen for hvert løb indeholder vigtige oplysninger om de aggregeringseffekter, der kan udløses af tilføjelsen af et fragment. Derudover kan temperaturens effekt på sammensat opløselighed også ses på spredningsprofilen.
Uventet blev det for mange forbindelser observeret, at spredningen faktisk faldt med stigende temperatur (Figur 6). Det er derfor vigtigt at se på både den smeltende overgangskurve og den ledsagende spredningsprofil for at afgøre pålideligheden af hvert eksperiment, især for de fragmenter, der betragtes som kandidater til mere krævende målinger ved røntgenkrystallografi eller NMR-spektroskopi eller endda betragtes som hits for opfølgende kemi. En specifik begrænsning af metoden til fragmentscreeningsformål er, at mange fragmenter i det DSi-poised bibliotek har betydelig iboende fluorescens, nogle gange endda ud over detektorens mætningsgrænse, og derfor kan disse ikke screenes korrekt for målbinding selv ved lav excitationskraft. Et andet punkt at bemærke for denne metode er, at det kun kan bruges med proteiner, der indeholder tryptofanrester.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11.jpg"> Figur 6: Temperatureffekt på sammensat opløselighed. Smeltende overgangskurve og spredningsprofil af Hec1 med to forskellige forbindelser. (A) Spredningsprofilen viser at opløseligheden for denne prøve ikke påvirkes af temperaturen. (B) Spredningsprofilen viser, at opløseligheden af denne prøve øges med stigende temperatur. Den smeltende overgangskurve er derfor ikke pålidelig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Et åbent spørgsmål er, hvad der bør betragtes som en væsentlig ændring i Tm, ikke ud fra et matematisk perspektiv, men fra et praktisk synspunkt: hvilken ændring i Tm er vigtig at overveje som tegn på binding af en ligand til et protein? I disse eksempler ses skift på mindre end 1 °C for 74 % af fragmenterne til binding af Hec1, 66 % for Mps1 og 53 % for Nsp5. I betragtning af, at 1 °C betragtes som "betydelig ændring", vil det næppe give hits, der er værd at forfølge ved opfølgende kemi. I oversigtsgraferne (Figur 5) blev der taget hensyn til placeringer på 1, 2, 5 eller mere end 5 graders Tm skift, enten positive eller negative. Dette kræver ændringer i henhold til hver enkelt sag for at give et godt overblik og for at muliggøre informeret beslutningstagning, der bestemmer det næste skridt. Især for nogle proteiner blev både stabilisering og destabilisering af målet observeret afhængigt af de betragtede fragmenter. Begge begivenheder er interessante, da begge dele kan være resultatet af fragmentbinding, og begge kan føre til et godt opfølgningsmolekyle til at manipulere proteinadfærd.
Et sidste spørgsmål er stadig, nemlig " hvad definerer et nyttigt hit?". Faktisk afhænger svaret af den specifikke situation. For eksempel, for Hec1, alle fragmenter, der stabiliserer proteinet med mere end 2 grader eller destabilisere det med mere end 5 blev meddelt til vores kemi samarbejdspartnere, der designede nye molekyler baseret på disse hits. For Nsp5 blev de mest de-stabiliserende hits dog meddelt vores NMR-samarbejdspartnere for at bekræfte de nanoDSF-afledte hits med NMR-eksperimenter. Med andre ord bør de screeningsresultater, der er opnået fra denne protokol, analyseres med forsigtighed og på en kontekstafhængig måde og træffe informerede beslutninger baseret på det specifikke spørgsmål og den omgivende metode. Under alle omstændigheder er den metode, der er beskrevet her, en komplementær tilgang til eksisterende metoder som røntgen- og NMR-baseret screening, som kan sigte mod at bekræfte, prioritere eller give nye ideer til kemikampagner.
Supplerende tabel S1: Liste over buffere, der anvendes til screening af proteiner. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morpholino)butanesulfonsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Supp_Table_S1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel S2: Egenskaber til MRC 2-brønds plade til brug med nanodispenser robot. Klik her for <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S2.xlsx" target="_blank">at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel S3: Egenskaber til 96-brønd V-bundplade til brug med nanodispenser robot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S3.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel S4: Bufferen, proteinkoncentrationen og Tm af de proteiner, der er diskuteret i repræsentative resultater. Forkortelser: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Stærkt udtrykt i kræft 1 protein; Mps1 = monopolar spindel kinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-lignende protease. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S4.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende fil 1: Oversigt parametre-eksempeldata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementaty_file_1.xlsx" target="_blank"></a>
Supplerende fil 2: Tm og ΔTm værdier for 406 fragmenter-eksempel data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementary_file_2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Drug discovery programmer ofte starte med screening kemiske forbindelser for deres evne til at interagere med og / eller ændre funktionen af narkotika mål, oftest proteiner. De såkaldte "hits", der findes i sådanne skærme, danner grundlag for opdagelsen af nye kundeemner og udviklingskandidater og for de fleste af de nye lægemidler, der bliver licenseret i disse dage. Tilgængeligheden af metoder med høj kapacitet er derfor uundværlig for at screene et enormt antal tilgængelige mål med et stort antal forskellige forbindelser for hurtigt at identificere deres stramme binding eller deres evne til at modulere en bestemt funktion af målet. Efter hits er identificeret, de mest lovende hit-target kombinationer skubbes ind i en omfattende lægemiddeludvikling pipeline ved hjælp af andre, ofte dyre og tidskrævende teknologier, for at forstå "struktur-aktivitet relationer" (SAR).
Strukturelle biologi tilgange, såsom dem, der tilbydes af EU-finansierede adgangsprogrammer "Infrastruktur for NMR, EM, og røntgenstråler til translationel forskning" (iNEXT) og dens nuværende efterfølger iNEXT-Discovery, bruges ofte til at studere samspillet mellem mange forbindelser i ekstreme detaljer og samtidig forbedre affinitet og farmakologiske egenskaber af de første hits ved typisk flere runder af syntetisk kemi1. Blyforbindelser, der kommer ud af disse "fra hit to lead"-kampagner, bliver udviklingskandidater og indgår prækliniske undersøgelser. Den veludviklede molekylærscreeningsmetode kan groft kategoriseres i to tilgange, nemlig den ligandbaserede lead discovery (LBLD) og fragmentbaseret lead discovery (FBLD). I LBLD kampagner, protein receptorer screenes med enten et par tusinde håndplukkede ligands (baseret på strukturen af naturlige ligands eller strukturen af målet), eller med mange titusinder af forbindelser i stof-lignende ligand biblioteker, der dækker en stor del af kemiske rum.
Normalt, forbindelserne er testet for deres hæmmende aktivitet i en aktivitet assay, typisk overvågning af en enzymatisk funktion. I FBLD kampagner2,3,4,5, dog, nogle hundredvis af forbindelser, der er typisk mindre end narkotika (100-200 Dalton) er testet for deres evne til at binde målet direkte, uden brug af en aktivitet assay. Denne binding kan forstyrre målaktiviteten og kan måles ved mange biofysiske metoder, der rapporterer direkte om fragmenters evne til at binde sig til målet eller ved strukturelle metoder som røntgenkrystallografi6 og nuklear magnetiskresonansspektroskopi 7og for nylig også kryoelektronmikroskopi. Når fragmenter binder på forskellige steder, der er tæt på hinanden på proteinet, kan de forskellige, normalt lav-affinitet bindende fragmenter rationelt kombineres kemisk for at skabe et lille sæt kundeemner, der kan studeres mere detaljeret. Dette resulterer ofte i højere affinitet, mere potente forbindelser, og denne metode er begyndt at give vigtige molekyler med klinisk potentiale. Valget af et "ideelt" fragmentbibliotek, der udnytter kemiske grupper effektivt, har været et aktivt forskningsområde i mange år8,9,10.
Mens der i første omgang blev lagt vægt på at dække fuldt kemisk rum, var der efterfølgende fokus på at gøre det muligt for den kemiske kombination af fragmenthits i nedstrøms at producere blyforbindelser. En sådan forskning har ført til de såkaldte "klar" biblioteker. Disse indeholder fragmenter med mindst én funktionel gruppe, der muliggør hurtig, billig opfølgende syntetisk kemi for effektiv fremskridt med at studere SAR. En af de aktiviteter, der blev katalyseret af iNEXT, var at opdatere det klarbibliotek, der blev udviklet af forskere i Diamond Light Source og Structural Genomics Consortium. Denne kombinerede indsats resulterede i DSi-Poised library11, som også er blevet valideret inden for iNEXT12. Senere blev dette bibliotek tilpasset tilgængeligheden af forbindelser i real database af Enamine Ltd., en kemisk forskningsorganisation og producent af store samlinger af byggesten og sammensatte biblioteker til screening. DSi-Poised er nu tilgængelig for alle til køb, men også tilgængelig i mange iNEXT-Discovery partnerlaboratorier til støttede fragmentscreeningsprojekter.
High-end X-ray krystallografi og NMR strukturelle biologi teknologier både har deres fordele og ulemper for FBLD. Begge kræver isolerede målprøver og giver de atomdetaljer med høj opløsning, der kræves til FBLD. Krystaller er imidlertid nødvendige for røntgenkrystallografi, og fragmenterne binder sig til hulrum i de velordnede proteinregioner, der ikke er involveret i opbygningen af det tredimensionelle krystalgitter. Løsning NMR giver ofte forskellige hits fra røntgenkrystallografi, da den ikke påvirkes af krystalmiljøet og er god til at opdage binding også i delvist bestilte proteinregioner. Men mens ligand-baserede NMR eksperimenter er relativt hurtige, de stadig kræver en betydelig mængde tid og materiale og kan rutinemæssigt kun gøres for relativt små protein mål eller domæner. Med henblik på at prioritere forbindelser til krystallografiske eller NMR-eksperimenter er der anvendt biofysiske tilgange13,14,15.
Da de seneste instrumenterings- og beregningsprotokoller tillader effektiv krystallografisk screening for FBLD ved at bestemme strukturer og analysere ~ 1.000 fragmenter meget effektivt, er denne prioritering blevet mindre afgørende i røntgenbaseret forskning. For NMR er det dog stadig ønskeligt at bruge billigere og hurtigere eksperimenter til at prioritere biblioteksscreening og spare instrumenttid på højeste udstyr. Samtidig kan brug af en kombination af væsentlige forskellige teknologier give uafhængig bekræftelse af bindende begivenheder eller endda yderligere hits, der ikke afhentes ved kun at anvende krystallografien eller NMR-metoden. Crystallographic og NMR teknikker begge kræver meget dyrt udstyr og kan ofte kun gøres i dedikerede eksterne faciliteter med hjælp fra lokale, højt kvalificerede eksperter. Derudover kræver en korrekt analyse af resultaterne også høj ekspertise. Mens programmer som iNEXT og iNEXT-Discovery er demokratisere adgangen til sådanne faciliteter16, er det blevet erkendt, at billige, hurtige, og high-throughput FBLD screening af andre metoder kan tilskynde drug-screening programmer i en langt bredere vifte af laboratorier. Sådanne resultater kan derefter bruges som en indikation til at opbygge samarbejder med medicinske kemikere, og at prioritere de dyreste screening eksperimenter til de mest lovende forbindelser, hvis NMR og krystallografi faciliteter pålægge restriktioner på antallet af forbindelser, der kan screenes.
TSA danner en hurtig, effektiv og relativt billig og tilgængelig biofysisk metode17, der kan bruges til FBLD-screening. Det er blevet brugt i flere indstillinger, fra medvirken til at finde stabile protein betingelser for krystallisering forsøg18, at finde forbindelser, der binder sig til specifikke mål i cellerne19. TSA'er er også blevet brugt til at måle dissociationskonstanter for ligands bindende målproteiner, da ligandbinding ofte fører til ændringer i termisk stabilitet. I alle TSA'er måles ændringen i denatureringstemperaturen for et protein (dets stabilitet) som en funktion af en langsom temperaturstigning. En effektiv måde at følge proteindenaturering ved opvarmning er ved DSF eller Thermofluor, som kvantificerer fluorescens quenching af et hydrofobisk farvestof (typisk Sypro Orange) ved interaktion med udsatte hydrofobiske proteinområder, der udfolder sig på grund af temperaturstigning.
Nano-DSF refererer typisk til måling af proteinets termiske stabilitet i mangel af eksterne farvestoffer. Et af de første instrumenter, der gav denne mulighed, var OPTIM1000, der måler et bredt spektrum af lysintensitet samt lysspredning af en prøve. Denne maskine gjorde det muligt samtidig at måle proteinudfoldning (typisk efter tryptofan fluorescens) og protein aggregering (som dannede nanopartikler resultere i en stigning i lysspredning ved ~ 400 nm). Senere introducerede Prometheus brugen af back-reflection til måling af aggregering og følsom påvisning af fluorescenssignalet, hvilket gjorde det muligt at screene lavproteinkoncentrationer med god følsomhed20. I det følgende afsnit beskrives, hvordan Prometheus blev brugt til at demonstrere en fragmentscreeningsprotokol til påvisning af hits for forskellige proteinmål. En kort introduktion om den forventede proteinkvalitet og kvantitet efterfølges af en trinvis protokol til forberedelse, udførelse og analyse af fragmentscreeningseksperimenterne. Screeningsresultater for tre proteiner er blevet vist som eksempeldata opnået som en del af iNEXT-Discovery-samarbejder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td>adhesive sealing film for protein plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>CORNING</td>
			<td></td>
			<td>adhesive sealing film for fragment plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSi poised library</td>
			<td>Enamine</td>
			<td></td>
			<td>Fragment library containing 768 compounds used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elisa Reagent Reservior</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15075</td>
			<td>Reagent reservior used for pipetting the protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner round (U) bottom plates</td>
			<td></td>
			<td>Cat. No.&#160;650201</td>
			<td>Fragments supplied in these plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito type X1</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>Part nr- 3019-0003</td>
			<td>Nanolitre dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 2-well crystallization plate</td>
			<td></td>
			<td>MRC96T-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ELISA Reagent Reservoirs</td>
			<td>Pierce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prometheus High Sensitivity capillaries</td>
			<td>Catalog PR-C006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prometheus NT.48 nanoDSF</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO)</td>
			<td>nanoDSF and light back scattering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prometheus Standard capillary type</td>
			<td>Catalog PR-C002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-1000</td>
			<td colspan="2">Thermoscientific</td>
			<td>Centrifuge for plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery

Termiske skiftanalyser (TSA'er) undersøger, hvordan smeltetemperaturen (Tm)for et målprotein ændrer sig som reaktion på ændringer i dets miljø (f.eks.buffersammensætning). Nytten af TSA, og specifikt af nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), er blevet etableret i årenes løb, både for at finde betingelser, der hjælper med at stabilisere et bestemt protein og for at se på ligand bindende ved at overvåge ændringer i den tilsyneladende Tm. Dette papir præsenterer en effektiv screening af Diamond-SGC-iNEXT Klar (DSi-Klar) fragment bibliotek (768 forbindelser) ved hjælp af nano-DSF, overvågning Tm til at identificere potentielle fragment bindende. Forudsætningerne for proteinkvalitet og -koncentration for at udføre nano-DSF-eksperimenter er kort skitseret efterfulgt af en trinvis protokol, der bruger en nano-liters robotdispenser, der almindeligvis anvendes i strukturelle biologilaboratorier til fremstilling af de nødvendige prøver i 96-brøndsplader. Protokollen beskriver, hvordan reagensblandingerne overføres til de kapillærer, der er nødvendige for nano-DSF-målinger. Derudover indeholder dette dokument protokoller til måling af termisk denaturering (overvågning af iboende tryptofanlyscens) og sammenlægning (overvågning af lys back-scattering) og de efterfølgende trin til dataoverførsel og analyse. Endelig diskuteres screeningsforsøg med tre forskellige proteinmål for at illustrere brugen af denne procedure i forbindelse med kampagner for opdagelse af bly. Det overordnede princip i den beskrevne metode kan let overføres til andre fragmentbiblioteker eller tilpasses andre instrumenter.

En fuld skærm af DSi-Klar bibliotek (768 fragmenter) blev udført på tre proteiner af medicinsk interesse, nemlig den ydre kinetochore stærkt udtrykt i Kræft 1 protein (Hec1, eller Ndc80), den lovgivningsmæssige tetraricopeptid gentage (TPR) domæne monopolardle spinse 1 (Mps1), og SARS-CoV-2 3C-lignende protease, Nsp5, som spalter C-terminus af replikaer polyprotein på 11 steder. De bufferbetingelser, der vælges for hvert protein, samt proteinkoncentrationen og Tm af proteinerne, er vist i supplerende tabel S4.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig5v12.jpg"> Figur 5: Frekvensfordelingen af skiftet i smeltetemperaturen (ΔTm) for de tre proteiner, Hec1, Mps1 og Nsp5, der præsenteres i denne undersøgelse som repræsentative resultater. Forkortelser: Hec1 = Stærkt udtrykt i kræft 1 protein; Mps1 = monopolar spindel kinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-lignende protease. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig5v11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Resultaterne af de tre screeninger ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol, der vises som frekvensfordelingen af ændringen i Tm i forhold til antallet af fragmenter, er vist i figur 5. Disse parceller er genereret som beskrevet i punkt 5.3 i protokollen, der afbilder hyppigheden af den observerede ændring i Tm. Skiftets betydning skal defineres subjektivt for alle forskellige projekter, som beskrevet i diskussionsafsnittet nedenfor. Negative værdier indikerer en reduktion i smeltetemperaturen i nærværelse af et fragment, en positiv værdi en stigning i Tm. Fra sådanne plots er det let at observere, at for Nsp5 har alle fragmenter en destabiliserende virkning, mens der for Hec1 og Mps1 observeres både stabiliserende og destabiliserende hits. Dette kan forventes og vil blive diskuteret.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery at JoVE.com

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Overvågning af ændringer i smeltetemperaturen af et målprotein (dvs.termisk skiftanalyse, TSA) er en effektiv metode til screening af fragmentbiblioteker af et par hundrede forbindelser. Vi præsenterer en TSA-protokol, der implementerer robotassisteret nanodifferenti differentialscanning af fluormetri (nano-DSF) til overvågning af iboende tryptofanlyscens og let rygspredning til fragmentscreening.

Nano-differentialscanning fluormetri til screening i fragmentbaseret lead discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Denne protokol er nyttig til kampagner for registrering af fragmenterede led som et ekstra værktøj til valg af lovende fragmenter som varmekandidater. Nano DSO til fragmentscreening bruger en begrænset mængde umærket proteinprøve og kan rutinemæssigt anvendes til næsten alle proteinmål. Denne metode kan bruges til at screene alle samlinger af ligands.eller for at kontrollere varme fra de andre metoder. Tag en fragmentplade ud fra fryseren minus 20 eller minus 80 grader og lad den tø op ved stuetemperatur med blid rysten på en bænktop shaker. Centrifuge pladen på 500 gange G i 30 sekunder for at indsamle eventuelle dråber klæber til siden af brøndene.Tag en MRC 2-brønd krystallisering plade og pipette 15 mikroliter af protein lageropløsningen i hver sub godt ved hjælp af en multi-kanal pipette. For at kontrollere fragment- og proteinpladedefinitioner på Mosquito skal du tænde nanodispenseren og sørge for, at der ikke er forhindringer omkring de bevægelige komponenter. Åbn den grafiske brugergrænseflade, klik på fanen Opsætning og under Dækkonfiguration kontrollere, om den type plade, hvor forbindelserne leveres, og den, hvor proteinet overføres, allerede findes på listen over tilgængelige plader.Hvis ikke, skal du klikke på Indstillinger og derefter på Plader og oprette en ny pladedefinition ved at udfylde de korrekte værdier for egenskabstypen. Angiv pladepositionerne under Dækkonfiguration under fanen Opsætning. Brug rullemenuen til at vælge Grainier U bundplade til position et og MRC 2-brønds plade til position to og gemme protokollen.Placer fragmentpladen på position et og proteinpladen på position to af dækket. Klik på Filer under protokolfanen, og vælg den protokol, der blev gemt i forrige trin til udlevering af fragmenterne. Definer mængden af de fragmenter, der skal udleveres, som 0,3 mikroliter.For en typisk plade, hvor kolonne et og 12 ikke indeholder fragmenter, skal du definere startplaceringen til kolonne to og slutplaceringen til kolonne 11. Hvis kolonne to eller 11 er tomme i nogle plader, skal du bruge kolonne tre og 10 som start- og slutværdier. Klik på Kør for at starte programmet.Når dispensering, som tager cirka to minutter er afsluttet, fjerne protein og fragment plader fra robotten og forsegle dem med en klæbende forsegling film. Kort centrifuge proteinpladen på 500 gange G i 30 sekunder for at indsamle enhver dråbe stikning til siderne brøndene, før du går videre til næste trin. Undersøg visuelt proteinpladens brønde for nedbør, der kunne have fundet sted på grund af tilsætning af fragmenter.Hvis nedbør observeres i mange brønde, reducere koncentrationen af fragmenter og gentage eksperimentet. Tænd Prometheus-instrumentet. Tryk på Åbn skuffe på berøringsskærmen for at få adgang til instrumentets kapillærbelastningsmodul.Fjern magnetstriben fra lastemodulet, og rengør spejlet med ethanol for at fjerne støvpartikler. For at overføre en opløsning fra proteinfragmenterpladen til kapillærerne skal proteinpladen og kapillærerne placeres ved siden af instrumentet for nem adgang til kapillærbelastningsmodulet. Tag den ene kapillær, der holder den i den ene ende, og rør ved opløsningen i proteinpladen med den anden ende af kapillæren for at overføre prøven.Brug altid handsker og sørg for ikke at røre kapillæren i midten, da urenheder fra handskerne vil påvirke målingen. Placer kapillæren i holderens udpegede position, og sørg for, at den er korrekt justeret og centreret, gentag disse trin for at udfylde alle positioner i lastmodulet. I slutningen skal du placere magnetstriben oven på kapillærerne for at holde dem på plads og trykke på Luk skuffe for at starte Nano-DSF-eksperimentet.Åbn Prometheus-program-PR. ThermControl og oprette et nyt projekt ved at klikke på Start ny session. Først skal du lave en opdagelsesscanning for at opdage eksescensen af prøverne. Ændre ekstenscerende signal af prøverne ved at justere excitation magt laseren.For en termisk denaturering skal du klikke på fanen Smeltende scanning, indstille starttemperaturen til 20 grader Celsius, sluttemperaturen til 95 grader Celsius og temperaturskråningen til en grad Celsius pr. Minut. Klik derefter på Start måling. Frekvensfordelingen af skiftet og smeltetemperaturen for den ydre, kinetiske eller stærkt udtrykt i kræft et protein, regulatorisk tetratricopeptid gentag domæne af monopolar spindel kinase 1, og SARS-CoV-2 3c-lignende protease er vist her.Negative værdier indikerer en reduktion i smeltetemperaturen i nærværelse af et fragment, mens en positiv værdi indikerer en stigning i smeltetemperaturen. For Nsp5 har alle fragmenter en de-stabiliserende effekt, mens der for Hec1 og Mps1 observeres både stabiliserende og destabiliserende hits. Dette er en billig og hurtig metode til at screene fragmentbiblioteker.Andre metoder såsom NMR eller røntgenkrystallografi kan vise den nøjagtige binding af fragmenter, og de er også tilgængelige via INX-opdagelse. Resultaterne med coronavirus var med til at foreslå nye forbindelser, der kan udvikles til medicin mod covid-19.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Udarbejdelse og levering af Protein Mikrokrystaller i lipide Cubic fase for Serial Femtosekund Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Forberedelse og<em&gt; In vivo</em&gt; Anvendelse af en aktivitetsbaseret Probe til<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid-amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokrystallografi af proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Hvordan til at stabilisere Protein: stabilitet skærme til termiske Skift Assays og Nano Differential Scanning Fluorimetry i projektets Virus-X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Overvågning af GPCR-β-arrestin1/2 interaktioner i realtid levende systemer til at fremskynde Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...