Name: nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery
Uploaded: 2021-05-16T15:00:00
Duration: 6 min 26 s
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"यह काम NKI प्रोटीन सुविधा, एक निर्देश-एरिक केंद्र के लिए उपयोग से लाभा हुआ । यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित 871037 परियोजना संख्या iNEXT, परियोजना संख्या 653706, और iNEXT-डिस्कवरी द्वारा वित्तीय सहायता प्रदान की गई है।

<ol>
	<li>Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-driven+hit-to-lead+optimization+guided+by+structure-based+approaches.">Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches.</a> Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059 (2018).</li><li>Lamoree, B., Hubbard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+in+fragment-based+lead+discovery+(FBLD).">Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD).</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).</li><li>Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. 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(144), e58666 (2019).</li></ol>

कोई खुलासे नहीं हुए हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td>adhesive sealing film for protein plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>CORNING</td>
			<td></td>
			<td>adhesive sealing film for fragment plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSi poised library</td>
			<td>Enamine</td>
			<td></td>
			<td>Fragment library containing 768 compounds used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elisa Reagent Reservior</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15075</td>
			<td>Reagent reservior used for pipetting the protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner round (U) bottom plates</td>
			<td></td>
			<td>Cat. No.&#160;650201</td>
			<td>Fragments supplied in these plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito type X1</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>Part nr- 3019-0003</td>
			<td>Nanolitre dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 2-well crystallization plate</td>
			<td></td>
			<td>MRC96T-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ELISA Reagent Reservoirs</td>
			<td>Pierce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prometheus High Sensitivity capillaries</td>
			<td>Catalog PR-C006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prometheus NT.48 nanoDSF</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO)</td>
			<td>nanoDSF and light back scattering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prometheus Standard capillary type</td>
			<td>Catalog PR-C002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-1000</td>
			<td colspan="2">Thermoscientific</td>
			<td>Centrifuge for plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery

थर्मल शिफ्ट परख (TSAs) की जांच कैसे एक लक्ष्य प्रोटीन के पिघलने तापमान (टीएम)अपने पर्यावरण में परिवर्तन के जवाब में बदलता है(उदाहरण केलिए, बफर संरचना) । टीएसए की उपयोगिता, और विशेष रूप से नैनो-डिफरेंशियल स्कैनिंग फ्लोरीमीटर (नैनो-डीएसएफ) की स्थापना वर्षों में की गई है, दोनों ऐसी स्थितियों को खोजने के लिए जो एक विशिष्ट प्रोटीन को स्थिर करने में मदद करती हैं और स्पष्ट टीएममें परिवर्तनों की निगरानी करके लिगांड बाध्यकारी को देखने के लिए । यह पेपर नैनो-डीएसएफ के उपयोग से डायमंड-एसजीसी-आईनेक्स्ट पोरियड (डीएसआई-पोरेटेड) खंड पुस्तकालय (768 यौगिकों) की एक कुशल स्क्रीनिंग प्रस्तुत करता है, संभावित टुकड़ा बाध्यकारी की पहचान करने के लिए टीएम की निगरानी करता है। नैनो-डीएसएफ प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए प्रोटीन की गुणवत्ता और एकाग्रता के बारे में आवश्यकताओं को संक्षेप में एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल द्वारा रेखांकित किया जाता है जो आमतौर पर 96-अच्छी प्लेटों में आवश्यक नमूनों को तैयार करने के लिए संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले नैनो-लीटर रोबोटिक डिस्पेंसर का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे अभिकर् चर मिश्रण नैनो-डीएसएफ मापन के लिए आवश्यक केशिकाओं को हस्तांतरित किए जाते हैं। इसके अलावा, यह पेपर थर्मल डेनैचेशन (आंतरिक ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस की निगरानी) और एकत्रीकरण (प्रकाश बैक-बिखरने की निगरानी) और डेटा हस्तांतरण और विश्लेषण के लिए बाद के चरणों को मापने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है। अंत में, लीड डिस्कवरी अभियानों के संदर्भ में इस प्रक्रिया के उपयोग को समझाने के लिए तीन विभिन्न प्रोटीन लक्ष्यों के साथ स्क्रीनिंग प्रयोगों पर चर्चा की जाती है । वर्णित विधि के समग्र सिद्धांत को आसानी से अन्य खंड पुस्तकालयों में स्थानांतरित किया जा सकता है या अन्य उपकरणों के अनुकूल किया जा सकता है।

चिकित्सा हित के तीन प्रोटीन पर डीएसआई-तैयार पुस्तकालय (768 टुकड़े) की एक पूर्ण स्क्रीन का प्रदर्शन किया गया था, अर्थात्, बाहरी किनेटोकोर अत्यधिक कैंसर 1 प्रोटीन (Hec1, या Ndc80) में व्यक्त, नियामक टेट्रारिकोपेप्टाइड रिपीट (टीपीआर) एकाधिकार धुरी kinase 1 (Mps1) के डोमेन, और सार्स-CoV-2 3C-प्रोटीज, Nsp5, जो प्रतिकृति पॉलीप्रोटीन के सी-टर्मिनस को बंद करता है। प्रत्येक प्रोटीन के लिए चुनी गई बफर स्थितियां, साथ ही प्रोटीन की प्रोटीन एकाग्रता और टीएम, पूरक तालिका S4में दिखाई जाती हैं।
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig5v12.jpg"> चित्रा 5:तीन प्रोटीन, Hec1, Mps1, और Nsp5 के लिए पिघलने के तापमान (1Tमीटर)में बदलाव की आवृत्ति वितरण, प्रतिनिधि परिणामों के रूप में इस अध्ययन में प्रस्तुत किया । संक्षिप्त रूप: Hec1 = अत्यधिक कैंसर 1 प्रोटीन में व्यक्त; Mps1 = एकाधिकार धुरी kinase 1; Nsp5 = सार्स-CoV-2 3C की तरह प्रोटीज । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig5v11large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके तीन स्क्रीनिंग के परिणाम, टीएम बनाम टुकड़ों की संख्या में परिवर्तन के आवृत्ति वितरण के रूप में प्रदर्शित, चित्र 5में दिखाए गए हैं। इन भूखंडों को प्रोटोकॉल की धारा 5.3 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किया गया है, जो टीएममें मनाए गए परिवर्तन की आवृत्ति की साजिश रचते हैं। बदलाव के महत्व को हर अलग परियोजना के लिए एक व्यक्तिपरक तरीके से परिभाषित करने की जरूरत है, जैसा कि नीचे चर्चा अनुभाग में वर्णित है । नकारात्मक मूल्य एक टुकड़े की उपस्थिति में पिघलने के तापमान में कमी का संकेत देते हैं, एक सकारात्मक मूल्य टीएममें वृद्धि। इस तरह के भूखंडों से, यह देखना आसान है कि एनएसपी 5 के लिए, सभी टुकड़ों का अस्थिर प्रभाव पड़ता है, जबकि एचईसी 1 और एमपीएस1 के लिए, स्थिर और अस्थिर हिट दोनों देखे जाते हैं। इससे उम्मीद की जा सकती है और इस पर चर्चा होगी।

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Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

एक लक्ष्य प्रोटीन(यानी,थर्मल शिफ्ट परख, टीएसए) के पिघलने के तापमान में परिवर्तन की निगरानी कुछ सौ यौगिकों के टुकड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक कुशल तरीका है । हम एक TSA प्रोटोकॉल प्रस्तुत रोबोटिक्स-सहायता प्राप्त नैनो-अंतर स्कैनिंग फ्लोरिमेट्री (नैनो-डीएसएफ) को लागू करने के लिए आंतरिक ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस और लाइट बैक-बिखरने की निगरानी के लिए टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए ।

टुकड़ा आधारित लीड डिस्कवरी में स्क्रीनिंग के लिए नैनो-अंतर स्कैनिंग फ्लोरीमीटर

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

यह प्रोटोकॉल गर्मी उम्मीदवारों के रूप में आशाजनक टुकड़ों का चयन करने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में खंडित-आधार लीड खोज अभियानों के लिए उपयोगी है। खंड स्क्रीनिंग के लिए नैनो डीएसओ अवेलेबल प्रोटीन नमूने की एक सीमित मात्रा का उपयोग करता है और नियमित रूप से लगभग सभी प्रोटीन लक्ष्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि का उपयोग लिगामेंट्स के किसी भी संग्रह को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है।या अन्य तरीकों से तपता सत्यापित करने के लिए। माइनस 20 या माइनस ८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एक टुकड़ा प्लेट बाहर ले लो और यह एक बेंच शीर्ष शेखर पर कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर गल चलो । कुओं के किनारे से चिपकी किसी भी बूंदों को इकट्ठा करने के लिए 30 सेकंड के लिए 500 बार जी पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें।एक एमआरसी 2-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट लें और प्रोटीन स्टॉक समाधान के 15 माइक्रोलीटर को एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक उप में अच्छी तरह से लें। मच्छर पर टुकड़ा और प्रोटीन प्लेट परिभाषाओं की जांच करने के लिए, नैनो डिस्पेंसर पर स्विच करें और सुनिश्चित करें कि चलती घटकों के आसपास कोई बाधा नहीं है। ग्राफिकल यूजर इंटरफेस खोलें, सेटअप टैब पर क्लिक करें और डेक कॉन्फ़िगरेशन चेक करें कि जिस प्रकार की प्लेट में यौगिकों की आपूर्ति की जाती है और जिसमें प्रोटीन स्थानांतरित किया जाता है, वह पहले से ही उपलब्ध प्लेटों की सूची में मौजूद है।यदि नहीं, तो विकल्पों पर क्लिक करें और फिर प्लेटें और संपत्ति के प्रकार के लिए सही मूल्यों को भरकर एक नई प्लेट परिभाषा बनाएं। सेटअप टैब के तहत, डेक विन्यास के तहत प्लेट पदों को निर्दिष्ट करें। ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके, स्थिति एक और एमआरसी 2-अच्छी प्लेट के लिए दो स्थिति के लिए Grainier यू बॉटम प्लेट चुनें और प्रोटोकॉल को बचाएं।डेक की स्थिति में एक और प्रोटीन प्लेट पर टुकड़ा प्लेट रखें। प्रोटोकॉल टैब में, फ़ाइल पर क्लिक करें और टुकड़ों को वितरित करने के लिए पिछले चरण में सहेजे गए प्रोटोकॉल का चयन करें। 0.3 माइक्रोलीटर के रूप में तिरस्कृत किए जाने वाले टुकड़ों की मात्रा को परिभाषित करें।एक विशिष्ट प्लेट के लिए जहां कॉलम एक और 12, टुकड़े नहीं होते हैं, स्टार्ट स्थान को कॉलम दो में परिभाषित करते हैं, और अंत स्थान कॉलम 11 में। कुछ प्लेटों में, यदि कॉलम दो या 11 खाली हैं, तो कॉलम तीन और 10 को शुरू और अंत मूल्यों के रूप में उपयोग करें। कार्यक्रम शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें।वितरण के बाद, जिसमें लगभग दो मिनट लगते हैं, रोबोट से प्रोटीन और टुकड़ा प्लेटों को हटा दें और उन्हें चिपकने वाली सीलिंग फिल्म के साथ सील करें। संक्षेप में 30 सेकंड के लिए ५०० बार जी पर प्रोटीन प्लेट अपकेंद्रित्र अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कुओं पक्षों से चिपके हुए किसी भी बूंद इकट्ठा करने के लिए । नेत्रहीन वर्षा के लिए प्रोटीन प्लेट के कुओं का निरीक्षण है कि टुकड़ों के अलावा के कारण हुई हो सकता है ।यदि कई कुओं में वर्षा देखी जाती है, तो टुकड़ों की एकाग्रता को कम करें और प्रयोग दोहराएं। प्रोमेथियस इंस्ट्रूमेंट पर स्विच करें। टच स्क्रीन पर, उपकरण के केशिका लोडिंग मॉड्यूल तक पहुंचने के लिए ओपन ड्रावर दबाएं।लोडिंग मॉड्यूल से चुंबकीय पट्टी निकालें और किसी भी धूल कणों को हटाने के लिए इथेनॉल के साथ दर्पण को साफ करें। प्रोटीन टुकड़े प्लेट से केशिकाओं में एक समाधान स्थानांतरित करने के लिए, केशिका लोडिंग मॉड्यूल तक आसान पहुंच के लिए प्रोटीन प्लेट और केशिकाओं को साधन के बगल में रखें। एक केशिका को एक छोर पर धारण करें और नमूने को स्थानांतरित करने के लिए केशिका के दूसरे छोर के साथ प्रोटीन प्लेट में समाधान को स्पर्श करें।हमेशा दस्ताने पहनें और सुनिश्चित करें कि दस्ताने से अशुद्धियों के रूप में बीच में केशिका को छूने के लिए माप को प्रभावित करेगा । धारक की निर्धारित स्थिति में केशिका रखें, यह सुनिश्चित करें कि यह ठीक से गठबंधन और केंद्रित है, लोडिंग मॉड्यूल में सभी पदों को भरने के लिए इन चरणों को दोहराएं। अंत में, केशिकाओं के शीर्ष पर चुंबकीय पट्टी रखें ताकि उन्हें जगह में पकड़ सके और नैनो-डीएसएफ प्रयोग शुरू करने के लिए क्लोज दराज दबाएं।प्रोमेथियस एप्लीकेशन पीआर खोलें। ThermControl और शुरू नए सत्र पर क्लिक करके एक नई परियोजना बनाएं। सबसे पहले, नमूनों के फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए एक डिस्कवरी स्कैन करें। लेजर की उत्तेजन शक्ति को समायोजित करके नमूनों के फ्लोरोसेंट सिग्नल को बदलें।थर्मल डेनैचेशन के लिए, पिघलने वाले स्कैन टैब पर क्लिक करें, शुरुआत के तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस तक, अंत तापमान को 95 डिग्री सेल्सियस तक और तापमान ढलान को प्रति मिनट एक डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। इसके बाद स्टार्ट मेजरमेंट पर क्लिक करें। बाहरी, गतिज, या अत्यधिक कैंसर एक प्रोटीन में व्यक्त के लिए बदलाव और पिघलने के तापमान की आवृत्ति वितरण, एकाधिकार धुरी kinase 1 के नियामक टेट्राट्राट्राकोपेप्टाइड दोहराने डोमेन, और सार्स-CoV-2 3c की तरह प्रोटीज यहां दिखाया गया है ।नकारात्मक मूल्य एक टुकड़े की उपस्थिति में पिघलने के तापमान में कमी का संकेत देते हैं, जबकि एक सकारात्मक मूल्य पिघलने के तापमान में वृद्धि को इंगित करता है। Nsp5 के लिए, सभी टुकड़ों का प्रभाव डी-स्थिर होता है, जबकि एचईसी 1 और एमपीएस1 के लिए, स्थिर और डी-स्थिर हिट दोनों देखे जाते हैं। यह टुकड़ा पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए एक सस्ता और त्वरित तरीका है।एनएमआर या एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी जैसे अन्य तरीके टुकड़ों की सटीक बाध्यकारी दिखा सकते हैं और वे INX खोज के माध्यम से भी उपलब्ध हैं। कोरोनावायरस प्रोटीज के परिणामों ने नए यौगिकों का प्रस्ताव करने में मदद की जिन्हें COVID-19 के खिलाफ दवाओं में विकसित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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