Name: nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery
Uploaded: 2021-05-16T15:00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery at JoVE.com

«Эта работа выиграла от доступа к NKI Protein Facility, центру Instruct-ERIC. Финансовую поддержку оказали iNEXT, проект No 653706, и iNEXT-Discovery, проект No 871037, финансируемый программой Horizon 2020 Европейской комиссии».

<ol>
	<li>Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-driven+hit-to-lead+optimization+guided+by+structure-based+approaches.">Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches.</a> Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059 (2018).</li><li>Lamoree, B., Hubbard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+in+fragment-based+lead+discovery+(FBLD).">Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD).</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).</li><li>Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment-based+lead+discovery.">Fragment-based lead discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).</li><li>Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment-based+lead+discovery:+Leads+by+design.">Fragment-based lead discovery: Leads by design.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).</li><li>Bradley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SGC+beyond+structural+genomics:+Redefining+the+role+of+3D+structures+by+coupling+genomic+stratification+with+fragment-based+discovery.">The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery.</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).</li><li>Davies, T. G., Tickle, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+screening+using+X-ray+crystallography.">Fragment screening using X-ray crystallography.</a> Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).</li><li>Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+of+fragment-based+lead+discovery+-+A+perspective+from+NMR.">Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR.</a> Molecules. 21 (7), 854 (2016).</li><li>Troelsen, N. S., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+design+strategies+to+accelerate+fragment-based+drug+discovery.">Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery.</a> Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).</li><li>Shi, Y., von Itzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+size+matters:+Diversity+for+fragment+library+design.">How size matters: Diversity for fragment library design.</a> Molecules. 24 (15), 2838 (2019).</li><li>Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+fragment-screening+library.">Design of a fragment-screening library.</a> Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).</li><li>Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+methods+for+identifying+fragment-based+inhibitors+of+protein-protein+interactions.">Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).</li><li>Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment-based+approach+to+drug+lead+discovery:+Overview+and+advances+in+various+techniques.">Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques.</a> Drugs in R &amp; D. 9 (4), 217-227 (2008).</li><li>Winter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+computational+fragment-based+approaches+to+targeting+protein-protein+interactions:+Applications+in+structure-guided+drug+discovery.">Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).</li><li>Boelens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNEXT:+a+European+facility+network+to+stimulate+translational+structural+biology.">iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology.</a> FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).</li><li>Zhang, R., Monsma, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+thermal+shift+assays.">Fluorescence-based thermal shift assays.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).</li><li>Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+purification+and+characterization+using+Thermofluor+screens.">Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens.</a> Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay:+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies.">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+stabilize+protein:+stability+screens+for+thermal+shift+assays+and+nano+differential+scanning+fluorimetry+in+the+Virus-X+Project.">How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666 (2019).</li></ol>

Раскрытия информации нет.

Этот протокол описывает метод средней и высокой пропускной способности для скрининга библиотек фрагментов с использованием некоторых распространенных робототехнических и измерительных приборов. Экраны, подобные описанным в этом протоколе, могут регулярно выполняться NKI Protein Facility в Амстердаме, например, в качестве службы iNEXT-Discovery, часто даже бесплатно для пользователей после подачи заявки и экспертной оценки. В таких случаях библиотека DSi-Poised может быть предоставлена средством, но использование других библиотек также может обсуждаться в контексте каждого отдельного пользовательского приложения и соглашения об обслуживании. Выбор инструментов в этом протоколе представляет собой практические решения для многих лабораторий, но не должен рассматриваться как золотой стандарт. Для измерения термической стабильности белка-мишени для скрининга фрагментов рекомендуются методы без маркировки, а не методы, использующие экологически чувствительные этикетки для обнаружения разворачивания в термоциклере полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Методы без этикеток, такие как представленный здесь с использованием инструмента «Прометей», имеют некоторые преимущества: они используют низкое количество белка, часто на пару порядков меньше; они могут использоваться для одновременного измерения рассеяния образца и, таким образом, агрегации; и метки, используемые для обнаружения разворачивания в других подходах, могут по-разному взаимодействовать с каждым фрагментом, что приводит к артефактам измерения. Этот протокол был описан в контексте робота Mosquito, который позволяет пипетку очень маленького объема образца (0,3 мкл), что невозможно сделать вручную. Комар — популярный робот, присутствующий во многих лабораториях, работающих над проектами по структурной биологии и открытию лекарств; однако в протоколе могут быть четко предусмотрены альтернативные подходы к малообъемной пипетче.
Библиотеки фрагментов содержат соединения, растворенные в ДМСО. Одной из первоначальных задач является поиск оптимальной концентрации ДМСО, при которой белок остается стабильным, а соединения остаются растворимыми. Это включает в себя выполнение измерений при различных концентрациях DMSO для определения оптимальных условий для скрининга. Используемое здесь разбавление белка в фрагмент приводит к концентрации ДМСО 0,2%; большинство белков достаточно стабильны в этих условиях. Количество белка, необходимое для проведения скрининга для библиотеки 768 соединений, составляет ~ 2-3 мг в общей сложности, так как измерения обычно проводятся при низких концентрациях белка (0,2 мг мл-1). Работа с такими относительно низкими концентрациями белка не только снижает затраты на производство белка, но и снижает шансы осаждения белка. Низкая концентрация белка не влияет на обнаружение связывания фрагментов, так как концентрация фрагментов в эксперименте составляет ~2 мМ, что позволяет идентифицировать и слабые связующие.
Поскольку обнаружение перехода плавления в этих экспериментах основано на интенсивности флуоресценции, критическим аспектом является определение мощности возбуждения лазера, при которой необходимо проводить измерения. Взаимодействие соединений с белком может (i) не влиять на его внутреннюю флуоресценцию, (ii) приводить к гашению или (iii) увеличивать его внутреннюю флуоресценцию. В дополнение к этому, работа с низкими концентрациями белка означает, что количество флуоресценций для нативного белка будет низким. Поэтому мощность возбуждения должна быть отрегулирована таким образом, чтобы можно было измерить большинство образцов. Профиль рассеяния каждого прогока предоставляет важную информацию об эффектах агрегирования, которые могут быть вызваны добавлением любого фрагмента. Кроме того, влияние температуры на растворимость соединения также можно увидеть на профиле рассеяния.
Неожиданно для многих соединений было замечено, что рассеяние фактически уменьшалось с повышением температуры(рисунок 6). Поэтому важно смотреть как на кривую перехода плавления, так и на сопутствующий профиль рассеяния, чтобы принять решение о надежности каждого эксперимента, особенно для тех фрагментов, которые считаются кандидатами на более требовательные измерения с помощью рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии или даже рассматриваются как хиты для последующей химии. Одним из специфических ограничений метода для целей скрининга фрагментов является то, что многие фрагменты в библиотеке DSi-Poised имеют значительную внутреннюю флуоресценцию, иногда даже за пределами предела насыщения детектора, и поэтому они не могут быть должным образом экранированы для связывания мишеней даже при низкой мощности возбуждения. Еще один момент, который следует отметить для этого метода, заключается в том, что он может использоваться только с белками, содержащими остатки триптофана.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11.jpg"> Рисунок 6:Влияние температуры на растворимость соединения. Кривая перехода плавления и профиль рассеяния Hec1 с двумя различными соединениями. (А)Профиль рассеяния показывает, что для этого образца температура не зависит от растворимости. (B)Профиль рассеяния показывает, что растворимость этого образца увеличивается с повышением температуры. Поэтому кривая перехода плавления в этом случае ненадежна. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Открытым вопросом является то, что следует рассматривать как существенное изменениеТ-мне с математической точки зрения, а с практической точки зрения: какое изменениеТ-м важно рассматривать как показатель связывания лиганда с белком? В этих примерах сдвиги менее 1 °C наблюдаются для 74% фрагментов для связывания Hec1, 66% для Mps1 и 53% для Nsp5. Рассмотрение 1 °C как «значительного изменения» вряд ли даст удары, которые достойны дальнейшей химии. В обзорных графиках(рисунок 5)рассматривались бункеры сосдвигом 1, 2, 5 или более 5 градусов Т-м, как положительные, так и отрицательные. Это требует модификации в соответствии с каждым конкретным случаем, чтобы дать хороший обзор и позволить принимать обоснованные решения, определяя следующий шаг. Примечательно, что для некоторых белков наблюдалась как стабилизация, так и дестабилизация мишени в зависимости от рассматриваемых фрагментов. Оба события интересны, так как оба могут быть результатом связывания фрагментов, и оба могут привести к хорошей последующей молекуле для манипулирования поведением белка.
Остается последний вопрос, а именно: «Что определяет полезный хит?». На самом деле ответ зависит от конкретной ситуации. Например, для Hec1 все фрагменты, которые стабилизируют белок более чем на 2 градуса или дестабилизируют его более чем на 5, были переданы нашим сотрудникам-химикам, которые разработали новые молекулы на основе этих ударов. Для Nsp5, однако, наиболее дестабилизирующими ударами были сообщены нашим сотрудникам по ЯМР для подтверждения попаданий, полученных из nanoDSF, с помощью экспериментов ЯМР. Другими словами, результаты скрининга, полученные из этого протокола, должны анализироваться с осторожностью и в зависимости от контекста, принимая обоснованные решения на основе конкретного вопроса и окружающей методологии. В любом случае, метод, описанный здесь, является дополнительным подходом к существующим методологиям, таким как рентген и скрининг на основе ЯМР, которые могут быть направлены на подтверждение, приоритизации или предоставление новых идей для химических кампаний.
Дополнительная таблица S1: Список буферов, используемых для скрининга белков. Сокращения: HEPES = 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; DTT = дитиотрейтол; MOBS = 4-(N-морфолино)бутансульфоновая кислота. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Supp_Table_S1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица S2: Свойства пластины MRC 2-well для использования с роботом-нанодипенсером. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица S3: Свойства 96-скважинной V-донной пластины для использования с роботом-нанодипенсером. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S3.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица S4: Буфер, концентрация белка иТ-м белков, обсуждаемых в репрезентативных результатах. Сокращения: DTT = дитиотрейтол; Hec1 = высоко экспрессированный в раке белок 1; Mps1 = монополярная веретениная киназа 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-подобная протеаза. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S4.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительный файл 1: Обзор параметров-пример данных. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementaty_file_1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 2: значения Tm и ΔTm для 406 фрагментов - пример данных. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementary_file_2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Программы открытия лекарств часто начинаются с скрининга химических соединений на их способность взаимодействовать и / или изменять функцию мишеней лекарств, чаще всего белков. Так называемые «хиты», которые встречаются на таких экранах, закладывают основу для открытия новых лидов и кандидатов на разработку, а также для большинства новых лекарств, которые лицензизуются в наши дни. Таким образом, наличие высокопроизводительных методов необходимо для скрининга огромного количества доступных целей с огромным количеством различных соединений, чтобы быстро идентифицировать их тесную связывание или их способность модулировать определенную функцию цели. После того, как удары идентифицированы, наиболее перспективные комбинации попадания-цели выталкиваются в обширный конвейер разработки лекарств с использованием других, часто дорогостоящих и трудоемких технологий, чтобы понять «отношения структуры и активности» (SAR).
Подходы структурной биологии, такие как те, которые предлагаются финансируемыми ЕС программами доступа «Инфраструктура для ЯМР, ЭМ и рентгеновских лучей для трансляционных исследований» (iNEXT) и его нынешним преемником iNEXT-Discovery, часто используются для изучения взаимодействий многочисленных соединений в мельчайших деталях, улучшая при этом аффинность и фармакологические свойства первоначальных попаданий обычно несколькими раундами синтетической химии1. Свинцовые соединения, которые появляются в результате этих кампаний «от удара к ведущему», становятся кандидатами на развитие и входят в доклинические исследования. Хорошо разработанная методология молекулярного скрининга может быть примерно разделена на два подхода, а именно открытие свинца на основе лигандов (LBLD) и обнаружение свинца на основе фрагментов (FBLD). В кампаниях LBLD белковые рецепторы проверяются либо несколькими тысячами отобранных вручную лигандов (на основе структуры естественных лигандов или структуры мишени), либо многими десятками тысяч соединений в библиотеках лигандов, подобных лекарственным средствам, которые охватывают большую часть химического пространства.
Обычно соединения проверяют на их ингибируемую активность в анализе активности, обычно контролируя ферментативную функцию. Однако в кампаниях FBLD2,3,4,5некоторые сотни соединений, которые обычно меньше, чем лекарства (100-200 Дальтон), проверяются на их способность связывать мишень напрямую, без использования анализа активности. Это связывание может влиять на целевую активность и может быть измерено многими биофизическими методами, которые сообщают непосредственно о способности фрагментов связываться с мишенью, или структурными методами, такими как рентгеновская кристаллография6 и спектроскопия ядерного магнитного резонанса7,а в последнее время также криоэлектронная микроскопия. Когда фрагменты связываются в разных местах, которые близки друг к другу на белке, различные, обычно низкоаффинные связывающие фрагменты могут быть рационально объединены химически, чтобы создать небольшой набор отведений, которые могут быть изучены более подробно. Это часто приводит к более высоким аффинным, более мощным соединениям, и эта методология начала давать важные молекулы с клиническим потенциалом. Выбор «идеальной» библиотеки фрагментов, эффективно эксплуатирующих химические группы, был активной областью исследований в течение многих лет8,9,10.
В то время как первоначально акцент был сделан на охвате всего химического пространства, последующее внимание было сосредоточено на том, чтобы позволить последующему химическому сочетанию попаданий фрагментов производить соединения свинца. Такие исследования привели к так называемым «уравновешенным» библиотекам. Они содержат фрагменты, по крайней мере, с одной функциональной группой, которые позволяют быстро и дешево проводить последующую синтетическую химию для эффективного прогресса в изучении SAR. Одним из мероприятий, катализируемых iNEXT, было обновление уравновешенной библиотеки, разработанной исследователями в Консорциуме алмазных источников света и структурной геномики. Эти совместные усилия привели к библиотеке DSi-Poised11,которая также была проверена в iNEXT12. Позже эта библиотека была приведена в соответствие с наличием соединений в базе данных REAL Enamine Ltd., химической исследовательской организации и производителя больших коллекций строительных блоков и библиотек соединений для скрининга. DSi-Poised теперь доступен для покупки любому, но также доступен во многих партнерских лабораториях iNEXT-Discovery для поддерживаемых проектов по скринингу фрагментов.
Высококачественные технологии рентгеновской кристаллографии и структурной биологии ЯМР имеют свои преимущества и недостатки для FBLD. Оба требуют изолированных целевых образцов и дают атомарные детали с высоким разрешением, которые необходимы для FBLD. Однако кристаллы необходимы для рентгеновской кристаллографии, и фрагменты связываются с полостями в хорошо упорядоченных белковых областях, которые не участвуют в построении трехмерной кристаллической решетки. Раствор ЯМР часто дает различные удары от рентгеновской кристаллографии, так как он не подвержен влиянию кристаллической среды и хорошо обнаруживает связывание также в частично упорядоченных белковых областях. Однако, хотя эксперименты с ЯМР на основе лигандов относительно быстры, они по-прежнему требуют значительного количества времени и материала и обычно могут проводиться только для относительно небольших белковых мишеней или доменов. С целью приоритизации соединений для кристаллографических или ЯМР-экспериментов были использованы биофизические подходы13,14,15.
Поскольку последние приборы и вычислительные протоколы позволяют эффективно кристаллографический скрининг для FBLD путем определения структур и анализа ~ 1000 фрагментов очень эффективно, эта приоритизация стала менее важной в рентгеновских исследованиях. Однако для ЯМР по-прежнему желательно использовать более дешевые и быстрые эксперименты для приоритизации библиотечного скрининга и экономии времени приборов на оборудовании самого высокого уровня. В то же время использование комбинации принципиально разных технологий может обеспечить независимое подтверждение событий связывания или даже дополнительные попадания, которые не улавливаются при использовании только кристаллографии или метода ЯМР. Кристаллографические и ЯМР-методы требуют очень дорогого оборудования и часто могут быть выполнены только в специализированных внешних учреждениях с помощью местных, высококвалифицированных экспертов. Кроме того, правильный анализ результатов также требует высокой квалификации. В то время как такие программы, как iNEXT и iNEXT-Discovery, демократизируют доступ к таким объектам16,было признано, что дешевый, быстрый и высокопроизводительный скрининг FBLD другими методами может стимулировать программы скрининга лекарств в гораздо более широком круге лабораторий. Такие результаты затем могут быть использованы в качестве показаний для налаживания сотрудничества с химиками-медицинскими химиками и для приоритизации наиболее дорогих скрининговых экспериментов с наиболее перспективными соединениями, если ЯМР и кристаллография налагают ограничения на количество соединений, которые могут быть проверены.
TSA формирует быстрый, эффективный и относительно дешевый и доступный биофизический метод17, который может быть использован для скрининга FBLD. Он использовался в нескольких условиях, от помощи в поиске стабильных белковых условий для испытаний кристаллизации18до поиска соединений, которые связываются с конкретными мишенями в клетках19. TSA также использовались для измерения констант диссоциации для лигандов, связывающих белки-мишени, поскольку связывание лигандов часто приводит к изменениям термической стабильности. Во всех ТСА изменение температуры денатурации белка (его стабильности) измеряется как функция медленного повышения температуры. Эффективным способом отслеживания денатурации белка при нагревании является DSF или Thermofluor, который количественно определяет флуоресцентное гашение гидрофобного красителя (обычно Sypro Orange) при взаимодействии с открытыми гидрофобными областями белка, которые разворачиваются из-за повышения температуры.
Nano-DSF обычно относится к измерению термической стабильности белка при отсутствии внешних красителей. Одним из первых инструментов, которые предложили такую возможность, был OPTIM1000, который измеряет широкий спектр интенсивности света, а также рассеяние света образца. Эта машина позволяла одновременно измерять развертывание белка (обычно после флуоресценции триптофана) и агрегацию белка (поскольку образованные наночастицы приводят к увеличению рассеяния света при ~ 400 нм). Позже «Прометей» ввел использование обратного отражения для измерения агрегации и чувствительного обнаружения флуоресцентного сигнала, что позволило отсеять низкие концентрации белка с хорошей чувствительностью20. В следующем разделе описывается, как Prometheus использовался для демонстрации протокола скрининга фрагментов для обнаружения попаданий для различных белковых мишеней. Краткое введение об ожидаемом качестве и количестве белка сопровождается пошаговым протоколом подготовки, выполнения и анализа экспериментов по скринингу фрагментов. Результаты скрининга трех белков были показаны в качестве примера данных, полученных в рамках сотрудничества iNEXT-Discovery.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td>adhesive sealing film for protein plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>CORNING</td>
			<td></td>
			<td>adhesive sealing film for fragment plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSi poised library</td>
			<td>Enamine</td>
			<td></td>
			<td>Fragment library containing 768 compounds used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elisa Reagent Reservior</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15075</td>
			<td>Reagent reservior used for pipetting the protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner round (U) bottom plates</td>
			<td></td>
			<td>Cat. No.&#160;650201</td>
			<td>Fragments supplied in these plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito type X1</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>Part nr- 3019-0003</td>
			<td>Nanolitre dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 2-well crystallization plate</td>
			<td></td>
			<td>MRC96T-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ELISA Reagent Reservoirs</td>
			<td>Pierce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prometheus High Sensitivity capillaries</td>
			<td>Catalog PR-C006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prometheus NT.48 nanoDSF</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO)</td>
			<td>nanoDSF and light back scattering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prometheus Standard capillary type</td>
			<td>Catalog PR-C002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-1000</td>
			<td colspan="2">Thermoscientific</td>
			<td>Centrifuge for plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery

Анализы теплового сдвига (TSA) исследуют, как температура плавления (Tm)белка-мишени изменяется в ответ на изменения в его среде(например,буферный состав). Полезность TSA, и в частности нано-дифференциальной сканирующей флуориметрии (nano-DSF), была установлена на протяжении многих лет, как для поиска условий, которые помогают стабилизировать конкретный белок, так и для просмотра связывания лигандов путем мониторинга изменений в кажущемся Tm. В данной работе представлен эффективный скрининг библиотеки фрагментов Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 соединений) с использованием нано-DSF, мониторинга Tm для идентификации потенциального связывания фрагментов. Предпосылки в отношении качества и концентрации белка для проведения экспериментов с нано-DSF кратко изложены, за которым следует пошаговый протокол, который использует нанолитровой роботизированный дозатор, обычно используемый в лабораториях структурной биологии для подготовки необходимых образцов в 96-скважинных пластинах. Протокол описывает, как смеси реагентов переносятся в капилляры, необходимые для измерений нано-DSF. Кроме того, в данной работе представлены протоколы измерения тепловой денатурации (мониторинг внутренней флуоресценции триптофана) и агрегации (мониторинг обратного рассеяния света) и последующие этапы передачи и анализа данных. Наконец, обсуждаются скрининговые эксперименты с тремя различными белковыми мишенями, чтобы проиллюстрировать использование этой процедуры в контексте кампаний по обнаружению свинца. Общий принцип описанного способа может быть легко перенесен в другие библиотеки фрагментов или адаптирован к другим инструментам.

Полный экран библиотеки DSi-Poised (768 фрагментов) был выполнен на трех белках, представляющих медицинский интерес, а именно на внешней кинетохоре, высоко экспрессированной в раке 1 белка (Hec1 или Ndc80), регуляторном тетрарикопептидном повторе (TPR) монополярной веретениновой киназы 1 (Mps1) и SARS-CoV-2 3C-подобной протеазе Nsp5, которая расщепляет C-концерн реплики полипротеина на 11 участках. Буферные условия, выбранные для каждого белка, а также концентрация белка и Tm белков приведены в дополнительной таблице S4.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig5v12.jpg"> Рисунок 5:Частотное распределение сдвига температуры плавления (ΔTm)для трех белков, Hec1, Mps1 и Nsp5, представленных в этом исследовании в качестве репрезентативных результатов. Сокращения: Hec1 = высоко экспрессированный в Раке 1 белок; Mps1 = монополярная веретениная киназа 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-подобная протеаза. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig5v11large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Результаты трех скринингов с использованием протокола, описанного выше, отображаемые в виде частотного распределения изменения Tm по отношению к числу фрагментов, показаны на рисунке 5. Эти графики были сгенерированы, как описано в разделе 5.3 протокола, в которых строится графика частоты наблюдаемого изменения Tm. Значение сдвига должно быть определено субъективным образом для каждого другого проекта, как описано в разделе обсуждения ниже. Отрицательные значения указывают на снижение температуры плавления в присутствии фрагмента, положительное значение – на увеличениеТм. м. Из таких сюжетов нетрудно заметить, что для Nsp5 все фрагменты оказывают дестабилизирующее действие, тогда как для Hec1 и Mps1 наблюдаются как стабилизирующие, так и дестабилизирующие удары. Этого можно ожидать и будет обсуждаться.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery at JoVE.com

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Мониторинг изменений температуры плавления белка-мишени(т.е.анализ теплового сдвига, TSA) является эффективным методом скрининга библиотек фрагментов из нескольких сотен соединений. Мы представляем протокол TSA, реализующий нанодиаппаратную сканирующую флуориметрию с помощью робототехники (nano-DSF) для мониторинга внутренней флуоресценции триптофана и обратного рассеяния света для скрининга фрагментов.

Нанодиафродная сканирующая флуориметрия для скрининга при обнаружении свинца на основе фрагментов

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Этот протокол полезен для кампаний по обнаружению лидов с фрагментированной базой в качестве дополнительного инструмента для выбора перспективных фрагментов в качестве кандидатов на тепло. Nano DSO для скрининга фрагментов использует ограниченное количество немаркированного образца белка и может обычно использоваться почти для всех белковых мишеней. Этот метод можно использовать для скрининга любых коллекций лигандов.или для проверки нагрева другими методами. Вынимайте фрагментную пластину из морозильной камеры минус 20 или минус 80 градусов цельсия и дайте ей оттаять при комнатной температуре с легким встряхиванием на шейкере. Центрифугирование пластины в 500 раз G в течение 30 секунд для сбора любых капель, прилипающих к боковой части колодцев.Возьмите кристаллизующие пластины MRC с 2 лунками и пипетку 15 микролитров белкового раствора в каждую подлунку с помощью многоканальной пипетки. Чтобы проверить определения фрагментов и белковых пластин на Mosquito, включите нанодиспенсер и убедитесь, что вокруг движущихся компонентов нет препятствий. Откройте графический интерфейс пользователя, перейдите на вкладку Setup и в разделе Deck Configuration проверьте, присутствует ли уже в списке доступных пластин тип пластины, в которую поставляются соединения, и та, в которую переносится белок.Если нет, щелкните Параметры, а затем Пластины и создайте новое определение пластины, заполнив правильные значения для типа свойства. На вкладке Настройка укажите положение пластин в разделе Конфигурация палубы. Используя раскрывающееся меню, выберите нижнюю панель Grainier U для первой позиции и пластину MRC 2-well для второй позиции и сохраните протокол.Поместите фрагментную пластину в положение один, а белковую пластину во вторую позицию палубы. На вкладке протокола нажмите Файл и выберите протокол, сохраненный на предыдущем шаге для раздачи фрагментов. Определите объем дозируемых фрагментов как 0,3 микролитра.Для типичной пластины, где столбцы первый и 12 не содержат фрагментов, определите начальное расположение для второго столбца и конечное расположение для столбца 11. В некоторых табличках, если столбцы два или 11 пусты, используйте столбцы три и 10 в качестве начального и конечного значений. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы запустить программу.После дозирования, которое занимает около двух минут, удалите белковые и фрагментные пластины из робота и запечатайте их клейкой герметизной пленкой. Кратковременно центрифугируют белковую пластину в 500 раз G в течение 30 секунд, чтобы собрать любую каплю, прилипшую к сторонам скважин, прежде чем перейти к следующему шагу. Визуально осмотрите колодцы белковой пластины на предмет осадков, которые могли произойти из-за добавления фрагментов.Если осадки наблюдаются во многих скважинах, уменьшите концентрацию осколков и повторите эксперимент. Включите инструмент «Прометей». На сенсорном экране нажмите Открыть ящик для доступа к капиллярной загрузочной модулю прибора.Снимите магнитную полосу с загрузочного модуля и очистите зеркало этанолом, чтобы удалить частицы пыли. Чтобы перенести раствор с пластины фрагментов белка на капилляры, поместите белковую пластину и капилляры рядом с инструментом для легкого доступа к капиллярному загрузочному модулю. Возьмите один капилляр, удерживая его на одном конце, и коснитесь раствора в белковой пластине другим концом капилляра, чтобы перенести образец.Всегда надевайте перчатки и следите за тем, чтобы не касаться капилляра посередине, так как примеси из перчаток повлияют на измерение. Поместите капилляр в назначенное положение держателя, убедившись, что он правильно выровнен и центрирован, повторите эти шаги, чтобы заполнить все позиции в загрузочном модуле. В конце поместите магнитную полосу поверх капилляров, чтобы удержать их на месте, и нажмите Close Drawer, чтобы начать эксперимент Nano-DSF.Откройте приложение Prometheus PR. ThermControl и создайте новый проект, щелкнув Начать новый сеанс. Во-первых, сделайте сканирование обнаружения, чтобы обнаружить флуоресценцию образцов. Измените флуоресцентный сигнал образцов, регулируя мощность возбуждения лазера.Для термической денатурации нажмите на вкладку Melting Scan, установите начальную температуру на 20 градусов Цельсия, конечную температуру на 95 градусов Цельсия и температурный наклон на один градус Цельсия в минуту. Затем нажмите «Начать измерение». Здесь показано частотное распределение сдвига и температуры плавления для наружного, кинетического или высоко экспрессированного при раке одного белка, регуляторного тетратрикоптидного повторного домена монополярной веретениновой киназы 1 и SARS-CoV-2 3c-подобной протеазы.Отрицательные значения указывают на снижение температуры плавления в присутствии фрагмента, в то время как положительное значение указывает на повышение температуры плавления. Для Nsp5 все фрагменты оказывают дестабилизирующее действие, тогда как для Hec1 и Mps1 наблюдаются как стабилизирующее, так и дестабилизирующее попадание. Это дешевый и быстрый метод проверки библиотек фрагментов.Другие методы, такие как ЯМР или рентгеновская кристаллография, могут показать точное связывание фрагментов, и они также доступны через открытие INX. Результаты с протеазой коронавируса помогли предложить новые соединения, которые могут быть разработаны в лекарства против COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

подготовки и<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование тестовое активность на основе для<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Кислота амидазные

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Микрокристаллизация кристаллов белков и<em&gt; Разное</em&gt; Дифракция

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Как для стабилизации белка: стабильность экраны для тепловых сдвиг анализов и Nano дифференциальная сканирующая флуориметрия в проекте вирус X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Мониторинг GPCR-я-arrestin1/2 Взаимодействия в режиме реального времени живых систем для ускорения обнаружения наркотиков

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...