نشكر مرفق علوم البروتين (PSF) في معهد كارولينسكا للتعبير وتنقية T7 RNA polymerase و E. coli RNase H ، مارتن هالبرغ على الهدية السخية للفوسفاتاز غير العضوي ، وبيتزولدلاب بأكمله للمناقشات القيمة. نشكر لوكا ريتاتينو على إعداد البنى U-bulge وإميلي شتاينر وكارولينا فونتانا لمساهمتهما في وحدات الماكرو والنصوص المناسبة. نعترف معهد كارولينسكا وقسم الكيمياء الحيوية الطبية والفيزياء الحيوية لدعم شراء 600 ميغاهرتز مطياف وتمويل الموقف (KI FoAss وKI 2-3707/2013). نحن ممتنون للمساهمة المالية من Vetenskapsrådet (#2014-4303) ، ستيفتلسن för استراتيجية فورسكنغ (ICA14-0023 و FFL15-0178) وراجنر سودربرغ ستيفتلسي (M91-14) ، هارالد أوش غريتا جانسون ستيفتليسي (JS 20140009)، كارل تريغرز ستيفتيلسي (CTS14-383 و 15-383)، إيفا أوش أوسكار أهرينس ستيفتيلسي، آكي ويبرغ ستيفتيلسي (467080968 وM14-0109)، سرطان فوندن (CAN 2015/388)، J.S. يعترف التمويل من خلال ماري Skłodowska - كوري IF (الاتحاد الأوروبي H2020 ، MSCA-IF المشروع رقم 747446).

ك. ب. هو مستشار لشركة Arrakis Therapeutics، وهي شركة تكتشف جزيئات صغيرة تستهدف الحمض النووي الريبي.

البروتوكول المعروض هنا هو توليفة من عدة بروتوكولات نشرت سابقا في شكل مقالات بحثية10،20،21،31. ومن ثم، يمكن تطبيق أجزاء من البروتوكول، في حين يمكن تبادل أجزاء أخرى لتفضيل القارئ. على سبيل المثال، يمكن إجراء قياسات R1ρ على عينة الحمض النووي الريبي المنتجة بأي طريقة، بالنظر إلى أن للطي وتجانس الطول يفترضان. وعلاوة على ذلك، لا يحتوي البروتوكول على معلومات حول تعيين الرنين من تسلسل الجيش الملكي النيبالي-خطوة المطلوبة لتجارب RD- كما تم تغطية هذا على نطاق واسع في الأدب السابق19،37،38. تعد مخططات وضع العلامات الجزئية أو الجزئية أو الخاصة بالموقع36أو41أو42أو43أو44 نهجا لتسهيل تعيين الرنين أو تقليل تداخل الرنين الذي يهم تجارب RD وتم وصفه مطولا في الأدبيات. تسمح هذه الطريقة باستخدام وضع علامات موحدة على أي هوية نيوكليوتيد ، والتي يمكن أن تبسط بالفعل مهمة الرنين بشكل كبير.
الأسلوب IVT المعروضة هنا يتغلب على المشكلات المعروفة مع تسلسل ووضع العلامات، ويزيد العائد، ويقلل من التكلفة ووقت العمل مقارنة مع أساليب أخرى. استخدام تسلسل بدء الفيروسية يقلل من الحاجة إلى تحسين رد الفعل، وهي مشكلة معروفة في هذا المجال التي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا لأداء وتسفر عن نسخ قليلة فقط من النص في حالة بدء غير G. يمكن إجراء T7 IVT وRNase H الانقسام من النص جنبا إلى جنب في وقت واحد في نفس السفينة. ويمكن رؤية نمط من تكرار الترادف متعددة الأرقام على هلام الصفحة الناح خلال رد الفعل، الذي يتجمع على نطاق واحد على الجيش الملكي النيبالي الهدف عند الانتهاء من رد فعل RNase H (الشكل 3A، الممرات 1 و 2b). الغلة النموذجية باستخدام هذه الطريقة تتراوح بين 30 و 70 RNA نانومول لكل 1 مل IVT. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على RNase H انشقاق يكرر جنبا إلى جنب لا يأتي من دون مشاكل معينة من تلقاء نفسها. رد فعل RNase H الانقسام في كثير من الأحيان لا يذهب إلى الانتهاء عند تشغيل في وقت واحد مع النسخ T7 (الشكل 3A، حارة 2a).
يمكن الانتهاء من فصل وحدات جنبا إلى جنب عن طريق تلي دليل الانقسام إلى النص وإضافة المزيد من RNase H (الشكل 3A، حارة 2b ، الخطوة 2.1.2). كما التدفئة من كميات كبيرة بطيئة ويؤدي إلى ملغ2 +-تحلل مائي الحفاز من الحمض النووي الريبي، تم استخدام فرن الميكروويف التقليدية، الذي يسخن العينة إلى >95 درجة مئوية في 10-15 ق. ولم تلاحظ حتى الآن آثار ضارة على العينات المنتجة. تظهر بعض البنى شريطا ثانيا بسيطا لا يمكن القضاء عليه من خلال تحسين ظروف التفاعل(الشكل 3A، حارة 4). عادة ما تكون هذه مرئية بشكل واضح إلى حد ما ككتف في الرسم اللوني HPLC ، إذا تم استخدام تدرج elution محسن بشكل جيد ، ويمكن إزالته (الخطوة 2.2.5). وتهدف المناقشة التالية إلى تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في البروتوكول، وتحديدا فيما يتعلق بالحصول على بيانات عالية الجودة تسمح بتفسير الديناميات التوافقية.
تلوث RNase RNases خارج الخلية هي في كل مكان، مستقرة للغاية، وتشكل أكبر تهديد للاستقرار على المدى الطويل من عينات NMR. لذلك ، من المهم العمل في بيئة خالية من RNase والحفاظ على جميع الكواشف والأدوات البلاستيكية خالية من RNase. ينصح باستخدام نصائح التصفية وربما حتى أقنعة الوجه. وهذا مهم على وجه التحديد بعد تنقية HPLC. وعادة ما تظهر عينات الرنين المغناطيسي الملوثة بالناس قمم ضيقة مرئية في أطيافH-1D بعد أيام أو أسابيع بسبب منتجات تدهور النيوكليوتيدات الأحادية. هذه العينة ليست مناسبة لقياسات R1ρ. 
عينة NMR نظرا لطبيعته المشحونة للغاية ، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي بتركيزات عالية دون هطول الأمطار بالمقارنة مع معظم البروتينات. استخدام أنابيب Shigemi NMR (انظر جدول المواد)مفيد لأنها تسمح بتوسيط العينة المركزة للغاية في وسط الملف مع الاستمرار في توفير ظروف الوميض والقفل المثالية بسبب القاع الزجاجي المطابق للحساسية والمغطاس. وبهذه الطريقة، يتم تقليل التجانس B1، مما يؤدي إلى خطوط أضيق. حجم العينة النموذجي في أنبوب NMR هو 250 ميكرولتر، والتركيز النموذجي هو 1-2 mM. لا ينصح العينات أقل من 500 ميكرومتر لتجارب RD كما التجربة سوف يستغرق وقتا طويلا وshim جيدة. وبالمثل، لا ينصح حجم العينة أقل من 200 ميكرولتر لأن هناك حاجة إلى شيم جيدة والاستقرار الميداني (قفل). عند إدخال المكبس ، من المهم تجنب تكوين فقاعات في العينة (الخطوة 2.4.5). إذا لم يتم إصلاحه بشكل صحيح، يمكن للمغطس الانزلاق لأسفل في العينة، مما يقلل من حجم الصوت القابل للكشف. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات السريعة في درجة الحرارة إلى تكوين فقاعات جديدة في العينة. لذلك، ينبغي توخي الحذر عند نقل العينة وعند تغيير درجة حرارة المسبار في مطياف NMR. تحقق من العينة بحثا عن فقاعات عند القياس مرة أخرى بعد فترة أطول.
RNA للطي يمكن أن توجد جزيئات الحمض النووي الريبي الديناميكي في تشكيلات متعددة عندما لا تكون مطوية بشكل صحيح. على الرغم من أن ذوبان درجات الحرارة في الهياكل الثانوية يمكن أن يكون فقط أعلى قليلا من درجة حرارة الغرفة، ينصح بإجراء التدفئة والتبريد الشامل قبل القياس. يمكن لعينات دبوس الشعر المركزة للغاية القابلة للطي تحت التحكم الحركي (التدفئة والتبريد المفاجئ) أن تشكل تجانسات بمرور الوقت ، مما يتطلب رقابة صارمة على طي الحمض النووي الريبي قبل كل قياس NMR. إذا كان الحمض النووي الريبي المقاس ليس بنية دبوس الشعر ولكن يجب تطبيق دوبلس الحمض النووي الريبي ، للطي البطيء تحت التحكم الديناميكي الحراري.
في هذه الحالة، يجب أن تكون عملية التبريد بعد التدفئة في نطاق ساعات، في حين يتم استخدام الحمض النووي الريبي في حجمه النهائي والتركيز في عينة NMR. يمكن أن يوفر العد الأولي للصدى المتوقع والإيمينو العطري نظرة ثاقبة حول تجانس العينة. إذا كانت العينة لا تبدو كما هو متوقع، يجب إعادة طيها. Mg2+ (يضاف ملح كلوريد) يمكن أن تساعد مع هياكل الحمض النووي الريبي للطي45. في الممارسة العملية، عنصر التحكم للطي بمثابة مقارنة لعينة التي تم استخدامها لتعيين على الأقل جزئيا الرنين NMR وحل الهيكل الثانوي تجريبيا.
تدور قفل السلطة واعتبارات التدفئة في حالة تشغيل تجارب RD 1H R1ρ كمجريات نظرة عامة على 2D ، يجب ألا تقل طاقة SL عن 1.2 كيلوهرتز. يجب وضع تردد مرسل الترددات الراديوية في منتصف منطقة جزء في المليون من قمم الاهتمام(على سبيل المثال،7.5 جزء في المليون للبروتونات العطرية). وعندئذ سيكون عرض النطاق الترددي البالغ 1.2 كيلوهرتز كبيرا بما يكفي لتدفير هذه البروتونات دون أي آثار رئيسية خارج الرنين. ويمكن تحديد هذه الآثار في ملف RD. إذا حدثت،R2+REX القيم زيادة بدلا من إنقاص مع زيادة قيم الطاقة SL، وخاصة بالنسبة للطاقة SL منخفضة. تحقق مما إذا كانت قيم الطاقة المحسوبة SL تتوافق مع الطاقة التي تم تسليمها إلى العينة. في الممارسة العملية، يمكن استخدام قوة SL المحسوبة إذا تم معايرة النبض الصلب 1H 90 درجة بعناية على مطيافات أحدث؛ ومع ذلك، يمكن التحقق من ذلك عن طريق معايرة طاقة SL لكل عرض النطاق الترددي المطلوب.
نطاق قوة SL، والتي يمكن استخدامها في 1H R1ρ RD التجارب واسعة جدا، مما يؤدي إلى تدفئة عينة متفاوتة (1.2 كيلوهرتز إلى 15 كيلوهرتز لHSQC لتسلسلات المستندة إلى HCP و 50 هرتز إلى 15 كيلوهرتز لتجارب SELOPE). يمكن الكشف عن عدم المساواة في تسخين العينة كتغير طفيف في التحول الكيميائي عند مقارنة 1Ds التي تم الحصول عليها لSLs الطاقة المنخفضة مقابل. SLs عالية الطاقة. عادة لا يتم النظر في هذا التأثير في التعويضات الحرارية في التجارب R1ρ على heteronuclei. عادة ما يتم إعداد تعويض الحرارة في تلك التجارب لتصحيح التدفئة المختلفة بسبب فترات قفل الدوران المختلفة المحددة في قائمة VD لكل سلسلة طاقة قفل الدوران. خاصة بالنسبة لتجربة SELOPE ، يجب استخدام تعويض حراري ثان عبر جميع نقاط القوة المطبقة في SL كما هو موضح في20.
اعتبارات قائمة vd كما ذكر سابقا، يجب أن تحتوي قائمة VD على نقطة زمنية طويلة بما يكفي للحصول على تسوس كبير للكثافة (من الناحية المثالية إلى 30٪ من الإشارة الأولية، أو أقل قدر ممكن إذا لم يكن من الممكن الوصول إلى اضمحلال بنسبة 70٪ ضمن مواصفات المسبار). على الرغم من أن قائمة VD تم تحسينها لطاقة SL منخفضة (1.2 كيلوهرتز)، إلا أنه يجب أيضا اختبار قائمة vd هذه بأعلى طاقة SL لاستخدامها(على سبيل المثال،15 كيلوهرتز). ويرجع ذلك إلى حقيقة, أن لقمة مع مساهمة كبيرة REX, وسوف يكون الاضمحلال أبطأ بكثير في قوة SL عالية. لذلك ينبغي أيضا التحقق من اضمحلال كافية في قوة SL عالية. وينبغي النظر في الشيء نفسه بالنسبة للاضمحلالات في الإزاحات العالية في التجارب خارج الرنين. يمكن أن تكون النقطة الزمنية القصوى المثالية لقائمة vd مختلفة بشكل كبير بالنسبة لمختلف مناطق تجربة التشتت. في هذه الحالة، يمكن إدراج المزيد من النقاط في قائمة vd، ويمكن التخلص من نقاط قائمة vd الأطول لقوة SL أعلى أو إزاحات أعلى أثناء التحليل، استنادا إلى انخفاض SINO الذي ستؤدي إليه. بشكل عام، ينبغي اعتبار نقاط قائمة VD 5-8 لتكون قادرة على اكتشاف القطع الأثرية المحتملة التي تؤدي إلى تسوس غير أسي مثل اقتران J (انظر أدناه).
1D-اعتبارات انتقائية HCP يجب توخي الحذر الخاص عند تشغيل الإصدار 1D القائم على HCP إذا كان هناك ذروة أخرى متداخلة مع ذروة الاهتمام بالبعد H 1من التجربة المستندة إلى HSQC 2D. التحويلات القائمة على HCP انتقائية للغاية ، ولكنها لا تكون انتقائية بنسبة 100٪ ، وبالتالي يمكن أن يحدث أن ذروة أخرى تساهم في كثافة وسلوك الاضمحلال في ذروة الاهتمام في 1D. ومن المؤشرات على ذلك الفرق في قيم R1ρ الرنين التي تم الحصول عليها باستخدام الإصدارات 1D و 2D من التجربة المسماة.
اعتبارات العائد على حقوق المساهمين: بالنسبة للمنحنيات خارج الرنين للذرات ذات التبادل البطيء الوسيط ، يمكن تحديد القطع الأثرية ROE استنادا إلى مقارنة Δω التي تم الحصول عليها مع طيف NOESY أو ROESY. إذا كان يمكن تحديد ذروة الصليب في الفرق التحول الكيميائي المقابلة لΔω، ثم حالة متحمس لوحظ قد يكون في الواقع قطعة أثرية ROE(على سبيل المثال، تم العثور على ROEs بين البروتونات العطرية ، والتي هي كلها في نفس نطاق التحول الكيميائي ، وبالتالي تغطيها تلك منحنيات خارج الرنين20). من التجربة ، وهذا يؤدي دائما أيضا إلى سوء يناسب أخطاء كبيرة ، وربما يرجع ذلك إلى العائد على حقوق المساهمين لا تتبع نفس النمط كما REX مع زيادة قوة SL. ويصبح الوضع أكثر صعوبة بالنسبة للتبادل المتوسط والسريع. في حين أن منحنى الرنين (من المقارنة مع 13بيانات C التي تم الحصول عليها على النواة المجاورة) لا يزال يمثل عملية التبادل بين GS و ES ، يتأثر منحنى الرنين من قبل العديد من القطع الأثرية العائد على الاستثمار.
في هذه الحالة، تكون قدرة SL على اكتشاف عملية التبادل أكبر (>1.5 كيلوهرتز) وبالتالي تمتد على عدد أكبر من البروتونات حيث تمتد المنحنيات خارج الرنين على الاختلافات في التحول الكيميائي لمختلف المرشحين ل ROE (بالنسبة ل H8 ستكون هذه: البروتونات الأمينية في كاليفورنيا. ±1000 هرتز، H5/H1 في ca. -1200 هرتز، البروتونات إيمينو في كاليفورنيا 3500 هرتز). وحتى الآن، لم يتم العثور على أي طريقة لقمع هذه القطع الأثرية العائد على الاستثمار (بخلاف استخدام النيوكليوتيدات46deuteed جزئيا)، وينبغي عدم تسجيل البيانات خارج الرنين لتبادل سريع الوسيطة، كما لا يمكن استخراج أي معلومات موثوقة عن Δω الفعلية مع هذه الطريقة، إذا NOE / العائد على حقوق المساهمة لا يمكن استبعادها عن طريق أطياف NOESY.
اعتبارات J-اقتران (هارتمان هان) على الرغم من أن المنحنيات على الرنين للبروتونات J-coupled النووية، مثل H6، تم تسجيلها بنجاح10،20، يجب توخي الحذر الخاص للقياسات خارج الرنين ، خاصة بالنسبة لقوة SL المنخفضة حيث يمكن أن تمتد ظروف مطابقة هارتمان هان على نطاق واسع من التعويضات التي تم التحقيق فيها. ويمكن تحديد القطع الأثرية هارتمان هان كما التذبذبات على الاضمحلال الأسي أوزيادة R2 +REX القيم مع زيادة نقاط القوة SL في المؤامرات RD على الرنين20.

RNAs أداء العديد منالتنظيمية 1،2الحفاز ، والهيكلية3 وظائف في الخلية ، وكثير منها ترتبط مرنة التركيب الجزيئي والتغيرات المعقدة لتلك الهياكل4،5،6،7. تبقى الدول ذات الكثافة السكانية المنخفضة غير مرئية لمعظم أساليب تحديد البنية أو لا تسمح بدراسة هذه الدول المخفية بدقة ذرية عالية. الحل الدولة النووية الرنين المغناطيسي (NMR) التحليل الطيفي يجمع بين كلا الجانبين من خلال توفير الوصول إلى النوى الذرية الفردية، فضلا عن تقديم مجموعة كبيرة من التجارب التي تستهدف ديناميات من خلال جميع النظم الزمنية8. توفر تجارب RD NMR إمكانية الوصول إلى التبادل التشكيلي في النطاق الزمني المتوسط ، حيث يمكن توقع التغييرات في أنماط الاقتران الأساسي وإعادة الترتيب الهيكلي المحلي5و9و10و11و12و13و14. يتم إجراء تجارب RD طالما R 2 القياسات في شكل قطار نبض كار بورسيل-ميبوم-جيل15 أو كقياسات الاسترخاء في الإطار الدورية, دعا R1ρ RD التجارب16.
على الرغم من أنه يمكن استخدام كليهما لاستخراج السكان من سعر الصرف والفرق التحول الكيميائي إلى الدولة الثانوية، R1ρ RD التجارب تعطي أيضا علامة على الفرق التحول الكيميائي للدولة متحمس. وهذا يسمح بالاستدلال على الهيكل الثانوي ، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا بالتحول الكيميائي في هياكل الحمض النووي الريبي17. التحول الكيميائي هو مؤشر جيد على الهلية في حالة البروتونات العطرية والكربونات على النيوكليوباس ، وشركاء الاقتران الأساسي للبروتونات إيمينو ، وتجعد السكر على ذرات C4 و C118،19. تجدر الإشارة إلى أن مؤخرا تبادل تبادل المواد الكيميائية التشبع نقل (CEST) تجربة باستخدام أعلى قفل الدوران (SL) السلطة، وبالتالي تحويل إمكانية تطبيق تجربة CEST لجداول زمنية أسرع تبادل، ونشرت كبديل لتجربة R1ρ RD لأنظمة مع حالة واحدة متحمس.
على الرغم من أن 13C و 15N النظائر غالبا ما تستخدم للوصول إلى التبادل الهيكلي, العمل الأخير من هذا المختبر تستخدم البروتونات العطرية وإيمينو كمسبارات لتبادل تشكيلي9,10. استخدام 1H كالنواة الملاحظة يجلب العديد من المزايا، على سبيل المثال، الوصول إلى التبادل على جداول زمنية أسرع وأبطأ، وحساسية أعلى، وأوقات قياس أقصر. ومما يسهل ذلك كذلك نهج تجربة البروتون الأمثل SELective (SELOPE) ، وتوفير الوصول إلى البروتونات العطرية من خلال تفكيك الطيف أحادي البعد (1D) باستخدام اقترانات زناوية متجانسة ، بدلا من نقل المغناطيسية غير النووية ، والقضاء على الحاجة إلى تسميات النظائر20. يتناول هذا البروتوكول القياس في تجارب RD 1 H R1ρ الموحدة 13C/15N-labeled والعينات غير المسماة. لذلك، تقدم هذه الورقة طريقة إعداد العينة التي تم العثور على أن تكون الأكثر تنوعا لإعداد عينة مختلفة يحتاج21 ويناقش البدائل في القسم الأخير من هذه المقالة (الشكل 1).
عند هذه النقطة، يجب على القارئ أن يلاحظ أن تقنيات إعداد العينات الأخرى مقبولة لتجارب 1 H R1ρ RD، وأنه يمكن إجراء طرق أخرى للتحليل الهيكلي والوظيفي مع العيناتالمركبة مع التقنية المقدمة. 1 H R1ρ RD التجارب تتطلب تركيزات الحمض النووي الريبي عالية (من الناحية المثالية >1 mM) ، فضلا عن التجانس عالية ، سواء في طول الجيش الملكي النيبالي والتطابق الهيكلي لضمان توصيف موثوق بها من الديناميات الجزيئية. في المختبر النسخ (IVT) هو الأسلوب المفضل لكثير من الباحثين لإنتاج 13C /15N-المسمى عينات الحمض النووي الريبي بسبب توافر الفوسفات ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد المسمى (NTPs) ودمج سهل في رد الفعل الأنزيمي22. ومع ذلك، فإن البوليمرات T7 RNA المستخدمة على نطاق واسع (T7RNAP)23،24،25 يعاني من انخفاض 5 'التجانس في حالة بعض تسلسل بدء26،27 وغالبا أيضا 3 'التجانس أثناء الجريان السطحي النسخ28. تنقية الأنواع المستهدفة RNA يصبح أكثر تكلفة وشاقة بسبب الحاجة إلى كميات كبيرة من ~ 200 نانومول. وقد عرضت الطريقة المستخدمة هنا سابقا حيث نوقشت مزايا في21كبيرة. باختصار ، فإنه يحل القضايا الموصوفة عن طريق نسخ نسخة أكبر جنبا إلى جنب التي يتم بعد ذلك موقع محدد مشقوق من قبل Escherichia coli RNase H ، مسترشدة أوليغونوكليوتيد29،30 (انظر الشكل 2 للحصول على تفاصيل).
إدراج تسلسل فاصل في نهايات 5 'و 3' من نص جنبا إلى جنب يسمح باستخدام تسلسل بدء عالية الغلة وإزالة يتدلى محطة قريبة من موقع الخطية من قالب البلازميد، على التوالي (الشكل 2B). وقد ثبت أن هذه الطريقة لتحسين الغلة بشكل كبير، مع خفض التكلفة والعمالة، مع التحذير من توليف قالب أكثر تعقيدا والحاجة إلى إنزيم إضافي وoligonucleotide. خصوصية عالية من شق RNase H يسهل تنقية بسبب عدم وجود أنواع الحمض النووي الريبي في نطاق حجم مماثل. يستخدم هذا البروتوكول تبادل الأيونات عالية الأداء السائل الكروماتوغرافيا (HPLC) الخطوة التي تم نشرها من قبل هذا المختبر مؤخرا31، على الرغم من أن أساليب أخرى هي بدائل ممكنة. 1 H R1ρ RD يمكن, بشكل عام, يمكن الحصول عليها على عينات المسمى أو غير المسمى مع اثنين من تسلسل النبض كل منهما, "المسمى" 1H R1ρ ارتباط الكم واحد heteronuclear (HSQC) القائم على تجربة مع البعد غير المباشر 13C10 و "غيرالمسمى" 1H R1ρ SELOPE القائم على تجربة مع البعد غير المباشر 1H20.
يمكن أن تكون هذه التجارب ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) بمثابة فحص أول ، بغض النظر عما إذا كانت الديناميكيات على مقياس الوقت R1ρ موجودة في العينة. ويمكن الحصول على لمحة عامة عن RD لجميع القمم التي تم حلها في الأطياف ، ويمكن تحديد قمم الاهتمام لتحليل RD أكثر شمولا. وهذا يعني أنه حتى العينات غير المسماة يمكن فحصها قبل اتخاذ قرار بإنتاج عينة أكثر تكلفة وعلامة. بمجرد اختيار ذروة مساهمة التبادل التوافقي ليتم دراستها بشكل أكثر شمولا ، فمن الأفضل التحول إلى الإصدارات 1D من التجارب المذكورة أعلاه (إذا كان لا يزال من الممكن حل الذروة) لإجراء ما يسمى بتجارب الرنين. للإصدار المسمى، يتم استبدال نقل HSQC إلى 13C بخطوة انتقائية عبر الاستقطاب غير النووي (HCP) كما هو مستخدم في 13C R1ρ التجارب32،33،34،35، بينما في حالة تجربة SELOPE ، يتم تشغيل التجربة ببساطة ك 1D ، وهو مفيد بشكل خاص لإشارات H8 و H2 التي تكذب على قطري في 2D على أي حال. وأحد المعايير التي يمكن استخدام التسلسل فيها، شريطة توافر عينة تحمل علامات أو عينات غير محددة، هو مدى عزل ذروة الاهتمام في التجربتين.
بشكل عام ، يوصى بتجربة SELOPE لعينات الحمض النووي الريبي التي تصل إلى 50 نيوكليوتيدات. وبالنسبة لرناس أكبر، سيكون التداخل أكبر؛ ومع ذلك، فإن النيوكليوتيدات المثيرة للاهتمام هيكليا غالبا ما تظهر في مناطق التحول الكيميائي التي هي أقل تداخلا ولا يزال من الممكن الوصول إليها في الرنانات الأكبر. وثمة حجة أخرى هي أنه في العينات غير الم عنها، لا يحدث اقتران J بين 1H و 12C. ومع ذلك ، كما يتم تعريف الحد الأدنى من قوة قفل الدوران من خلال الحد الأدنى من الطاقة المستخدمة لفصل هاتين الدورانتين (~ 1 كيلوهرتز) في التجربة المسماة ، تسمح التجربة غير المسماة باستخدام نطاق أوسع من نقاط قوة قفل الدوران (SL) وبالتالي الوصول إلى مقياس زمني أوسع للتبادل. هذه التجارب خارج الرنين توفير معلومات إضافية إلى كالسابقين، مثل السكان من الدولة متحمس (بديل conformer) ، عES، فضلا عن معلومات قيمة جدا التحول الكيميائي في شكل Δω (الفرق التحول الكيميائي للدولة الأرض والدولة متحمس).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> الشكل 1: سير العمل للبروتوكول المقدم. التحضير قبل الإنتاج الفعلي على نطاق واسع عينة، وتتكون من إعداد القالب وتأكيد النسخ في المختبر الناجحة وانشقاق RNase H. إنتاج واسع النطاق بما في ذلك تنقية HPLC، وملء أنبوب NMR، وتأكيد للطي الحمض النووي الريبي. وفي حالة التوليف المسمى بالنظائر، ينبغي إجراء تنقية غير المسماة لتحسين التدرج في نفس اليوم. وصف NMR للديناميكيات التوافقية مع تجارب R1ρ. يمكن تنفيذ كل خطوة بشكل مستقل، على سبيل المثال،يمكن تطبيق تحليل RD 1 H R1ρ على أي عينة RNA مناسبة تنتج بطريقة أخرى. المختصرات: IVT = في النسخ المختبري؛ HPLC = الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء؛ NMR = الرنين المغناطيسي النووي. RD = تشتت الاسترخاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الهدف من هذا البروتوكول هو توفير تفاصيل عملية ومعلمات حاسمة لدراسة ديناميات تشكيلية مع 1H R1ρ تشتت الاسترخاء في جزيئات دبوس الشعر RNA. بعد تقديم بروتوكول مفصل للتصميم، والتوليف، وتبادل أيونات HPLC تنقية RNA الهدف التي يمكن تنفيذها باستخدام جميع، بعض، أو لا شيء NTPs كما 13C/15N-المسمى الإصدارات، وقد وصفت سير العمل لوضع اللمسات الأخيرة على عينة NMR وتأكيد تبادل المطابقة مع التحليل الطيفي NMR. وأخيرا، يتم وصف تفاصيل الإعداد من 1H R1ρ RD التجارب على مطياف بروكر NMR(الشكل 1). البروتوكول يعطي كل خطوة لإعداد الإصدار 1D لعينات المسمى وتعليقات إضافية وجدول لضبط لإعداد إصدار SELOPE (الجدول 2). بعد البروتوكول، تتم مناقشة الخطوات الهامة والطرق البديلة لإعداد العينة وإعداد 1 H R1ρ RD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA هو جزيء حيوي مرن للغاية ، حيث تلعب التغييرات في الهياكل أدوارا حاسمة في الوظائف التي تنفذها جزيئات الحمض النووي الريبي كرسل ومغيرات خلوية. في حين أن هذه الدول الديناميكية لا تزال مخفية لمعظم الأساليب الهيكلية، R1ρ التشتت الاسترخاء (RD) الطيف يسمح لدراسة ديناميات تشكيلية في النظام الصغرى إلى مللي ثانية في القرار الذري. استخدام 1H كالنواة الملاحظة يزيد من توسيع نظام الوقت المشمول ويعطي الوصول المباشر إلى روابط الهيدروجين والاقتران الأساسي.
الخطوات الصعبة في مثل هذه الدراسة هي إعداد عينات عالية النقاء وعالية الغلة ، يحتمل أن تكون 13C - و 15N - المسمى ، فضلا عن إعداد التجارب وتركيب البيانات لاستخراج السكان ، سعر الصرف ، والهيكل الثانوي للدولة غير مرئية سابقا. يوفر هذا البروتوكول خطوات عملية حاسمة في إعداد العينات لضمان إعداد عينة RNA مناسبة وإعداد تجارب 1H R1ρ مع كل من عينات الحمض النووي الريبي المسماة بالنظائر وغير المسماة.

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

نقدم بروتوكول لقياس ديناميات الصغرى إلى مللي ثانية على 13C /15N المسمى وغير المسمى الجيش الملكي النيبالي مع 1H R1ρ الاسترخاء تشتت الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفية. ينصب تركيز هذا البروتوكول على إعداد عينات عالية النقاء وإعداد تجارب NMR.

الجوانب العملية لإعداد عينة والإعداد من 1H R1ρ تجارب التشتت الاسترخاء من الجيش الملكي النيبالي

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

يصف هذا البروتوكول إعداد عينة الحمض النووي الريبي وإعداد NMR لقياسات تشتت الاسترخاء البروتون R1rho لفحص التبادل التأكيدي في جزيئات الحمض النووي الريبي. وبما أن البروتونات يتم فحصها، فإن الطريقة لا تحتاج إلى وضع علامات نظائرية ويمكنها الوصول إلى الميزات الهيكلية مثل الاقتران الأساسي المتحول مباشرة. المصصة هو وحدات تماما بمعنى أن R1rho الاسترخاء التشتت يمكن قياسها حتى لو تم إنتاج العينة مع طريقة مختلفة.ابدأ بإعداد عينة البلازميد وإعداد نسخة في المختبر ورد فعل الانقسام كما هو موضح في مخطوطة النص. احتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم تمييع ميكرولتر واحد من العينة عشرة أضعاف في تحميل الحل.وتشغيل ميكرولتر واحد على هلام الصفحة denaturing. إذا كان رد فعل الانقسام ناجحا، قم بتحجيم التفاعل مع الحجم المطلوب وتشغيله بين عشية وضحاها. ثم تشغيل هلام الصفحة آخر denaturing وتقييم ما إذا كان قد تم الانتهاء من رد فعل الانقسام.في حالة عدم اكتمال الانقسام، سخني محلول التفاعل في ميكروويف تقليدي عند 450 واط لمدة 15 ثانية. ثم يبرد الحل ببطء إلى 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لإعادة توجيه الحمض النووي الريبي ودليل الانقسام. ولاحظ تشكيل عجلة جديدة.إضافة المزيد من البيروفيوسفاتاز غير العضوية وRNase H.Incubate رد الفعل لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. ثم تأكد من الانتهاء من رد فعل الانقسام مع إزالة النبج الصفحة. عند اكتمال رد فعل الانقسام RNase H، إخماد رد الفعل عن طريق إضافة EDTA إلى تركيز نهائي 50 ملليمولار.ودوامة تماما. تصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون. وتركيز الحل لحجم حقنها في نظام HPLC لتنقية.قبل إضافة عينة مركزة ومنقى إلى أنبوب NMR، تنظيف الأنبوب عن طريق التنظيف مع وفرة المياه. ثم RNase إزالة التلوث الكاشف، والمياه، و 95٪ الإيثانول. بعد الشطف النهائي بالماء، اتركيه لتجف.شطف المكبس بالماء واستخدام مسح خالية من الوبر لتنظيف مع كاشف إزالة التلوث RNase و 95٪ الإيثانول. بعد تجفيف الأنبوب والمغطاس، أضف 10٪ D2O إلى عينة NMR. استخدام تلميح ماصة كبيرة لنقل عينة الحمض النووي الريبي في أنبوب NMR، تتدفق على طول الجانب من جدار أنبوب.أدخل المكبس في الأنبوب عن طريق دفعه لأسفل مع حركة التواء سريعة لإزالة فقاعات الهواء ، ثم سحب المكبس ببطء دون إنشاء فقاعات هواء جديدة. وإصلاحه مع فيلم شمع البارافين. إنشاء مجموعة بيانات جديدة على أساس مجموعة بيانات الكربون البروتون العطرية HSQC المستخدمة على عينات الحمض النووي الريبي المسمى بالكامل لتخصيص الحمض النووي الريبي.تعيين المعلمات العامة والمعلمات الخاصة RD. ثم تعيين البروتون تدور قفل السلطة إلى 1.2 كيلوهرتز للاختبار. إنشاء قائمة vd اختبار مع إدخال واحد فقط، صفر ميلي ثانية، تعيين TDF1 إلى واحد، وتحديث D30 لتشغيل طيف اختبار.بعد إعداد قائمة VD اختبار تحديث D30 و TDF1. ورسم كثافة الذروة لأطوال قفل تدور مختلفة. تحديد طول قفل الدوران الذي تنخفض فيه كثافة الذروة الأصلية إلى الثلث.من نتيجة تشغيل الاختبار، قم بإنشاء قائمة vd النهائية لاستخدامها في التجربة. حدد عدد عمليات المسح الضوئي بحيث يكون لأضعف قمة في القائمة نسبة إشارة إلى ضوضاء لا تقل عن 10. تظهر هنا نتائج العديد من ردود الفعل الانقسامية للنصوص المترادف.تم إنشاء 20 النيوكليوتيدات الهدف الجيش الملكي النيبالي في رد فعل ناجح. وأسفرت ردود الفعل غير الناجحة عن انشقاق غير كامل ومفشل للعينة. كشفت حقن HPLC من عينة الحمض النووي الريبي ذروة للجيش الملكي النيبالي الهدف النقي في 38 دقيقة.في حين تم فصل المنتجات الأطول والأقصر بشكل جيد عن ذروة الاهتمام. أظهر تحليل دبوس شعر الحمض النووي الريبي أن عدد بروتونات إيمينو الملاحظة يطابق عدد بروتونات إيمينو المتوقعة من محاكاة البنية الثانوية. أظهر طيف الكربون البروتون HSQC من الرنين العطري للجيش الملكي النيبالي أربع إشارات بعد طيه.وثلاث إشارات فقط قبل طيها. في ممثل على منحنيات الرنين التي تم الحصول عليها لاثنين من ذرات H8 مختلفة واثنين من دبابيس الشعر الحمض النووي الريبي الاصطناعية المختلفة، والخبرات G6H8 تبادل تأكيدي. في حين أن A4H8 لا.بالنسبة إلى G6H8، تم اختيار قوى قفل الدوران الملونة وتسجيل بيانات الرنين. في بناء CG حيث التبادل بطيء، قيم الصف R1rho مقابل مؤامرة تعويض عرض بالفعل عدم تماثل طفيف من المنحنى، مما يدل على علامة على الفرق التحول الكيميائي دلتا أوميغا. هذا يصبح أكثر وضوحا في R2 بالإضافة إلى مؤامرة ريكس حيث تتم إزالة مساهمة R1.من ناحية أخرى ، فإن بناء GC الخبرات أسرع تبادل وقيم R1rho مقابل مؤامرة تعويض قدم منحنى أوسع حيث استخراج أوميغا دلتا يصبح أقل وضوحا حتى في مؤامرة R2 زائد ريكس. وبمجرد توضيح ديناميكيات الحمض النووي الريبي، يمكن وصف الولايات ومحاصرتها. ويمكن، على سبيل المثال، اختبار هذه الدول المحاصرة في المقايسات البيولوجية.هذه الطريقة تسمح لنا لمراقبة وظيفية، والتحولات الاقتران قاعدة ذات الصلة في مجمع ميرنا ميكرورنا النشطة، وإعادة ترتيب حلقة في الحمض النووي الريبي ريبوسومال، والاستقرار زوج قاعدة من على انتفاخات النيوكليوتيدات واحد.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

إعداد العينة والكمية النسبية باستخدام الميثيل الاختزالي للأمينات لدراسات علم البيبتي

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

إعداد العينة باستخدام طريقة أحادية الطبقة الدهون للدراسات البلورية الإلكترون

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لاكتشاف وتوصيف الارتباطات الذاتية للبروتينات المضطربة جوهريا

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...