我们感谢卡罗林斯卡研究所的蛋白质科学设施（PSF）对T7 RNA聚合酶和 大肠杆菌 RNase H的表达和纯化，马丁·赫尔伯格对无机磷酸盐的慷慨馈赠，以及整个佩佐德实验室的宝贵讨论。我们感谢卢卡·雷塔蒂诺为U-凸起结构和埃米莉·施泰纳和卡罗来纳·丰塔纳对宏和合适的脚本的贡献。我们感谢卡罗林斯卡研究所和医学生物化学和生物物理学部支持购买600兆赫光谱仪和头寸融资（KI FoAss 和 KID 2-3707/2013）。我们感谢维滕斯卡普斯特雷德（#2014-4303）、斯蒂夫特尔森·费尔·斯特拉特吉斯克·福斯克宁（ICA14-0023和FFL15-0178）和拉格纳尔·塞德伯格·斯蒂夫特尔塞（M91-14）、哈拉尔德·奥赫·格雷塔·让森·斯蒂夫特尔塞（JS20140009），卡尔·特里格斯扼杀（CTS14-383和15-383），伊娃·奥克·奥斯卡·阿伦斯·斯蒂夫特尔塞，艾克·维伯格·斯蒂夫特尔塞（467080968和M14-0109），巨蟹座（CAN 2015/388），J.S. 承认通过玛丽·斯考多夫斯卡-居里IF（欧盟H2020， MSCA-IF项目号747446）。

K.P. 是阿拉基斯治疗公司的顾问，该公司发现针对RNA的小分子。

本文提出的协议是以前以研究文章10、20、21、31的形式发表的若干协议的综合。因此，可以应用协议的片段，而其他部分可以交换给读者的偏好。例如，R 1 +测量可以在使用任何方法生产的 RNA 样本上进行，因为可以假定长度的折叠和均匀性。此外，该协议不包含关于RNA序列共振分配的信息，这是RD实验所需的步骤，因为这在以前的文献19、37、38中已被广泛报道。部分、细分或特定地点的标签方案 36、41、42、43、44 是促进共振分配或减少对 RD 实验感兴趣的共振重叠的方法，并在文献中详细描述。这种方法允许使用任何核苷酸标识的统一标记，这已经可以大大简化共振分配。
这里介绍的IVT方法克服了序列和标签的已知问题，与其他方法相比，提高了产量，降低了成本和工作时间。病毒启动序列的使用减少了反应优化的需要，这是该领域的一个已知问题，执行起来可能非常耗时，在非 G 启动的情况下，成绩单的副本很少。串联成绩单的 T7 IVT 和 Rnase H 裂口可以在同一容器中同时执行。反应过程中，在变性的 PAGE 凝胶上可以看到多重串联重复的模式，该凝胶在完成 RNase H 反应（图 3A、车道 1和 2b）后凝聚到目标 RNA 上的单个波段。使用此方法的典型产量范围为每 1 mL IVT 30 至 70 nmol RNA。然而，基于 RNase H 串联重复的方法并非没有自身的某些问题。RNase H 反应通常不会在与 T7 转录同时运行时完成（图 3A ，车道 2a ）。
串联单元的分离可以通过将指南退到成绩单上并添加更多 RNase H （图 3A 、车道 2b 、步骤 2 . 1 . 2 ）来最终确定。由于体积大的加热速度缓慢，导致 Mg2+催化 RNA 的水解，因此使用了传统的微波炉，将样品加热到 10-15 s 中的 95 °C >。迄今尚未观察到对所生产样品的不利影响。有些构造显示一个小的第二波段，无法通过优化反应条件（图3A，车道4）消除。通常，如果使用优化良好的脱位梯度，这些作为 HPLC 色谱中的肩部可以相当清晰地可见，并且可以删除（步骤 2.2.5）。以下讨论旨在突出协议中的关键步骤，特别是关于获得能够解释构象动力学的高质量数据。
RNase 污染 细胞外 Rnases 无处不在，高度稳定，对 NMR 样品的长期稳定性构成最大威胁。因此，在无 RNase 环境中工作并保持所有试剂和塑料器皿无 RNase 至关重要。建议使用滤镜提示，甚至面罩。在 HPLC 净化后，这一点尤其重要。受 RNases 污染的 NMR 样品通常显示由于单核苷酸降解产品，在数天或数周后在 1个 H-1D 光谱中可见的狭窄峰值。这种样品不适合 R1+测量。
NMR 示例 由于RNA具有高电压性质，与大多数蛋白质相比，它可以在没有降水的情况下用于高浓度。Shigemi NMR 管（见 材料表）的使用是有利的，因为它们允许将高度浓缩的样品集中在线圈的中心，同时由于易感性匹配的玻璃底部和柱塞，仍然提供理想的闪烁和锁定条件。这样，B1 的不遗传性就降低了，导致线条变窄。NMR 管中的典型样品体积为 250 μL，典型浓度为 1-2 mM。不建议在 500 μM 以下的样品用于 RD 实验，因为实验需要很长时间，而且非常有光。同样，不建议低于 200 μL 的样品体积，因为需要良好的闪亮和现场稳定性（锁）。插入柱塞时，避免在样品中形成气泡（步骤 2.4.5）至关重要。如果修复不当，柱塞可以滑入样品中，从而减少可检测体积。此外，温度的快速变化可能导致样品中形成新的气泡。因此，在运输样品时以及在 NMR 光谱仪中更改探针温度时应小心谨慎。在较长时间后再次测量时，检查样品是否有气泡。
RNA 折叠 如果不能正确折叠，动态RNA分子可以存在于多个构象中。尽管二级结构的熔化温度只能略高于室温，但建议在测量前进行彻底的加热和捕捉冷却过程。高度浓缩的发夹样品在动能控制下折叠（加热和捕捉冷却）随着时间的推移可以形成同质体，这就需要在每次核磁共患 NMR 测量之前严格控制 RNA 折叠。如果测量的RNA不是发夹结构，而是RNA复式，则应在热力学控制下进行缓慢折叠。
在这种情况下，加热后的冷却过程应在小时范围内，而RNA在 NMR 样品中的最终体积和浓度中使用。预期伊米诺和芳香共振的初始计数可以提供有关样品同质性的见解。如果样品看起来不像预期，则应重新折叠。Mg2+ （添加为氯化盐） 可以帮助折叠RNA结构45.实际上，折叠控制是与至少部分分配 NMR 共振并实验性地解决二级结构的示例的比较。
旋转锁电源和加热考虑 如果将 1H R1 + RD 实验作为 2D 概述实验运行，SL 功率应不低于 1.2 kHz。射频发射频率应放置在感兴趣的峰值 ppm 区域中间（例如芳香质子的 7.5 ppm）。然后，1.2 kHz 的带宽将足够大，可以旋转锁定这些质子，而不会产生任何重大的失谐效应。这种影响可以在 RD 配置文件中识别。如果发生 ，R2+REX 值会随着 SL 功率值的增加而增加而不是减少，尤其是对于低 SL 功率。检查计算的 SL 功率值是否与交付给示例的功率相对应。在实践中，如果在较新的光谱仪上仔细校准 了 1H 90° 硬脉冲，则可以使用计算的 SL 功率;但是，这可以通过校准每个所需带宽的 SL 功率来检查。
SL 功率的范围非常广泛，可用于1H R1 +RD实验，导致样品加热变化（基于 HCP 序列的 HSQC 为 1.2 kHz 至 15 kHz，SELOPE 实验为 50 Hz 至 15 kHz）。在比较低功耗 SLs 获得的 1D与。。。 。时，可以检测到样品加热的不平等是化学移位的轻微变化。大功率 SLs。这种效应通常不在异种核的R1+实验中的热补偿中考虑。由于每个自旋锁功率系列的 vd 列表中指定的旋转锁持续时间不同，这些实验中的热补偿通常是为了纠正不同的加热。特别是对于SELOPE实验，第二次热补偿应该用于所有应用SL强度，如20中描述的。
vd 列表考虑 如前所述，vd 列表应包含足够长的时间点，以获得显著的强度衰减（理想情况下，降低到初始信号的 30%，或者如果不可能在探针规格内达到 70% 的衰变，则尽可能低）。虽然 vd 列表针对低 SL 功率 （1.2 kHz） 进行了优化，但此 vd 列表还应在要使用的最高 SL 功率（例如15 kHz）进行测试。这是由于，对于具有显著 REX 贡献的峰值，在高 SL 功率下衰变速度会慢得多。因此，在高 SL 功率下也应验证足够的衰变。在异振实验中，在高偏移下衰变时也必须考虑这一点。vd 列表的理想最大时间点对于分散实验的不同区域可能有很大的不同。在这种情况下，vd 列表中可以包含更多的点，并且根据它们将导致的低 SINO 进行分析时，可以丢弃用于更高 SL 功率或更高偏移的较长 vd 列表点。一般来说，5-8 vd 列表点应被视为能够发现导致非指数衰变的潜在人工制品，如 J 耦合（见下文）。
1D-HCP 选择性考虑 如果在运行基于 HCP 的 1D 版本时，如果与基于 2D HSQC 的实验的1H 维度的兴趣峰值重叠，则必须特别小心。基于 HCP 的传输非常（但从未 100% 选择性），因此，另一个峰值可能会导致 1D 兴趣峰值的强度和衰变行为。这表明，使用标记实验的1D和 2D 版本获得的共振R1 + 值存在差异。
ROE 考虑因素： 对于具有慢中间交换的原子的离共振曲线，ROE 人工制品可以根据获得的 [与 NOESY 或 ROESY 光谱 的比较 ]进行识别。如果交叉峰值可以识别出与 +对应的化学移位差，那么观察到的兴奋状态实际上可能是 ROE 伪器（例如，在芳香质子之间发现了 ROE，它们都在同一化学移位范围内，因此被那些非共振曲线20所覆盖）。从经验，这总是导致不良适合与大错误，可能是由于ROE没有遵循相同的模式 REX 与增加SL功率。中速交换的情况变得更加困难。虽然共振曲线（从相邻核上获得的 13C 数据比较）仍然代表 GS 和 ES 之间的交换过程，但离共振曲线受多个 ROE 人工制品的影响。
在这种情况下，检测交换过程的 SL 功率更大（> 1.5 kHz），因此跨越了更多的质子，因为离共振曲线跨越了各种 ROE 候选的化学转移差异（对于 H8 来说，它们是：ca 中的氨基质子）。 ± 1000 赫兹， H5 / H1 在 ca. - 1200 Hz， 伊米诺质子在 ca. 3500 Hz） 。到目前为止，还没有发现任何方法可以抑制这些 ROE 人工制品（除了使用部分去质的核苷酸46），并且不应记录用于快速中间交换的失谐数据，因为如果不能通过 NOESY 光谱排除 NOE/ROE 贡献，则无法使用此方法提取有关实际\é 的可靠信息。
J - 耦合 （哈特曼 - 哈恩） 考虑 虽然同核J耦合质子（如H6）的共振曲线被成功记录为10、20，但必须特别注意离共振测量，特别是对于低SL功率，因为哈特曼-哈恩匹配条件可以跨越广泛的研究偏移。哈特曼-哈恩文物可以确定为指数衰变或增加R2+REX值的振荡，在共振RD地块20中具有增强的SL优势。

RNA在细胞中执行多种调节1、催化2和结构3功能，其中许多功能与灵活的分子结构和这些结构的复杂变化有关，4、5、6、7。低人口状态对于大多数结构确定方法仍然不可见，或者不允许以高原子分辨率研究这些隐藏状态。溶液态核磁共振（NMR）光谱学结合了两个方面，提供了对单个原子核的访问，以及提供一个大型的实验工具箱，通过所有时间系统8的动态目标。RD NMR实验提供了在中间时间尺度上进行构造交换的机会，其中基础配对模式和局部结构重新排列的变化可以预期为5、9、10、11、12、13、14。RD 实验以卡尔-珀塞尔-梅布姆-吉尔脉冲列车15或旋转框架中的放松测量（称为 R1+RD实验16）的形式执行长R2测量。
虽然两者都可以用来提取人口和汇率和化学转移差异到次要状态，R1 +RD实验也给出了兴奋状态的化学转移差异的迹象。这允许对二级结构进行推断，这与RNA结构17的化学转移密切相关。化学转移是核基上的芳香质子和碳、伊米诺质子的碱基配对伙伴以及C4'和C1'原子18、19上的糖皱褶的一个很好的螺旋度指标。需要注意的是，最近，一项使用更高自旋锁 （SL） 功率的化学交换饱和转移 （CEST） 实验，从而将 CEST 实验的适用性转移到更快的交换时间尺度上，作为一个兴奋状态系统的 R1 +RD实验的替代方案发表。
虽然13C和15N同位素经常被用来访问结构交换，最近从这个实验室的工作使用芳香和伊米诺质子作为探测器的构象交换9，10。使用1H作为观测到的原子核带来了几个优点，例如，在更快、更慢的时间尺度上进行交换，提高灵敏度和缩短测量时间。SELective 优化质子实验 （SELOPE） 方法进一步促进了这一点，通过使用同核鳞片耦合（而不是异核磁化转移）对一维 （1D） 频谱进行排斥，并消除对同位素标签20的需求，从而提供芳香质子的获取。本协议涉及统一13C/15 N 标记和未标记样品的1H R1+ RD实验中的测量结果。因此，本文提出了一种样品制备方法，该方法被认为是不同样品制备需要最通用的21种，并在本文的最后一节（图1）中讨论了替代方案。
此时，读者应注意，1H R1 +RD实验可以采用其他样品制备技术，并且可以通过与所呈现技术合成的样品进行其他结构和功能分析方法。1H R1 +RD实验要求高RNA浓度（理想情况下为>1 mM）以及高均匀性，包括RNA长度和结构构造，以确保分子动力学的可靠特征。体外转录（IVT）是许多研究人员产生13个C/15N标签RNA样本的首选方法，因为有标记的核苷三磷酸盐（NTP）和酶反应22的便利结合。然而，广泛使用的T7RNA聚合酶（T7RNAP）23，24，25遭受低5'同质性的情况下，某些启动序列26，27，往往也3'同质性在转录径流28。由于需要大量 ±200 nmol，目标RNA物种的净化变得更加昂贵和费力。这里使用的方法以前曾被提出过，其中主要讨论了优势21。简言之，它通过转录一个更大的串联成绩单来解决描述的问题，然后由Escherichia大肠杆菌RNase H，由幻想寡核苷酸29，30引导（见图2的细节）。
在串联成绩单的 5' 和 3' 末端结合一个间隔序列，可以分别使用高产启动序列和去除靠近质粒模板线性站点的终端悬垂（图 2B）。该方法被证明可以显著提高产量，同时降低成本和劳动力，同时需要更复杂的模板合成和需要额外的酶和寡核苷酸。由于缺乏大小相近的 RNA 物种， RNase H 的高特异性有助于净化。本协议使用离子交换高性能液相色谱 （HPLC） 步骤，该实验室最近于 31日发布了该步骤，但其他方法可能是替代方法。1H R1 +RD可以， 一般来说，在标有或未标记的样本上获得两个各自的脉冲序列，即"标记"1H R1 +异核单量子相关性（HSQC）基实验，具有13C间接维度10和"未标记"1H R1+SELOPE基于1H间接维度20的实验。
这些二维（2D）实验可以作为第一次检查，无论样本中是否存在 R 1+时间尺度上的动态。可以获取光谱中所有已解决峰值的 RD 概述，并确定更彻底的 RD 分析感兴趣的峰值。这意味着，即使是未贴标签的样品，也可以在决定生产更昂贵的标签样品之前进行检查。一旦选择具有构象交换贡献的峰值进行更深入的研究，最好切换到上述实验的 1D 版本（如果峰值仍能解决），以进行所谓的异声实验。对于标记版本，HSQC 转移到13C 被选择性异核交叉极化 （HCP） 步骤所取代，该步骤用于13C R1 +实验32、33、34、35，而在 SELOPE 实验中， 实验只是以 1D 方式运行，这对位于 2D 对角线上的 H8 和 H2 信号特别有用。如果两者都有标记的样本和未标记的样本，那么使用哪个序列的一个标准是，在两个实验中，兴趣的峰值是如何隔离的。
一般来说，SELOPE实验建议用于多达50个核苷酸的RNA样本。对于较大的RNA，重叠将更大：然而，结构上有趣的核苷酸经常出现在化学转移区域，这些区域的重叠性较小，在更大的RNA中仍然可能获得。另一个论点是，在未标记的样品中，在 1H 和12C 之间不会发生 J 耦合。但是，由于最小自旋锁功率由标记实验中用于脱钩这两个自旋（+1 kHz）的最小功率定义，因此未标记的实验允许使用范围更广的自旋锁 （SL） 强度，因此，可以访问更广泛的交换时间尺度。这些非共振实验为kex提供了额外的信息，如兴奋状态（替代顺从者）、pES的人口，以及以+（地态的化学移位差和兴奋状态）形式非常有价值的化学转移信息。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> 图1：提交协议的工作流程。准备前的实际大规模样品生产，包括模板制备和确认成功的体外转录和 RNase H 。大规模生产，包括 HPLC 净化、NMR 管填充和 RNA 折叠确认。如果同位素标记合成，应在同一天进行无标签的纯化，以进行梯度优化。NMR 用R1 +实验来描述构象动力学。每个步骤都可以独立执行，例如，1H R1 + RD 分析可以应用于使用其他方法产生的任何合适的RNA样本。缩写：IVT =体外转录;HPLC = 高性能液相色谱;核磁共振 = 核磁共振;RD = 放松分散。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
本协议的目的是为研究RNA发夹分子中1H R1 +放松分散的构造动力学提供实际细节和关键参数。在提供了目标RNA的设计、合成和离子交换 HPLC 纯化的详细协议后，描述了使用所有、部分或没有 NTP 作为13C/15N 标记版本执行的目标RNA 的纯化工作流程，并描述了最终确定 NMR 样本并确认与 NMR 光谱仪的构象交换的工作流程。最后，介绍了在布鲁克NMR光谱仪上设置1HR1+RD实验的细节（图1）。该协议给出每个步骤，以设置标记样本的1D版本和额外的注释和一个表来调整设置SELOPE版本（表2）。协议后，将讨论样品制备的关键步骤和替代路线以及1H R1 + RD 设置。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA是一种高度灵活的生物分子，其中结构的变化在RNA分子作为细胞信使和调节器执行的功能中起着至关重要的作用。虽然这些动态状态仍然隐藏在大多数结构方法中， 但R1+ 放松分散（RD）光谱学允许在原子分辨率下研究微到毫秒系统中的构造动力学。使用 1H作为观测到的原子核进一步扩大了所覆盖的时间制度，并直接获得氢键和碱基配对。
这种研究中具有挑战性的步骤是高纯度和高产量样品制备，可能 为13个C-和 15个N标签，以及设置实验和安装数据来提取以前看不见的状态的人口、汇率和二级结构。该协议在样品准备方面提供了关键的动手步骤，以确保准备合适的RNA样本，并设置 1H R1+ 实验，同时使用同位素标记和无标签RNA样品。

RNA 生产协议通过生成高纯度成绩单促进净化。 图 3A 显示了串联成绩单的几个反应的结果，提供了成功和不成功的反应。Lane 1 显示了完全裂开的脚本的最佳情况，只有微弱的副产品痕迹。Lane 2a 显示不完整的，可以通过重新修复和添加更多 RNase H （ Lane 2b ，步骤 2 . 1 . 2 ）来解决。1、2a 和 2b 车道的 RNA 构造相同。3 号车道上的样本显示不成功。排除这种反应的故障将涉及检查导引序列、 DNA 模板的纯度和退火温度。可能， RNase H 将不得不在 T7 IVT 后执行，如示例 2 所示。
4 巷中的样品显示了大量侧产品，这些产品很难通过离子交换 HPLC 去除。排除此类样本的故障可能涉及（ a ）降低温度、 RNase H 量或反应时间，（ b ）降低梯度和注射量，并试图将目标分数与侧产品分开。卡尔松等人已经讨论了如何提高离子交换HPLC纯化分辨率的进一步信息。HPLC 将目标RNA与更长或更短的核酸、蛋白质或小分子污染物分离。 图 3B 显示了离子交换 HPLC 净化的最佳结果。应选择梯度，以便目标 RNA 物种在下一个较小的物种之后至少放小一个列体积（在此示例中为： 35 mL ），在下一个较大物种之前放小一列体积。
这种方法中较小的物种包括单核苷酸、流产产品（ 8 - 12 nt ）、 3 ' 和 5 ' 间隔序列（ 5 - 14 nt ）和导引（ 12 nt 幻想核酸），而较长的序列可能是不洁的串联重复和质粒。当达到分离良好的脱液峰值时，纯化可以放大到每次注射相当于 +20 mL 的 IVT 反应。RNA 样本的正确折叠对于 RD 实验至关重要，并且必须在每次测量之前得到确认。 图 4 显示了在应用步骤 2.4（蓝色）中的折叠协议之前的 A 标记 22-mer RNA，以及实现正确折叠后的相同示例（红色）。Mc-Fold 二级结构预测 （图 4C）提出了具有 4 个碱基对的发夹结构，从而产生 5 个 imino 信号。
图4A中的两个光谱都证实了这些预测信号，尽管相对强度略有不同，这表明一些折叠结构错误（这里，一毛钱）可能只有1H 1D光谱来评估是有问题的。然而，芳香1H，13C-HSQC频谱（图4B），在折叠协议（蓝色）之前只显示样品的芳香信号3个，但根据步骤2.4（红色）折叠的样品的所有4个信号。以蓝色显示的样本可能形成同质体（图4D中建议的结构），其产生的伊米诺信号与发夹相同。A13H2的信号似乎被交换了。这些结果有助于强调折叠确认的重要性与伊米诺和芳香指纹实验之前，每个RD实验。本协议中描述的1H R1+脉冲序列允许检测中间交换系统中的动态。最初记录了共振曲线，如果存在特定残留物的动态，则在获得的R2+REX值内可见分散，而此曲线对于无交换的残留物是平的。
图5显示了合成RNA发夹（图5A）中两个不同的H8原子获得的代表性共振曲线，其中G6H8体验交换（图5C），而A4H8则没有（图5B）。由于此示例中的交换速度相对较慢（kEX = 292 ± 40 Hz），因此利用 SELOPE 实验的优势来实现低 SL 强度，并且使用脉冲序列的 1D 版本记录了两个共振曲线。然后，使用相同的脉冲序列获取在共振配置文件中显示分散的残留物的失谐数据。图5D显示获得的R 1+值与偏移值，其中曲线的轻微不对称已经表示[é]的标志。
这变得更加明显，在R 2+REX情节中，R1的贡献被删除（图5E）。同一数字的右列显示在稍有不同的合成RNA发夹中为两个不同的H8原子获得的具有代表性的共振曲线，交换速度更快，其中G6H8体验交换（图5G），而A4H8则不（图5F）。更快的汇率（kEX = 43，502 ± 38，478 Hz） 允许使用 SELOPE 2D 版本同时对所有芳香质子进行 RD 记录，以获取谐振数据（图 5H、I中显示的 G6H8 数据）。
正面和负面结果的通用标识符 串联 IVT 和 RNase H 中的阳性结果可识别为： 1 ）目标带是变性 PAGE 凝胶中最强的波段。2） 主波段周围没有或只有弱频段。3） 没有或只有弱的更高分子量物种。4） HPLC 色谱图显示目标 RNA 的分离度高。5） 当主峰值被采样时，只有一个波段出现在变性的 PAGE 凝胶上。
串联 IVT 和 RNase H 中的负结果如下： 1 ）在变性 PAGE 凝胶上可以看到不或只是弱主带。2） 从RNA串联重复的高分子量物种模式是可见的。3） 虽然主波段存在，但强度相似的波段在 3 nt ±或低于主波段。
折叠良好的样品可识别如下：1） 观测到的伊米诺质子数量与二次结构模拟所期望的伊米诺质子数量相匹配（例如，Mc-Fold39，图4A）。2） UUCG 环中的 syn G-U 摆动基对（如果存在）在 +9.5 ppm 下可见，有时只能在较低的温度下可见。Fürtig和同事40日描述了UUCG环路的进一步指纹识别。3） 芳香指纹与先前分配的样本一致，该样本已被确认可以正确折叠（图4C）。
误折或降级的样本可识别如下：1） 伊米诺信号比二级结构模拟预测的要多（注：减少 imino 信号并不一定意味着误折叠，因为关闭基对通常不可见，构象交换拓宽了线条）。2） 缺少伊米诺信号。3） 芳香区高强度的狭窄信号，表示单核苷酸降解产物。4） 伊米诺或芳香信号与已确认折叠的参考样本（图 4C）之间的差异。
在可检测的时间尺度中显示无交换的原子可以识别为：1） 来自平面 RD 配置文件（由于缺少的REX贡献随应用 SL 功率而变化）（图 5B和图 5F）。2） 当kEX和 +具有相同数量级时，必须小心处理慢中间交换的情况。在这种情况下，共振贡献可能非常小，如图 5C中所见（在此例中，安装参数为kEX = 292 ± 40 Hz 和+112 ± 4 Hz）。如有疑问，可以记录低 SL 离谐振曲线以进行验证。
在共振RD实验（图5B 和 图5F）中，可以从非平面放松分散剖面中识别出中间时间尺度上显示交换的原子：2） HSQC 或 SELOPE 实验中更广泛的线宽也可以作为交换指标。
选好的反共振曲线的 SL 功率值（图5E，F）： 1） 在共振曲线中有相当大的kEX贡献（图5C 和图 5G 中表示选定的 SL 功率值）。2） 由于对至少 3 个 SL 功率值进行离共振曲线测量，所选 SL 功率值应分布在具有kEX贡献的谐振曲线区域。3） 导致拉盖尔适合后的非平面R2+REX曲线 （例如，图 5D： SL 强度 25、 50 和 75 Hz;图5E）。
对于异振曲线（图 5E，F）选择不当的 SL 功率值会导致拉盖尔适合后的平面R2+REX曲线。图5E中显示了一个例子，其中100赫兹的离共振曲线非常平坦，因此没有提供关于+的重要信息。
旋转框架核过豪瑟效应 （ROE） 人工制品的指示： 1） 从离共振曲线获得的+与空间附近质子 /质子的化学变化相匹配，该变换显示与核过豪瑟效应光谱 （NOESY） 光谱的兴趣峰值相交的峰值。（例如，图5I显示快速中间交换的预期广泛的离共振曲线，但曲线也有更清晰的特征，例如，在-3000赫兹和+1500赫兹。这些很可能是由于 ROE 人工制品，而不是化学转移，这种 H8 在不同的符合者）。2） Laguerre 适合确实有效，但对于共振和至少 3 个离共振曲线，效果不好（给出高错误或物理上不可能的值），即使指数是从高 SINO（>20）（例如 kEX = 43，502 ± 38，478 Hz）的实验中获得的） 。通常每个 SL 都适合单独，但将它们放在一起会产生更高的错误：相反的行为是期望一个真正的兴奋状态。
从非共振曲线获得的"真实"交换指示与空间附近/质子中质子的化学变化不匹配，后者显示与NOESY光谱兴趣峰值的交叉峰值（例如图5E）。2） 拉盖尔适合给低错误的共振和至少 3 个失谐曲线 （例如，图 5E vs.图5I，请参阅标题以获得合适的结果）。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> 图3 ： T7 串联 IVT 和 RNase H 反应的样本生产。 （ A）串联 IVT 和 RNase H 的正负结果的变性页。梯子高度指 RNA 参考， 12* 指幻想指南。巷 1： 成功生成 20 nt 目标 RNA。很少有更短和更长的产品存在。巷 2a ：串联成绩单的不完整。虽然 HPLC 的净化是可能的，但会浪费大量材料。巷 2b ： 2 巷的持续 Rnase H 产生一个干净的样品，准备 HPLC 注射（与巷 1 相同）。巷 4 ： RNase H 基本上没有成功，也没有产生目标带。全长串联成绩单仍然可见于 600 nt。巷5：产生了目标带，但存在一个强大的-1波段。虽然可以执行 HPLC，但需要小心地删除侧产品。（B） 成功注射 HPLC 的示例。38分钟的峰值包含目标长度的纯RNA，而更长和更短的产品与目标RNA有很好的分离。小组B已由 21日起修改。缩写：IVT = 体外 转录;HPLC = 高性能液相色谱;nt = 核苷酸;AU = 任意单位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> 图4：在（蓝色）和（红色）后的RNA发夹示例，在NMR.（A）的折叠步骤2.4（参见协议）的1个H-1D光谱的A标记22-merRNA的Imino区域。伊米诺信号基础对标识的预期区域以灰色表示。（B） 1H，13C-HSQC 光谱的RNA的芳香共振从面板A.折叠后的样本（红色）显示 4 个信号，而折叠前的样本（蓝色）仅显示 3 个信号。（C） 麦克折叠预测 22 mer RNA 作为发夹。从这个二级结构中可以预期到五个伊米诺信号，这可以在A.（D）面板中发现由22-merRNA形成的同质体的拟议结构中的两个样本，从而产生与发夹结构相同的5个碱基对。缩写：核磁共振： 核磁共振;1D = 一维;HSQC = 异核单量子相关性;ppm = 百万分之一。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> 图5：1H R1 +RD代表基于RNA发夹的两种不同构造的结果。（A） 左列显示在 RNA 上获得的结果，在凸起的 U 上方有 C-G 基对，而右列显示在基对切换到 G-C 的样本上获得的结果。（B） 和（F） 显示两个构造的 A4H8 获得的平面分散配置文件，表示没有构造交换。（C-E） 显示在 （G-C） 结构中为 G6 获得的谐振、失谐和安装数据。Laguerre 适合导致以下结果： R1 = 2.87 ± 0.01 Hz， R2 = 7.76 ± 0.03 Hz， kEX =292 ± 40 Hz， pES = 0.31 ± 0.03%， = 112 ± 4 Hz.（G=I）显示共振、失谐和在 （G-C） 结构中为 G6 获得的安装数据。拉盖尔适合导致以下结果： R1 =1.93 ± 0.02 Hz， R2 = 6.71 ± 0.86 Hz， k EX = 43，502 ± 38，478 Hz， p ES = 27 ± 16%， + 203 ± 166 Hz.这个数字从20个修改。缩写：SL = 旋转锁。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

我们提出了一个协议，测量微到毫秒的动态13C/15N标签和未标记RNA与1H R1+放松分散核磁共振（NMR）光谱。此协议的重点在于高纯度样品制备和 NMR 实验的设置。

1H R1 + RNA 放松分散实验样品制备和设置的实用方面

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

该协议描述了质子R1rho放松分散测量的RNA样品制备和NMR设置，以检查RNA分子的确认交换。由于质子被探测，该方法不需要同位素标记，可以直接访问结构特征，如转移的基础配对。移液器是相当模块化的意义，R1rho放松分散可以测量，即使样品是用不同的方法产生的。首先准备质粒样本，并设置体外转录和反应，如文本手稿中所述。将反应在37摄氏度下孵化一小时。然后在加载溶液中稀释样品的一微升。并在变性的 PAGE 凝胶上运行一个微升。如果反应成功，将反应缩放到所需的体积中，并在一夜之间运行。然后运行另一个变性 PAGE 凝胶，并评估反应是否已经完成。如果不完整，将反应溶液在传统微波炉中加热 450 瓦，加热 15 秒。然后将溶液缓慢冷却到 37 摄氏度 40 分钟，重新对 RNA 和导引进行重新命名。并注意形成一个新的沉淀。加入更多的无机热磷酸盐和RNase H.孵化反应一到三个小时在37摄氏度。然后确认完成反应与变性页面。当 RNase H 反应完成时，通过将 EDTA 添加到 50 毫摩尔的最终浓度来抑制反应。彻底的漩涡。通过 0.2 微米注射器过滤器过滤解决方案。将溶液集中到可注入 HPLC 系统的体积中进行净化。在将浓缩和纯化样品添加到 NMR 管中之前，用丰富的水冲洗清洁管。然后是 RNase 净化试剂、水和 95% 乙醇。最后用水冲洗后，让它干燥。用水冲洗柱塞，使用无绒毛湿巾用 RNase 净化试剂和 95% 乙醇清洁。干燥管子和柱塞后，在 NMR 样品中加入 10%D2O。使用大移液器尖端将RNA样本转移到NMR管中，沿着管壁的一侧流动。将柱塞插入管中，用快速扭曲的运动将其推倒以消除气泡，然后缓慢地将柱塞拉起，而不会产生新的气泡。用石蜡薄膜修复它。根据用于 RNA 分配的全标记 RNA 样本上使用的芳香质子碳 HSQC 数据集创建新数据集。设置一般参数和 RD 特定参数。然后将质子旋转锁功率设置为 1.2 千赫用于测试。生成只有一个条目的测试 vd 列表，零毫秒，将 TDF1 设置为 1，并更新 D30 以运行测试频谱。设置测试 vd 列表后，更新 D30 和 TDF1。并绘制不同旋转锁长度的峰值强度。确定原始峰值强度降低到三分之一的旋转锁长度。从测试运行的结果，创建最终 vd 列表用于实验。选择扫描次数，以便列表中最弱的峰值的信号与噪声比至少为 10。串联成绩单的几个反应的结果如下。成功反应产生了20个核苷酸靶RNA。不成功的反应导致样品的不完整和失败。HPLC 对RNA样本的注射显示纯目标RNA在 38 分钟内达到峰值。虽然更长和更短的产品与兴趣的高峰相分离。对RNA发夹的分析表明，观测到的伊米诺质子数量与二次结构模拟所期望的伊米诺质子数量相匹配。RNA芳香共振的质子碳HSQC光谱在折叠后显示四个信号。折叠前只有三个信号。在代表获得两个不同的H8原子和两个不同的合成RNA发夹的共振曲线，G6H8体验确认交换。而A4H8没有。对于 G6H8，选择了彩色自旋锁电源并记录了离谐振数据。在交换速度缓慢的 CG 结构中，R1rho 行值与偏移图已经显示曲线的轻微不对称，表示化学转移差速三角洲欧米茄的迹象。这在删除 R1 贡献的 R2 加 REX 情节中变得更加明显。另一方面，GC 构建体验交换更快，R1rho 值与偏移图呈现了更广泛的曲线，即使在 R2 加 REX 图中，三角洲欧米茄的提取也变得不那么明显。一旦RNA动力学被阐明，状态可以被描述和捕获。例如，这些受困状态可以在生物测定中进行测试。这种方法使我们能够观察活性微RNA miRNA复合物中的功能性、相关碱基配对移位、核糖体RNA的循环重新排列以及单核苷酸凸起的碱基对稳定性。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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