Vi takker proteinvidenskabsfaciliteten (PSF) på Karolinska Institutet for udtryk og rensning af T7 RNA polymerase og E. coli RNase H, Martin Hällberg for den generøse gave fra den uorganiske fosfatase og hele Petzoldlab for værdifulde diskussioner. Vi takker Luca Retattino for forberedelsen af U-bule konstruktioner og Emilie Steiner og Carolina Fontana for deres bidrag til makroer og montering scripts. Vi anerkender Karolinska Instituttet og Institut for Medicinsk Biokemi og Biofysik for støtte til køb af et 600 MHz spektrometer og positionsfinansiering (KI FoAss og KID 2-3707/2013). Vi er taknemmelige for det økonomiske bidrag fra Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 og FFL15-0178) og Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS2 0140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 og 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 og M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. anerkender finansiering gennem marie skłodowska-curie IF (EU H2020, MSCA-IF-projekt nr 747446.

K.P. er konsulent for Arrakis Therapeutics, et firma, der opdager små molekyler rettet mod RNA.

Den protokol , der præsenteres heri , er en syntese af flere protokoller , der tidligere er offentliggjort i form af forskningsartikler10,20,21,31. Derfor kan segmenter af protokollen anvendes, mens andre kan udveksles til læserens præference. F.eks. kan R1ρ-målingerne udføres på en RNA-prøve, der er fremstillet med en hvilken som helst metode, da foldning og homogenitet af længden antages. Desuden indeholder protokollen ikke oplysninger om resonanstildeling af RNA-sekvensen - et trin , der kræves til RD-eksperimenter - da dette er blevet dækket udførligt i tidligere litteratur19,37,38. Delvise, segment- eller stedspecifikke mærkningsordninger36,41,42,43,44 er tilgange til at lette resonanstildeling eller reducere overlapningen af resonanser, der er af interesse for RD-eksperimenter og er blevet beskrevet udførligt i litteraturen. Denne metode gør det muligt at bruge ensartet mærkning af enhver nukleotididentitet, hvilket allerede kan forenkle resonanstildelingen betydeligt.
Den IVT-metode, der præsenteres her, overvinder kendte problemer med sekvenser og mærkning, øger udbyttet og reducerer omkostninger og arbejdstid sammenlignet med andre metoder. Brugen af den virale indledningssekvens reducerer behovet for reaktionsoptimering, hvilket er et kendt problem på området, der kan være tidskrævende at udføre og giver kun få kopier af udskriften i tilfælde af ikke-G-indledning. T7 IVT og RNase H kavalergang af tandem udskrift kan udføres samtidigt i samme fartøj. Et mønster af multimeric tandem gentagelser kan ses på en denaturerende PAGE gel under reaktionen, som smelter sammen til et enkelt bånd på målet RNA efter afslutningen af RNase H reaktion (Figur 3A, bane 1 og 2b). Typiske udbytter ved hjælp af denne metode ligger mellem 30 og 70 nmol RNA pr. 1 mL IVT. Men den metode, der er baseret på RNase H kavalergang af tandem gentagelser kommer ikke uden visse problemer i sig selv. Den RNase H kavalergang reaktion ofte ikke gå til afslutning, når de køres samtidig med T7 transskription(Figur 3A, lane 2a).
Adskillelsen af tandem enheder kan afsluttes ved at annealing kavalergang guide til udskrift og tilføje mere RNase H(Figur 3A, lane 2b, trin 2.1.2). Da opvarmningen af store mængder er langsom og fører til Mg2+katalyseret hydrolyse af RNA, blev der anvendt en konventionel mikrobølgeovn, som opvarmer prøven til >95 °C i 10-15 s. Der er endnu ikke observeret skadelige virkninger på de producerede prøver. Nogle konstruktioner viser et mindre andet bånd, der ikke kunne elimineres ved optimering af reaktionsbetingelserne (Figur 3A, bane 4). Normalt er disse ret tydeligt synlige som en skulder i HPLC-kromatogrammet, hvis der anvendes en godt optimeret elueringsgradient og kan fjernes (trin 2.2.5). Den følgende diskussion har til formål at fremhæve kritiske trin i protokollen, specielt med hensyn til at opnå data af høj kvalitet, der muliggør en fortolkning af kropsbygningsdynamik.
RNase forurening Ekstracellulære RNases er allestedsnærværende, meget stabile og udgør den største trussel for langsigtet stabilitet af NMR-prøver. Derfor er det afgørende at arbejde i et RNase-frit miljø og holde alle reagenser og plasticware RNase-fri. Brugen af filter tips og måske endda ansigtsmasker anbefales. Dette er specifikt vigtigt efter HPLC-rensning. NMR-prøver, der er forurenet med RNases, udviser typisk smalle toppe, der er synlige i 1H-1D-spektre efter dage eller uger på grund af enkeltkernede nedbrydningsprodukter. En sådan prøve er ikke egnet til R1ρ-målinger. 
NMR-prøve På grund af sin meget ladede karakter kan RNA anvendes i høje koncentrationer uden nedbør sammenlignet med de fleste proteiner. Brugen af Shigemi NMR-rør (se materialetabellen)er fordelagtig, da de tillader centrering af den stærkt koncentrerede prøve i midten af spolen, mens de stadig giver ideelle shimming- og låseforhold på grund af den modtagelighedsmatchede glasbund og stemplet. På denne måde reduceres B1-inhomogeneity, hvilket giver anledning til smallere linjer. Det typiske prøvevolumen i et NMR-rør er 250 μL, og den typiske koncentration er 1-2 mM. Prøver under 500 μM anbefales ikke til RD-forsøg, da forsøget ville tage for lang tid og en god shim. På samme måde anbefales prøvevolumen under 200 μL ikke, fordi der kræves en god shim og feltstabilitet (lås). Ved indsætning af stemplet er det vigtigt at undgå dannelse af bobler i prøven (trin 2.4.5). Hvis stemplet ikke er korrekt fastgjort, kan det glide ned i prøven, hvilket reducerer den påviselige lydstyrke. Desuden kan hurtige temperaturændringer føre til dannelse af nye bobler i prøven. Derfor skal der udvises forsigtighed ved transport af prøven og ved ændring af sondetemperaturen i NMR-spektrometeret. Kontroller prøven for bobler, når du måler igen efter en længere periode.
RNA-foldning Dynamiske RNA-molekyler kan eksistere i flere konformationer, når de ikke foldes korrekt. Selvom smeltetemperaturerne i sekundære konstruktioner kun kan være lidt over stuetemperaturen, anbefales en grundig opvarmnings- og snap-kølingsprocedure før måling. Stærkt koncentrerede hårnåleprøver, der foldes under kinetisk kontrol (opvarmning og snap-køling), kan danne homodimere over tid, hvilket kræver streng kontrol af RNA-foldning før hver NMR-måling. Hvis det målte RNA ikke er en hårnålestruktur, men en RNA-dupleks, skal der påføres langsom foldning under termodynamisk kontrol.
I dette tilfælde skal afkølingsprocessen efter opvarmning være inden for timer, mens RNA'et anvendes ved det endelige volumen og koncentration i NMR-prøven. En første optælling af forventede imino- og aromatiske resonanser kan give indsigt i prøvens homogenitet. Hvis prøven ikke ser ud som forventet, skal den foldes igen. Mg2+ (tilsat som chloridsalt) kan hjælpe med at folde RNA-strukturer45. I praksis tjener foldestyringen som en sammenligning med en prøve, der er blevet brugt til i det mindste delvist at tildele NMR-resonanser og til at løse den sekundære struktur eksperimentelt.
Overvejelser vedrørende spinlåskraft og opvarmning I tilfælde af at køre 1H R1ρ RD eksperimenter som 2D oversigt eksperimenter, SL magt bør ikke være lavere end 1,2 kHz. Radiofrekvensen for sendere skal placeres midt i ppm-området af de højeste sider af interesse(f.eks.7,5 ppm for aromatiske protoner). Båndbredden på 1,2 kHz vil derefter være stor nok til at spin-låse disse protoner uden større off-resonans effekter. Sådanne virkninger kan identificeres i profilen for den regionale udvikling. Hvis de opstår, stiger R2+REX-værdierne i stedet for at falde med stigende SL-effektværdier, især for lav SL-effekt. Kontroller, om de beregnede SL-effektværdier svarer til den effekt, der leveres til prøven. I praksis kan beregnet SL-effekt anvendes, hvis den 1H 90° hårde puls blev kalibreret omhyggeligt på nyere spektrometre. Dette kan dog kontrolleres ved at kalibrere SL-strøm for hver ønsket båndbredde.
Sl-effektområdet, som kan bruges i 1H R1ρ RD-eksperimenter, er meget bredt, hvilket fører til varierende prøveopvarmning (1,2 kHz til 15 kHz for HSQC for HCP-baserede sekvenser og 50 Hz til 15 kHz for SELOPE-eksperimenter). Ulige prøveopvarmning kan påvises som en lille ændring i kemisk skift ved sammenligning af 1D'er opnået for laveffektS-SL'er vs. højeffekt-SL'er. Denne effekt tages normalt ikke i betragtning i varmekompensationer i R1ρ-forsøg med heteronuklei. Varmekompensation i disse eksperimenter er normalt sat op til at korrigere for forskellig opvarmning på grund af de forskellige spin lock varigheder, der er angivet i vd listen over hver spin lock power serie. Især for SELOPE eksperiment, en anden varme kompensation bør anvendes på tværs af alle anvendte SL styrker som beskrevet i20.
overvejelser i forbindelse med vd-liste Som tidligere nævnt skal vd-listen indeholde et tidspunkt længe nok til at opnå et betydeligt forfald af intensitet (ideelt set ned til 30% af det oprindelige signal eller så lavt som muligt, hvis det ikke er muligt at nå et 70% forfald inden for sondens specifikationer). Selvom vd-listen var optimeret til en lav SL-effekt (1,2 kHz), skal denne vd-liste også testes med den højeste SL-effekt, der skal bruges(f.eks.15 kHz). Dette skyldes det faktum, at for toppe med betydelige REX bidrag, vil henfaldet være meget langsommere ved høj SL magt. Så en tilstrækkelig forfald bør også verificeres ved høj SL magt. Det samme skal overvejes for henfald ved høje forskydninger i off-resonans eksperimenter. Det ideelle maksimale tidspunkt for vd-listen kan være væsentligt anderledes for de forskellige regioner i spredningseksperimentet. I dette tilfælde kan flere punkter medtages på vd-listen, og de længere vd-listepunkter for højere SL-effekt eller højere forskydninger under analysen, baseret på den lave SINO, de vil føre til, kan kasseres. Generelt bør 5-8 vd listepunkter anses for at være i stand til at spotte potentielle artefakter, der fører til ikke-eksponentielle henfald som J-kobling (se nedenfor).
1D-Overvejelser i forbindelsemed HCP-selektivitet Der skal udvises særlig forsigtighed, når du kører den HCP-baserede 1D-version, hvis der er en anden top, der overlapper med toppen af interessen for 1H-dimensionen af det 2D HSQC-baserede eksperiment. HCP-baserede overførsler er meget, men aldrig 100% selektive, og det kan derfor ske, at en anden top bidrager til intensiteten og henfaldsadfærden af toppen af interessen for 1D. En indikation af dette ville være en forskel i on-resonans R1ρ værdier opnået ved hjælp af 1D og 2D versioner af det mærkede eksperiment.
Roe overvejelser: For off-resonanskurver af atomer med langsom-mellemliggende udveksling kan ROE-artefakter identificeres på grundlag af en sammenligning af det opnåede Δω med et NOESY- eller ROESY-spektrum. Hvis en krydsspids kan identificeres ved en kemisk skiftforskel svarende til Δω, kan den observerede ophidsede tilstand faktisk være en ROE-artefakt(f.eks.blev roes fundet mellem aromatiske protoner, som alle er i samme kemiske skiftområde og derfor dækket af disse off-resonanskurver20). Af erfaring, altid dette førte til dårlige passer med store fejl, muligvis på grund af ROE ikke følger det samme mønster som REX med stigende SL magt. Situationen bliver vanskeligere for mellemhurtig udveksling. Mens on-resonans kurven er (fra sammenligning med 13C-data opnået på den nærliggende kerne) stadig repræsentativ for udvekslingsprocessen mellem GS og ES, er off-resonanskurven påvirket af flere ROE-artefakter.
I dette tilfælde er SL-kraften til at opdage udvekslingsprocessen større (> 1,5 kHz) og spænder derfor over et større antal protoner, da off-resonanskurver spænder over kemiske skiftforskelle mellem forskellige ROE-kandidater (for H8 ville disse være: aminoprotoner ved ca. ±1000 Hz, H5/H1 er på ca. -1200 Hz, imino protoner ved ca. 3500 Hz). Indtil videre er der ikke fundet nogen metode til at undertrykke disse ROE-artefakter (bortset fra delvis anvendelse af deutererede nukleotider46), og der bør ikke registreres off-resonansdata til hurtig mellemliggende udveksling, da der ikke kan udtrækkes pålidelige oplysninger om den faktiske Δω med denne metode, hvis NOE/ROE-bidraget ikke kan udelukkes via NOESY-spektre.
Overvejelser vedrørende J-Kobling (Hartmann-Hahn) Selv om on-resonans kurver for homonukleare J-koblede protoner, såsom H6, blev med succes registreret10,20, særlig omhu skal tages for off-resonans målinger, især for lav SL effekt som Hartmann-Hahn matchende betingelser kan spænde over en bred vifte af de undersøgte offsets. Hartmann-Hahn artefakter kan identificeres som svingninger på eksponentiel henfald eller stigende R2+REX værdier med stigende SL styrker i on-resonans RD parceller20.

RNA'er udfører et væld af regulatoriske1,katalytiske2og strukturelle3 funktioner i cellen, hvoraf mange er korreleret med en fleksibel molekylær struktur og indviklede ændringer af disse strukturer4,5,6,7. Lavtbefolkede stater forbliver usynlige for de fleste metoder til strukturbestemmelse eller tillader ikke undersøgelse af disse skjulte tilstande ved høj atomopløsning. Opløsningsstatsspektroskopi (NMR) kombinerer begge aspekter ved at give adgang til individuelle atomkerner og tilbyde en stor værktøjskasse med eksperimenter, der er målrettet dynamik gennem alle tidsregimer8. RD NMR-eksperimenter giver adgang til konformationel udveksling i den mellemliggende tidshorisont, hvor ændringer i basisparringsmønstre og lokale strukturelle omlægninger kan forventes5,9,10,11,12,13,14. RD-forsøg udføres så længe R2-målinger i form af et Carr-Purcell-Meiboom-Gill-pulstog15 eller som afslapningsmålinger i den roterende ramme, kaldet R1ρ RD-eksperimenter16.
Selv om begge kan bruges til at udtrække befolkning og valutakurs og kemiske skift forskel til den mindre tilstand, R1ρ RD eksperimenter også give tegn på den kemiske skift forskel i ophidset tilstand. Dette gør det muligt at drage en konklusion om sekundær struktur, som stærkt korrelerer med kemisk skift i RNA-strukturer17. Det kemiske skift er en god indikator for helicitet i tilfælde af aromatiske protoner og kulstof på nukleobaserne, af baseparringspartnere for imino protoner og af sukkerpuckers på C4' og C1' atomerne18,19. Det skal bemærkes, at der for nylig blev offentliggjort et eksperiment med overførsel af kemiske vekselstrømstransaktioner (CEST) ved hjælp af højere spin lock (SL)-effekt, hvorved CEST-eksperimentets anvendelighed blev flyttet til hurtigere udvekslingstidshorisonter, som et alternativ til R1ρ RD-eksperimentet for systemer med en ophidset tilstand.
Selv om 13C og 15N isotoper ofte er blevet brugt til at få adgang til strukturel udveksling, det seneste arbejde fra dette laboratorium anvendes aromatiske og imino protoner som sonder for kropsbygning udveksling9,10. Brugen af 1H som den observerede kerne giver flere fordele, for eksempel adgang til udveksling på hurtigere og langsommere tidsskalaer, højere følsomhed og kortere måletider. Dette lettes yderligere af SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE) tilgang, der giver adgang til aromatiske protoner gennem afvældning af det endimensionale (1D) spektrum ved hjælp af homonukleare skalarkoblinger i stedet for en heteronuklear magnetiseringsoverførsel og eliminerer behovet for isotopetiketter20. Denne protokol omhandler målingen i 1H R1ρ RD-forsøg med ensartet 13C /15N-mærkede og ikke-mærkede prøver. Derfor præsenterer dette papir en prøveforberedelsesmetode, der viste sig at være den mest alsidige til forskellige prøveforberedelsesbehov21 og diskuterer alternativer i sidste afsnit af denne artikel (Figur 1).
På dette tidspunkt skal læseren bemærke, at andre prøveforberedelsesteknikker er acceptable for 1H R1ρ RD-forsøg, og at andre metoder til strukturel og funktionel analyse kan udføres med prøverne syntetiseret med den præsenterede teknik. 1 1 1 1 H R1ρ RD-eksperimenter kræver høje RNA-koncentrationer (ideelt >1 mM) samt høj homogenitet, både i RNA-længde og strukturel kropsbygning for at sikre pålidelig karakterisering af molekylær dynamik. In vitro transskription (IVT) er den foretrukne metode for mange forskere til at producere 13C /15N-mærkede RNA-prøver på grund af tilgængeligheden af mærkede nukleoside triphosphater (NTP' er) og letkøbt inkorporering i den enzymatiske reaktion22. Den udbredte T7 RNA-polymerase (T7RNAP)23,24,25 lider imidlertid af lav 5' homogenitet i tilfælde af visse indledningssekvenser26,27 og ofte også 3' homogenitet under transskriptionsafstrømning28. Rensning af mål-RNA-arten bliver dyrere og besværlig på grund af behovet for store mængder ~ 200 nmol. Den metode, der anvendes her, er tidligere blevet præsenteret , hvor fordele blev diskuteret som helhed21. Kort sagt, det løser beskrevne problemer ved at transskribere en større tandem udskrift, der derefter site-specifikt kløvet af Escherichia coli RNase H, styret af en kimære oligonukleotid29,30 (se figur 2 for detaljer).
Inkorporering af en afstandssekvens i 5' og 3'erne af tandemudskriften gør det muligt at anvende en højtydende initieringssekvens og fjernelse af terminaludhæng tæt på henholdsvis plasmidskabelonens lineariseringssted (figur 2B). Metoden blev vist at forbedre udbyttet betydeligt, samtidig med at omkostningerne og arbejdskraften blev reduceret, med forbehold af en mere kompleks skabelonsyntese og behovet for et ekstra enzym og oligonukleotid. Den høje specificitet af RNase H kavalergang letter rensning på grund af manglen på RNA-arter i et lignende størrelsesområde. Den nuværende protokol bruger en ion udveksling højtydende flydende kromatografi (HPLC) trin, der er blevet offentliggjort af dette laboratorium for nylig31, selv om andre metoder er mulige alternativer. 1 1 1 1 H R1ρ RD kan generelt anskaffes på mærkede eller umærkede prøver med to respektive pulssekvenser, det "mærkede" 1HR 1ρ heteronukleare enkeltkvantitetkorrelation (HSQC)-baseret eksperiment med et indirekte 13C-dimension10 og det "umærkede" 1H R1ρ SELOPE-baserede eksperiment med en indirekte dimension20 på 1H .
Disse todimensionale (2D) eksperimenter kan tjene som en første kontrol, uanset om dynamikken på R1ρ tidsskalaen er til stede i prøven. Der kan opnås en oversigt over den regionale udvikling for alle løste toppe i spektrene, og der kan identificeres spidsbelastninger af interesse for en mere grundig analyse af den regionale udvikling. Det betyder, at selv umærkede prøver kan kontrolleres, før der træffes beslutning om at producere en dyrere, mærket prøve. Når et højdepunkt med konformationelt udvekslingsbidrag er valgt til at blive undersøgt mere grundigt, er det bedst at skifte til 1D-versionerne af ovennævnte eksperimenter (hvis toppen stadig kan løses) for at udføre såkaldte off-resonansforsøg. For den navngivne version, HSQC-overførslen til 13C erstattes med et selektivt heteronukleart krydspolariseringstrin (HCP), som anvendes i 13C R1ρ-eksperimenter 32,33,34,35, mens eksperimentet i tilfælde af SELOPE-eksperimentet simpelthen køres som en 1D, hvilket især er nyttigt for H8- og H2-signaler, der alligevel ligger på diagonalen i 2D. Et kriterium for, hvilken rækkefølge der skal anvendes, forudsat at der findes både en mærket og en ikke-mærket prøve, er, hvor godt isolerede de to eksperimenter har den største interesse.
Generelt anbefales SELOPE-eksperimentet til RNA-prøver på op til 50 nukleotider. For større RNA'er vil overlapningen være større; Strukturelt interessante nukleotider forekommer dog ofte i kemiske skiftregioner, der er mindre overlappende og stadig kan være tilgængelige i endnu større RNA'er. Et andet argument ville være, at der i ikke-mærkede prøver ikke forekommer nogen J-kobling mellem 1H og 12C. Men da den mindste spin lock-effekt defineres af den mindste effekt, der bruges til at afkoble disse to spins (~ 1 kHz) i det mærkede eksperiment, tillader det umærkede eksperiment brugen af et bredere udvalg af spin lock (SL) styrker og derfor adgang til en bredere tidshorisont for udveksling. Disse off-resonansforsøg giver yderligere oplysninger til kex, såsom population af ophidset tilstand (alternativ konform), pES, samt meget værdifulde kemiske skiftoplysninger i form af Δω (den kemiske skiftforskel i jordtilstanden og ophidset tilstand).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Figur 1: Arbejdsgang for den præsenterede protokol. Forberedelse før den faktiske store prøveproduktion, der består af skabelonforberedelse og bekræftelse af vellykket in vitro-transskription og RNase H-kavalergang. Storskalaproduktion, herunder HPLC-rensning, påfyldning af NMR-rør og bekræftelse af RNA-foldning. I tilfælde af isotopmærket syntese skal der udføres en ikke-mærket rensning til gradientoptimering samme dag. NMR karakterisering af kropsbygning dynamik med R1ρ eksperimenter. Hvert trin kan udføres uafhængigt, f.eks. Forkortelser: IVT = in vitro transskription; HPLC = højtydende væskekromatografi; NMR = nuklear magnetisk resonans; RD = afslapning spredning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Formålet med denne protokol er at give praktiske detaljer og kritiske parametre til undersøgelse af kropsbygningsdynamik med 1H R1ρ afslapningsspredning i RNA hårnålemolekyler. Efter at have givet en detaljeret protokol over design, syntese og ionbytning HPLC-rensning af et mål-RNA, der kan udføres ved hjælp af alle, nogle eller ingen NTP'er som 13C /15N-mærkede versioner, er arbejdsgangen for færdiggørelse af NMR-prøven og bekræftelse af konformationel udveksling med NMR-spektroskopi blevet beskrevet. Endelig er detaljerne for opsætningen af 1H R1ρ RD-eksperimenter på et Bruker NMR-spektrometer beskrevet (figur 1). Protokollen giver hvert trin til at oprette 1D-versionen for mærkede prøver og yderligere kommentarer og en tabel til justering for opsætningen af SELOPE-versionen (Tabel 2). Efter protokollen diskuteres kritiske trin og alternative ruter til prøveforberedelse og 1H R1ρ RD-opsætning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA er et meget fleksibelt biomolekyle, hvor ændringer i strukturer spiller afgørende roller i de funktioner, som RNA-molekyler udfører som cellulære budbringere og modulatorer. Mens disse dynamiske tilstande forbliver skjult for de fleste strukturelle metoder, R1ρ afslapning spredning (RD) spektroskopi gør det muligt at studere kropsbygning dynamik i mikro-til millisekund regime på atomare opløsning. Brugen af 1H som den observerede kerne udvider yderligere den dækkede tidsordning og giver direkte adgang til brintbindinger og baseparring.
De udfordrende trin i en sådan undersøgelse er prøveforberedelse med høj renhed og højtydende prøve, potentielt 13C- og 15N-mærket, samt opsætning af eksperimenter og montering af data til udvinding af befolkning, valutakurs og sekundær struktur i den tidligere usynlige tilstand. Denne protokol giver afgørende praktiske trin i prøveforberedelsen for at sikre, at der udarbejdes en passende RNA-prøve og opsætning af 1H R1ρ-forsøg med både isotopisk mærkede og ikke-mærkede RNA-prøver.

Protokollen for RNA-produktion letter rensning gennem generering af udskrifter med høj renhed. Figur 3A viser resultaterne af flere kavalergangsreaktioner af tandemudskrifter, der giver både vellykkede og mislykkede reaktioner. Bane 1 viser det optimale tilfælde af en fuldt kløvet udskrift med kun svage spor af sideprodukter. Lane 2a viser ufuldstændig kavalergang, som kan løses ved re-annealing og tilføjelse af mere RNase H (Lane 2b, trin 2.1.2). RNA-konstruktionerne af bane 1, 2a og 2b er de samme. Prøven i bane 3 viser mislykket kavalergang. Fejlfinding af denne reaktion ville indebære en kontrol af kavalergang guide sekvens, renhed af DNA-skabelon, og udglødning temperaturer. Potentielt skal RNase H-kavalergang udføres efter T7 IVT som vist for prøve 2.
Prøven i bane 4 viser en betydelig mængde kavalergang sideprodukter, som er vanskelige at fjerne via ion-udveksling HPLC. Fejlfinding af en sådan prøve kan omfatte (a) sænkning af temperaturen, mængden af RNase H eller reaktionstid, (b) reduktion af reduktionsgradient og injektionsvolumen og forsøg på at adskille målfraktionerne fra sideprodukterne. Karlsson og al.31har drøftet yderligere oplysninger om , hvordan resolutionen kan øges i forbindelse med udveksling af HPLC-rensning . HPLC adskiller mål-RNA'et fra længere eller kortere nukleinsyrer og protein eller forurenende stoffer med lille molekyle. Figur 3B viser det optimale resultat for ionbytteren HPLC-rensning. Elueringsgradienten bør vælges således, at mål-RNA-arten udvisker mindst et kolonnevolumen (i dette eksempel: 35 mL) efter den næste mindre art og et kolonnevolumen før den næste større art.
Mindre arter i denne metode omfatter enkeltkerner, aborterende produkter (8-12 nt), 3' og 5' afstandssekvenser (5-14 nt) og kavalergangsguide (12 nt kimær nukleinsyre), mens længere sekvenser potentielt er uraved tandem repeats og plasmid. Når en velsepareret elueringstop er opnået, kan rensningen skaleres op til hvad der svarer til ~ 20 mL IVT-reaktion pr. Injektion. Den korrekte fold af en RNA-prøve er afgørende for RD-eksperimenter og skal bekræftes før hver måling. Figur 4 viser et A-mærket 22-mer RNA før foldeprotokollen i trin 2.4 (blå) blev anvendt, og den samme prøve efter den korrekte foldning er opnået (rød). En Mc-Fold sekundær struktur forudsigelse (Figur 4C) foreslår den præsenterede hårnål struktur med 4 base par resulterer i 5 imino signaler.
Begge spektre i figur 4A bekræfter disse forudsagte signaler, om end med lidt forskellige relative intensiteter, hvilket indikerer, at nogle fejlfoldede strukturer (her en dimer) kan være problematiske at vurdere med kun 1H 1D-spektre. Et aromatisk 1H-,13C-HSQC-spektrum (Figur 4B) viser dog kun 3 af de aromatiske signaler for prøven før foldeprotokollen (blå), men alle 4 signaler for prøven, der er foldet i henhold til trin 2.4 (rød). Den prøve, der blev vist med blåt, dannede sandsynligvis en homodimer (struktur foreslået i figur 4D),som ville resultere i de samme iminosignaler som hårnålen. Signalet fra A13H2 synes udveksling-udvidet. Disse resultater bidrager til at fremhæve vigtigheden af foldebekræftelse med både imino- og aromatiske fingeraftrykseksperimenter før hvert RD-eksperiment. De 1H R1ρ pulssekvenser, der er beskrevet i denne protokol, gør det muligt at detektere dynamikken i det mellemliggende udvekslingssystem. I første omgang registreres en resonanskurve, og hvis der er dynamik for en bestemt rest, er en spredning synlig inden for de opnåede R2+REX-værdier, mens denne kurve er flad for rester uden udveksling.
Figur 5 viser repræsentative resonanskurver opnået for to forskellige H8-atomer i en syntetisk RNA-hårnål (Figur 5A), hvori G6H8-erfaringer udveksles (Figur 5C), mens A4H8 ikke(Figur 5B). Da udvekslingen er forholdsvis langsom i denne prøve (kEX = 292 ± 40 Hz), blev fordelen ved SELOPE-eksperimentet for at opnå lave SL-styrker udnyttet, og de to resonanskurver blev registreret ved hjælp af 1D-versionen af pulssekvensen. Den samme pulssekvens blev derefter brugt til at opnå off-resonansdata for restkoncentrationerne, der viste spredning i resonansprofilen. Figur 5D viser de opnåede R1ρ-værdier vs. offset, hvori en let asymmetri af kurven allerede angiver tegnet af Δω.
Dette bliver endnu tydeligere i R2+REX-plottet, hvor R1-bidraget fjernes ( figur5E). Højre kolonne i samme figur viser repræsentative on-resonanskurver opnået for to forskellige H8-atomer i en lidt anden syntetisk RNA-hårnål med hurtigere udveksling, hvor G6H8-erfaringer udveksles (Figur 5G), mens A4H8 ikke (Figur 5F). Den hurtigere valutakurs (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) gjorde det muligt at registrere rd-optagelser af alle aromatiske protoner på én gang ved hjælp af SELOPE 2D-versionen for at opnå både on- og off-resonansdata (G6H8-data, der vises i figur 5H, I).
Generelle id'er for positive og negative resultater Positive resultater i tandem IVT og RNase H kavalergang kan identificeres som følger: 1) Målet bandet er det stærkeste bånd i denaturering PAGE gel. 2) Der er ingen eller kun svage bånd omkring hovedbåndet. 3) Der er ingen eller kun svage højere molekylvægtarter. 4) HPLC-kromatogrammet viser en godt adskilt top af mål-RNA'et. 5) Når der udtages prøver af hovedtoppen, vises der kun ét bånd på en denaturerende PAGE-gel.
Negative resultater i tandem IVT og RNase H kavalergang til stede som følger: 1) Nej eller bare en svag hovedbånd er synlig på en denaturering PAGE gel. 2) Et mønster af høj molekylvægt arter fra RNA tandem gentagelser er synlig. 3) Selv om hovedbåndet er til stede, er bånd med lignende intensitet over eller under hovedbåndet inden for ± 3 nt.
En godt foldet prøve kan identificeres som følger: 1) Antallet af observerede imino protoner svarer til antallet afimino protoner, der forventes af en sekundær struktursimulering (f.eks. 2) Syn G-U wobble base par i en UUCG loop (hvis til stede) er synlig på ~ 9,5 ppm, undertiden kun synlig ved lavere temperatur. Yderligere fingeraftryk af UUCG-sløjfen er blevet beskrevet af Fürtig og kolleger40. 3) Det aromatiske fingeraftryk er i overensstemmelse med en tidligere tildelt prøve, der er blevet bekræftet at folde korrekt (Figur 4C).
En fejlfoldet eller nedbrudt prøve kan identificeres som følger: 1) Der er flere imino-signaler end en sekundær struktursimulering forudsiger (BEMÆRK: færre iminosignaler indebærer ikke nødvendigvis fejlfoldning, da lukning af basispar ofte ikke er synlige, og kropsudveksling udvider linjer). 2) Fravær af imino signaler. 3) Smalle signaler af høj intensitet i aromatisk region, der angiver enkelte nukleotid nedbrydningsprodukter. 4) Afvigelse mellem imino- eller aromatiske signaler og en referenceprøve af bekræftet foldning (figur 4C).
Et atom, der ikke viser nogen udveksling i den påviselige tidshorisont, kan identificeres som følger: 1) fra en flad RD-profil (på grund af det manglende REX-bidrag, der varierer med den anvendte SL-effekt)(figur 5B og figur 5F). 2) Der skal udvises forsigtighed i forbindelse med langsom mellemliggende udveksling, når kEX og Δω er af samme størrelsesorden. I så fald kan resonansbidraget være meget lille, som det fremgår af figur 5C (i dette tilfælde er de monterede parametre kEX = 292 ± 40 Hz og Δω = 112 ± 4 Hz). Hvis du er i tvivl, kan en lav SL off-resonans kurve registreres til verifikation.
Et atom, der viser udveksling i den mellemliggende tidsskala, kan identificeres 1) fra en ikke-flad afslapningsspredningsprofil i et on-resonans RD-eksperiment(figur 5B og figur 5F); 2) en bredere linewidth i HSQC eller SELOPE eksperiment kan også være en indikator for udveksling.
Velvalgte SL-effektværdier for kurver for off-resonans(figur 5E,F): 1) har et betydeligt kEX-bidrag i on-resonanskurven (udvalgte SL-effektværdier er angivet i figur 5C og figur 5G). 2) Da off-resonanskurver måles for mindst 3 SL-effektværdier, skal de valgte SL-effektværdier spredes ud over regionen af on-resonanskurven med kEX-bidrag. 3) Bly til ikke-flade R2+REX kurver efter Laguerre pasform (f.eks Figur 5D: SL styrker 25, 50 og 75 Hz; Figur 5E).
Dårligt udvalgte SL-effektværdier for kurver uden for resonans (Figur 5E, F) fører til flade R2+REX-kurver efter Laguerre-pasformen. Et eksempel er vist i figur 5E, hvor 100 Hz off-resonanskurven er meget flad og derfor ikke giver væsentlige oplysninger om Δω.
Indikationer for roterende-frame nukleare Overhauser effekt (ROE) artefakter: 1) Δω opnået fra off resonans kurver matche kemiske skift af protoner i rumlig nærhed / protoner, som viser en cross peak med toppen af interessen for den nukleare Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) spektrum. (f.eks.viser figur 5I brede off-resonanskurver som forventet for hurtig-mellemliggende udveksling, men kurverne har også skarpere træk, f.eks.ved -3000 Hz og +1500 Hz. Disse er meget sandsynligt på grund af en ROE artefakt snarere end et kemisk skift for denne H8 i en anden konform). 2) Laguerre fit virker, men fungerer ikke godt (giver høje fejl eller fysisk umulige værdier) for en on-resonans og mindst 3 off-resonans kurver, selv om eksponentielle blev opnået fra forsøg med høj SINO (>20) (f.eks kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Ofte passer hver SL individuelt godt, men at montere dem sammen giver en meget højere fejl; den modsatte adfærd forventes for en sand ophidset tilstand.
Indikationer for "sand" udveksling Δω: 1) Δω opnået fra kurver uden for resonansen stemmer ikke overens med kemiske skift af protoner i geografisk nærhed/protoner, som viser en krydsspids med den største interesse for NOESY-spektret (f.eks. figur 5E). 2) Laguerre fit giver lave fejl for en on-resonans og mindst 3 off-resonans kurver(f.eks Figur 5E vs. Figur 5I, se billedtekst for at få passende resultater).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Figur 3: Prøveproduktion ved T7 tandem IVT og RNase H kavalergang reaktion. Stigehøjde refererer til RNA referencer, 12 * refererer til kimære kavalergang guide. Bane 1: Succesfuld generation af et 20 nt mål-RNA. Få kortere og længere produkter er til stede. Lane 2a: Ufuldstændig kavalergang af tandem udskrift. Selvom HPLC-rensning er mulig, vil meget materiale gå til spilde. Vognbane 2b: Fortsat RNase H-kavalergang på Bane 2 giver en ren prøve klar til HPLC-injektion (identisk med Vognbane 1). Bane 4: RNase H kavalergang var stort set mislykket, og ingen mål band blev produceret. Den fulde længde tandem udskrift er stadig synlig på 600 nt. Lane 5: Et mål band blev produceret, men en stærk -1 band er til stede. Selvom HPLC kan udføres, er omhyggelig fjernelse af sideproduktet nødvendig. (B) Eksempel på en vellykket HPLC-injektion. Toppen ved 38 min indeholder rent RNA af mållængden, mens længere og kortere produkter er godt adskilt fra mål-RNA'et. Panel B er blevet ændret fra 21. Forkortelser: IVT = in vitro transskription; HPLC = højtydende væskekromatografi; nt = nukleotider; AU = vilkårlige enheder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Figur 4: Eksempel på en RNA-hårnål før (blå) og efter (rød) foldetrinnet 2.4 (se protokollen) i NMR. (A) Imino-regionen i et 1H-1D-spektrum af et A-mærket 22-mer RNA. Forventede områder for basisparidentitet af iminosignaler er angivet med gråt nedenfor. (B) 1H,13C-HSQC-spektret af RNA's aromatiske resonanser fra panel A. Prøven efter foldning (rød) viser 4 signaler som forventet, mens prøven før foldning (blå) kun viser 3 signaler. (C)Mc-Fold forudsigelse af 22-mer RNA som en hårnål. Der kan forventes fem iminosignaler fra denne sekundære struktur, som kan findes i begge prøver i panel A. (D) Foreslået struktur af en homodimer dannet af 22-mer RNA, hvilket resulterer i de samme 5 basepar som hårnålestrukturen. Forkortelser: NMR = nuklear magnetisk resonans; 1D = endimensional; HSQC = heteronuklear enkelt kvantekorrelation; ppm = dele pr. million. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Figur 5: 1H R1ρ REPRÆSENTATIVE resultater for to forskellige konstruktioner baseret på en RNA hårnål. (A) Den venstre kolonne viser resultater opnået på RNA med et C-G basepar over det bulede U, mens højre kolonne viser resultater opnået på en prøve, hvor basisparret i stedet blev skiftet til G-C. (B) og (F) viser flade spredningsprofiler som anskaffet for A4H8 for de to konstruktioner, hvilket ikke indikerer nogen kropsbygningsudveksling. (C–E) udviser on-resonans, off-resonans og monterede data, der er indhentet for G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-pasformen fører til følgende resultat: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, k EX =292 ± 40 Hz, p ES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) viser on-resonans, off-resonans og monterede data opnået for G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-pasformen fører til følgende resultat: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43,502 ± 38,478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Dette tal blev ændret fra den 20. Forkortelse: SL = spin lock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Vi præsenterer en protokol til måling af mikro- til millisekundsdynamik på 13C /15N-mærket og umærket RNA med 1H R 1ρ afslapningsspredning nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Fokus for denne protokol ligger i prøveforberedelse og opsætning af NMR-eksperimenter med høj renhed.

Praktiske aspekter af prøveforberedelse og opsætning af 1H R1ρ Afslapningsspredningseksperimenter af RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Denne protokol beskriver RNA prøve forberedelse og NMR setup for proton R1rho afslapning spredning målinger for at undersøge bekræftelse udveksling i RNA molekyler. Da protoner er sonderet, behøver metoden ikke isotopmærkning og kan få adgang til strukturelle funktioner som forskudt baseparring direkte. Pipetten er ret modulopbygget i den forstand, at R1rho afslapningsspredning kan måles, selvom prøven er produceret med en anden metode.Begynd med at forberede plasmidprøven og oprette en in vitro transskription og kavalergangsreaktion som beskrevet i tekstmanuskriptet. Inkuber reaktionen ved 37 grader Celsius i en time. Derefter fortyndes en mikroliter af prøven ti gange i lasteopløsning.Og kør en mikroliter på en denaturerende PAGE gel. Hvis kavalergangsreaktionen er vellykket, skaleres reaktionen på det ønskede volumen og køres natten over. Kør derefter en anden denaturerende PAGE gel og vurdere, om kavalergang reaktion er afsluttet.I tilfælde af ufuldstændig kavalergang opvarmes reaktionsopløsningen i en konventionel mikrobølgeovn ved 450 watt i 15 sekunder. Derefter afkøles opløsningen langsomt til 37 grader Celsius i 40 minutter for at reanneal RNA og kavalergang guide. Og bemærk dannelsen af et nyt bundfald.Tilføj mere uorganiske pyrophosphatase og RNase H.Incubate reaktionen i en til tre timer ved 37 grader Celsius. Bekræft derefter færdiggørelsen af kavalergangsreaktionen med denaturering PAGE. Når RNase H-kavalergangsreaktionen er afsluttet, skal du slukke for reaktionen ved at tilsætte EDTA til en 50 millimolar endelig koncentration.Og vortex grundigt. Opløsningen filtreres gennem et 0,2 mikron sprøjtefilter. Og koncentrer opløsningen på et volumen, der kan injiceres i et HPLC-system til rensning.Før du tilfører den koncentrerede og rensede prøve til NMR-røret, skal røret rengøres ved at skylle med rigeligt vand. Derefter RNase dekontaminering reagens, vand og 95% ethanol. Efter den endelige skylning med vand, lad det tørre.Skyl stemplet med vand og brug en fnugfri aftørring til at rengøre med RNase dekontamineringsreagens og 95% ethanol. Efter tørring af røret og stemplet tilsættes 10%D2O til NMR-prøven. Brug en stor pipettespids til at overføre RNA-prøven til NMR-røret og flyde den langs siden af rørvæggen.Sæt stemplet i røret ved at skubbe det ned med en hurtig vridning bevægelse for at fjerne luftbobler, og træk derefter stemplet langsomt op uden at skabe nye luftbobler. Og ordne det med paraffin voks film. Opret et nyt datasæt baseret på et aromatisk protonkul hsqc-datasæt, der bruges på fuldt mærkede RNA-prøver til RNA-tildeling.Angiv de generelle parametre og RD-specifikke parametre. Sæt derefter proton spin lock power til 1,2 kilohertz til test. Generer en test vd-liste med kun én post, nul millisekunder, angiv TDF1 til én, og opdater D30 for at køre et testspektrum.Når du har oprettet en test vd-liste, skal du opdatere D30 og TDF1. Og plot intensiteten af toppen for forskellige spin lock længder. Identificer den spinlåslængde, hvor intensiteten af den oprindelige top falder til en tredjedel.Ud fra resultatet af testkørslerne skal du oprette den endelige vd-liste, der skal bruges i eksperimentet. Vælg antallet af scanninger, så listens svageste top har et signal til støjforhold på mindst 10. Resultaterne af flere kavalergang reaktioner tandem udskrifter er vist her.En 20 nukleotid mål RNA blev genereret i en vellykket reaktion. Mislykkede reaktioner resulterede i ufuldstændig og mislykket kavalergang af prøven. HPLC-injektionen af RNA-prøven afslørede et højdepunkt for rent mål-RNA på 38 minutter.Mens længere og kortere produkter var godt adskilt fra toppen af interesse. Analyse af RNA hårnål viste, at antallet af observerede imino protoner matchede antallet af imino protoner forventes fra en sekundær struktur simulering. Proton carbon HSQC spektrum af aromatiske resonanser af RNA viste fire signaler efter foldning.Og kun tre signaler før foldning. I repræsentanten om resonanskurver opnået for to forskellige H8-atomer og to forskellige syntetiske RNA-hårnåle oplever G6H8 bekræftelsesudveksling. Mens A4H8 ikke gør.For G6H8 blev de farvede spin lock-kræfter valgt, og der blev registreret resonansdata. I CG konstruere, hvor udvekslingen er langsom, R1rho række værdier versus offset plot allerede vist en lille asymmetri af kurven, der angiver tegn på den kemiske skift forskel delta omega. Dette bliver endnu tydeligere i R2 plus REX-plottet, hvor R1-bidraget fjernes.På den anden side, konstruere GC erfaringer hurtigere udveksling og R1rho værdier versus offset plot præsenteret en bredere kurve, hvor udvindingen af delta omega bliver mindre indlysende, selv i R2 plus REX plot. Når RNA-dynamikken er belyst, kan staterne karakteriseres og fanges. Disse fangede tilstande kan for eksempel testes i biologiske assays.Denne metode giver os mulighed for at observere funktionelle, relevante baseparringsskift i et aktivt mikroRNA miRNA-kompleks, loop-omlejringer i ribosomalt RNA og baseparsstabilitet på enkeltkernetidbuler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 år N CPMG Afslapning Spredning til undersøgelse af protein kropsbygning Dynamics på μs-ms Tidshorisont

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Prøvepræparat og relativ kvantitet ved hjælp af reduktiv methylering af aminer til peptidomicsstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Prøvepræparat ved hjælp af en Lipid Monolayer-metode til elektronkrygrafiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Paramagnetisk afslapningsforbedring til påvisning og karakterisering af selvforeninger af iboende uordnede proteiner

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...