We danken de eiwitwetenschappelijke faciliteit (PSF) van het Karolinska Institutet voor de expressie en zuivering van T7 RNA polymerase en E. coli RNase H, Martin Hällberg voor de gulle gift van de anorganische fosfatase en het hele Petzoldlab voor waardevolle discussies. We danken Luca Retattino voor de voorbereiding van de U-bulge constructies en Emilie Steiner en Carolina Fontana voor hun bijdrage aan macro's en passende scripts. We erkennen het Karolinska Instituut en de Afdeling Medische Biochemie en Biofysica voor de ondersteuning van de aankoop van een 600 MHz spectrometer en positiefinanciering (KI FoAss en KID 2-3707/2013). We zijn dankbaar voor de financiële bijdrage van Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 en FFL15-0178) en De Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald en Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 en 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 en M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. erkent financiering via een Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF projectnr. 747446).

K.P. is consultant van Arrakis Therapeutics, een bedrijf dat kleine moleculen ontdekt die gericht zijn op RNA.

Het hierin gepresenteerde protocol is een synthese van verschillende protocollen die eerder zijn gepubliceerd in de vorm van onderzoeksartikelen10,20,21,31. Daarom kunnen segmenten van het protocol worden toegepast, terwijl andere kunnen worden uitgewisseld naar de voorkeur van de lezer. De R 1ρ-metingen kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd op een RNA-monster dat met elke methode is geproduceerd, aangezien wordt uitgegaan van vouwen en homogeniteit van de lengte. Bovendien bevat het protocol geen informatie over resonantietoewijzing van de RNA-sequentie-een stap die vereist is voor RD-experimenten - aangezien dit uitgebreid is behandeld in eerdere literatuur19,37,38. Gedeeltelijke, segmentale of sitespecifieke etiketteringsschema's36,41,42,43,44 zijn benaderingen om resonantietoewijzing te vergemakkelijken of de overlapping van resonanties te verminderen die van belang zijn voor RD-experimenten en die uitvoerig in de literatuur zijn beschreven. Deze methode maakt het gebruik van uniforme etikettering van elke nucleotide-identiteit mogelijk, wat resonantietoewijzing al aanzienlijk kan vereenvoudigen.
De hier gepresenteerde IVT-methode overwint bekende problemen met sequenties en etikettering, verhoogt de opbrengst en verlaagt de kosten en werktijd in vergelijking met andere methoden. Het gebruik van de virale initiatiesequentie vermindert de behoefte aan reactieoptimalisatie, wat een bekend probleem in het veld is dat tijdrovend kan zijn om uit te voeren en slechts enkele kopieën van het transcript oplevert in het geval van niet-G-initiatie. Het T7 IVT- en RNase H-decolleté van het tandemtranscript kan tegelijkertijd in hetzelfde vat worden uitgevoerd. Een patroon van multimerische tandemherhalingen is te zien op een denaturering PAGE gel tijdens de reactie, die samensmelt tot een enkele band op de doel-RNA na voltooiing van de RNase H-reactie(figuur 3A,rijstroken 1 en 2b). Typische opbrengsten met deze methode variëren tussen 30 en 70 nmol RNA per 1 ml IVT. Toch komt de methode op basis van RNase H-decolleté van tandemherhalingen niet zonder bepaalde problemen op zich. De RNase H-decolletéreactie gaat vaak niet naar voltooiing wanneer deze gelijktijdig met T7-transcriptie wordt uitgevoerd(figuur 3A,baan 2a).
De scheiding van tandemeenheden kan worden voltooid door de decolletégeleider in het transcript te gloeien en meer RNase H toe te voegen(figuur 3A,baan 2b, stap 2.1.2). Omdat de verwarming van grote volumes traag is en leidt tot Mg2+-gekatalyseerde hydrolyse van RNA, werd een conventionele magnetron gebruikt, die het monster verwarmt tot >95 °C in 10-15 s. Nadelige effecten op de geproduceerde monsters zijn tot nu toe niet waargenomen. Sommige constructies vertonen een kleine tweede band die niet kon worden geëlimineerd door de optimalisatie van de reactieomstandigheden(figuur 3A,baan 4). Meestal zijn deze vrij duidelijk zichtbaar als schouder in het HPLC-chromatogram, als een goed geoptimaliseerd elutiegradiënt wordt gebruikt en kan worden verwijderd (stap 2.2.5). De volgende discussie is bedoeld om kritische stappen in het protocol te benadrukken, met name met betrekking tot het verkrijgen van hoogwaardige gegevens die een interpretatie van de conformatiedynamiek mogelijk maken.
RNase besmetting Extracellulaire RNases zijn alomtegenwoordig, zeer stabiel en vormen de grootste bedreiging voor de stabiliteit van NMR-monsters op lange termijn. Daarom is het cruciaal om in een RNase-vrije omgeving te werken en alle reagentia en plasticware RNase-vrij te houden. Het gebruik van filtertips en misschien zelfs gezichtsmaskers wordt aanbevolen. Dit is specifiek belangrijk na HPLC-zuivering. NMR-monsters die besmet zijn met RNases vertonen meestal smalle pieken zichtbaar in 1H-1D spectra na dagen of weken als gevolg van single-nucleotide afbraakproducten. Een dergelijk monster is niet geschikt voor R1ρ-metingen. 
NMR-monster Vanwege het sterk geladen karakter kan RNA worden gebruikt in hoge concentraties zonder neerslag in vergelijking met de meeste eiwitten. Het gebruik van Shigemi NMR-buizen (zie de tabel met materialen)is voordelig omdat ze het centreren van het sterk geconcentreerde monster in het midden van de spoel mogelijk maken, terwijl ze nog steeds ideale shimming- en vergrendelingsomstandigheden bieden vanwege de gevoeligheidsgematchte glazen bodem en plunjer. Op deze manier wordt de B1-inhomogeniteit verminderd, waardoor smallere lijnen ontstaan. Het typische monstervolume in een NMR-buis is 250 μL en de typische concentratie is 1-2 mM. Monsters onder 500 μM worden niet aanbevolen voor RD-experimenten, omdat het experiment te lang zou duren en een goede shim. Evenzo wordt het monstervolume onder 200 μL niet aanbevolen omdat een goede shim- en veldstabiliteit (lock) vereist is. Bij het plaatsen van de zuiger is het van cruciaal belang om de vorming van bellen in het monster te voorkomen (stap 2.4.5). Als dit niet goed is bevestigd, kan de zuiger naar beneden glijden in het monster, waardoor het detecteerbare volume wordt verminderd. Bovendien kunnen snelle temperatuurveranderingen leiden tot de vorming van nieuwe bellen in het monster. Daarom moet voorzichtig worden omgegaan bij het transport van het monster en bij het wijzigen van de temperatuur van de sonde in de NMR-spectrometer. Controleer het monster op bellen wanneer u na een langere periode opnieuw meet.
RNA vouwen Dynamische RNA-moleculen kunnen in meerdere conformaties bestaan wanneer ze niet goed worden gevouwen. Hoewel smelttemperaturen van secundaire structuren slechts iets boven de kamertemperatuur kunnen liggen, wordt een grondige verwarmings- en snapkoelingsprocedure aanbevolen vóór de meting. Sterk geconcentreerde haarspeldmonsters die onder kinetische controle vouwen (verwarming en snapkoeling) kunnen in de loop van de tijd homodimeren vormen, wat een strenge controle van het vouwen van RNA vóór elke NMR-meting vereist. Als het gemeten RNA geen haarspeldstructuur is, maar een RNA-duplex, moet langzaam vouwen onder thermodynamische controle worden toegepast.
In dit geval moet het koelproces na verhitting binnen het bereik van uren liggen, terwijl het RNA wordt gebruikt bij het uiteindelijke volume en de concentratie in het NMR-monster. Een eerste telling van verwachte imino- en aromatische resonanties kan inzicht geven in de homogeniteit van het monster. Als het monster er niet naar verwachting uitziet, moet het opnieuw worden gevouwen. Mg2+ (toegevoegd als chloridezout) kan helpen bij het vouwen van RNA-structuren45. In de praktijk dient de vouwbesturing als vergelijking met een monster dat is gebruikt om de NMR-resonanties ten minste gedeeltelijk toe te wijzen en de secundaire structuur experimenteel op te lossen.
Spin lock power en verwarming overwegingen In het geval van het uitvoeren van de 1H R1ρ RD-experimenten als 2D-overzichtsexperimenten, mag het SL-vermogen niet lager zijn dan 1,2 kHz. De radiofrequentiezenderfrequentie moet in het midden van het ppm-gebied van de pieken van belang worden geplaatst(bijv.7,5 ppm voor aromatische protonen). De bandbreedte van 1,2 kHz zal dan groot genoeg zijn om deze protonen te spin-locken zonder grote off-resonantie-effecten. Dergelijke effecten kunnen worden geïdentificeerd in het RD-profiel. Als ze zich voordoen, stijgen de R2+REX-waarden in plaats van dalen met toenemende SL-vermogenswaarden, vooral voor een laag SL-vermogen. Controleer of de berekende SL-vermogenswaarden overeenkomen met het vermogen dat aan het monster wordt geleverd. In de praktijk kan berekend SL-vermogen worden gebruikt als de 1H 90° harde puls zorgvuldig is gekalibreerd op nieuwere spectrometers; dit kan echter worden gecontroleerd door SL-vermogen te kalibreren voor elke gewenste bandbreedte.
Het bereik van sl-vermogen, dat kan worden gebruikt in 1H R1ρ RD-experimenten, is zeer breed, wat leidt tot variërende monsterverwarming (1,2 kHz tot 15 kHz voor HSQC voor HCP-gebaseerde sequenties en 50 Hz tot 15 kHz voor SELOPE-experimenten). Ongelijke monsterverwarming kan worden gedetecteerd als een kleine verandering in chemische verschuiving bij het vergelijken van 1Ds verkregen voor SLs met laag vermogen versus. hoog vermogen SLs. Dit effect wordt meestal niet overwogen in warmtecompensaties in R1ρ experimenten op heteronuclei. Warmtecompensatie in die experimenten wordt meestal ingesteld om te corrigeren voor verschillende verwarming vanwege de verschillende spinslotduur die is gespecificeerd in de vd-lijst van elke spinslotvermogensreeks. Speciaal voor het SELOPE-experiment moet een tweede warmtecompensatie worden gebruikt voor alle toegepaste SL-sterktes zoals beschreven in20.
vd-lijstoverwegingen Zoals eerder vermeld, moet de vd-lijst een tijdspunt bevatten dat lang genoeg is om een aanzienlijk verval van de intensiteit te verkrijgen (idealiter tot 30% van het oorspronkelijke signaal, of zo laag mogelijk als het niet mogelijk is om een verval van 70% binnen de specificaties van de sonde te bereiken). Hoewel de vd-lijst is geoptimaliseerd voor een laag SL-vermogen (1,2 kHz), moet deze vd-lijst ook worden getest met het hoogste SL-vermogen dat moet worden gebruikt(bijv.15 kHz). Dit komt door het feit dat voor pieken met een aanzienlijke REX-bijdrage het verval veel langzamer zal zijn bij een hoog SL-vermogen. Dus een voldoende verval moet ook worden geverifieerd bij een hoog SL-vermogen. Hetzelfde moet worden overwogen voor verval bij hoge offsets in off-resonantie experimenten. Het ideale maximale tijdspunt van de vd-lijst kan aanzienlijk verschillen voor de verschillende regio's van het dispersie-experiment. In dat geval kunnen meer punten in de vd-lijst worden opgenomen en kunnen de langere vd-lijstpunten voor een hoger SL-vermogen of hogere offsets tijdens de analyse, op basis van de lage SINO waarnaar ze zullen leiden, worden weggegooid. Over het algemeen moeten 5-8 vd-lijstpunten worden beschouwd als het kunnen herkennen van potentiële artefacten die leiden tot niet-exponentiële vervalsen zoals J-koppeling (zie hieronder).
1D-HCP selectiviteit overwegingen Speciale zorg moet worden genomen bij het uitvoeren van de HCP-gebaseerde 1D-versie als er nog een piek overlapt met de piek van belang in de 1H-dimensie van het 2D HSQC-gebaseerde experiment. HCP-gebaseerde transfers zijn zeer, maar nooit 100% selectief, en het kan daarom gebeuren dat een andere piek bijdraagt aan de intensiteit en het vervalgedrag van de piek van interesse in de 1D. Een indicatie hiervoor zou een verschil zijn in R1ρ-waarden met onresonantie die zijn verkregen met behulp van de 1D- en 2D-versies van het gelabelde experiment.
ROE overwegingen: Voor off-resonantiecurven van atomen met langzame tussenuitwisseling kunnen ROE-artefacten worden geïdentificeerd op basis van een vergelijking van de verkregen Δω met een NOESY- of ROESY-spectrum. Als een kruispiek kan worden geïdentificeerd bij een chemisch verschuivingsverschil dat overeenkomt met Δω, dan kan de waargenomen opgewekte toestand in feite een ROE-artefact zijn ( er werdenbijvoorbeeldROE's gevonden tussen aromatische protonen, die allemaal in hetzelfde chemische verschuivingsbereik liggen en daarom worden gedekt door die off-resonantiecurven20). Uit ervaring leidde dit altijd tot slechte pasvormen met grote fouten, mogelijk omdat de ROE niet hetzelfde patroon volgde als REX met toenemend SL-vermogen. De situatie wordt moeilijker voor middeld-snelle uitwisseling. Hoewel de on-resonantiecurve (uit vergelijking met 13C-gegevens verkregen op de naburige kern) nog steeds representatief is voor het uitwisselingsproces tussen de GS en ES, wordt de off-resonantiecurve beïnvloed door meerdere ROE-artefacten.
In dat geval is de SL-kracht om het uitwisselingsproces te detecteren groter (>1,5 kHz) en beslaat daarom een groter aantal protonen omdat off-resonantiecurven zich uitstrekken over chemische verschuivingsverschillen van verschillende ROE-kandidaten (voor H8 zouden dit zijn: aminoprotonen bij ca. ±1000 Hz, H5/H1's bij ca. -1200 Hz, imino-protonen bij ca. 3500 Hz). Tot nu toe is geen methode gevonden om deze ROE-artefacten te onderdrukken (behalve het gebruik van gedeeltelijk gedeutereerde nucleotiden46), en off-resonantiegegevens mogen niet worden geregistreerd voor snelle tussentijdse uitwisseling, omdat met deze methode geen betrouwbare informatie over de werkelijke Δω kan worden geëxtraheerd, als NOE/ROE-bijdrage niet kan worden uitgesloten via NOESY-spectra.
J-Coupling (Hartmann-Hahn) overwegingen Hoewel on-resonantiecurven voor homonucleaire J-gekoppelde protonen, zoals H6, met succes zijn geregistreerd10,20, moet speciale zorg worden genomen voor off-resonantiemetingen, vooral voor laag SL-vermogen, omdat Hartmann-Hahn matching-omstandigheden een breed scala van de onderzochte offsets kunnen omvatten. Hartmann-Hahn artefacten kunnen worden geïdentificeerd als oscillaties op het exponentiële verval of toenemende R2+REX-waarden met toenemende SL-sterktes in on-resonantie RD plots20.

RNA 's vervullen een veelheid aan regulerende1, katalytische2en structurele3 functies in de cel , waarvan vele gecorreleerd zijn met een flexibele moleculaire structuur en ingewikkelde veranderingen van die structuren4,5,6,7. Laagbevolkte toestanden blijven onzichtbaar voor de meeste methoden van structuurbepaling of staan de studie van deze verborgen toestanden bij hoge atoomresolutie niet toe. Solution-state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopie combineert beide aspecten door toegang te bieden tot individuele atoomkernen en biedt een grote toolbox van experimenten gericht op dynamiek door alle tijdregimes8. RD NMR-experimenten bieden toegang tot conformationele uitwisseling in de tussenliggende tijdschaal , waarbij veranderingen in basiskoppelingspatronen en lokale structurele herschikkingen kunnen worden verwacht5,9,10,11,12,13,14. RD-experimenten worden uitgevoerd als lange R2-metingen in de vorm van een Carr-Purcell-Meiboom-Gill-pulstrein15 of als ontspanningsmetingen in het roterende frame, R1ρ RD-experimenten16genoemd.
Hoewel beide kunnen worden gebruikt om populatie- en wisselkoers- en chemische verschuivingsverschil naar de kleine toestand te extraheren, geven R1ρ RD-experimenten ook het teken van het chemische verschuivingsverschil van de opgewekte toestand. Dit maakt een gevolgtrekking op secundaire structuur mogelijk, die sterk correleert met chemische verschuiving in RNA-structuren17. De chemische verschuiving is een goede indicator van helicity in het geval van aromatische protonen en koolstof op de nucleobases, van basiskoppelpartners voor imino-protonen en van suikerbobbels op de C4' en C1'-atomen18,19. Opgemerkt moet worden dat onlangs een experiment met chemische uitwisselingsverzadigingsoverdracht (CEST) met een hoger spin lock (SL)-vermogen, waardoor de toepasbaarheid van het CEST-experiment werd verschoven naar snellere uitwisselingstijdschalen, werd gepubliceerd als alternatief voor het R1ρ RD-experiment voor systemen met één opgewonden toestand.
Hoewel 13C - en 15N-isotopen vaak zijn gebruikt om toegang te krijgen tot structurele uitwisseling , werd recent werk uit dit laboratorium aromatische en imino-protonen gebruikt als sondes voor conformationele uitwisseling9,10. Het gebruik van 1H als waargenomen kern brengt verschillende voordelen met zich mee, bijvoorbeeld toegang tot uitwisseling op snellere en langzamere tijdschalen, hogere gevoeligheid en kortere meettijden. Dit wordt verder vergemakkelijkt door de SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE) benadering, die toegang biedt tot aromatische protonen door decrowding van het eendimensionale (1D) spectrum met behulp van homonucleaire scalaire koppelingen, in plaats van een heteronucleaire magnetisatieoverdracht, en het elimineren van de noodzaak voor isotooplabels20. Dit protocol heeft betrekking op de meting in 1H R1ρ RD-experimenten van uniform 13C/15 N-gelabelde en niet-gelabelde monsters. Daarom presenteert dit artikel een monstervoorbereidingsmethode die het meest veelzijdig bleek te zijn voor verschillende monstervoorbereidingsbehoeften21 en bespreekt alternatieven in de laatste sectie van dit artikel (figuur 1).
Op dit punt moet de lezer er rekening mee houden dat andere monstervoorbereidingstechnieken aanvaardbaar zijn voor experimentenmet 1 H R1ρ RD en dat andere methoden voor structurele en functionele analyse kunnen worden uitgevoerd met de monsters die met de gepresenteerde techniek zijn gesynthetiseerd. 1 H R1ρ RD-experimenten vereisen hoge RNA-concentraties (idealiter >1 mM) en een hoge homogeniteit, zowel in RNA-lengte als structurele conformatie om een betrouwbare karakterisering van de moleculaire dynamica te garanderen. In vitro transcriptie (IVT) is de methode bij uitstek voor veel onderzoekers om 13C/15N-gelabelde RNA-monsters te produceren vanwege de beschikbaarheid van gelabelde nucleosidetrifosfaten (NTPs) en facile-opname in de enzymatische reactie22. De veel gebruikte T7 RNA-polymerase (T7RNAP)23 , 24,25 lijdt echter aan een lage homogeniteit van 5' in het geval van bepaalde initiatiesequenties26,27 en vaak ook 3' homogeniteit tijdens transcriptieafvloeiing28. Zuivering van de doel-RNA-soorten wordt duurder en bewerkelijker vanwege de behoefte aan grote hoeveelheden ~ 200 nmol. De hier gebruikte methode is eerder gepresenteerd , waarbij de voordelen in het algemeen werden besproken21. Kortom, het lost beschreven problemen op door een groter tandemtranscript te transcriberen dat vervolgens site-specifiek wordt gespleten door Escherichia coli RNase H, geleid door een chimerisch oligonucleotide29,30 (zie figuur 2 voor meer informatie).
De opname van een afstandsvolgorde aan de uiteinden van 5' en 3' van het tandemtranscript maakt het gebruik van een initiatiesequentie met hoge opbrengst en verwijdering van terminaloverhangen in de buurt van de linearisatieplaats van de plasmidesjabloon mogelijk (figuur 2B). De methode bleek de opbrengsten aanzienlijk te verbeteren, terwijl de kosten en arbeid werden verminderd, met het voorbehoud van een complexere sjabloonsynthese en de behoefte aan een extra enzym en oligonucleotide. De hoge specificiteit van RNase H-decolleté vergemakkelijkt de zuivering vanwege het gebrek aan RNA-soorten in een vergelijkbaar groottebereik. Het huidige protocol maakt gebruik van een ionenuitwisseling high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) stap die onlangs door dit laboratorium is gepubliceerd31, hoewel andere methoden mogelijke alternatieven zijn. 1 H R1ρ RD kan in het algemeen worden verkregen op gelabelde of niet-gelabelde monsters met twee respectieve pulssequenties, het "gelabelde" 1H R1ρ heteronucleaire single quantum correlation (HSQC)-gebaseerd experiment met een 13C indirecte dimensie10 en het "ongelabelde" 1H R1ρ SELOPE-gebaseerd experiment met een 1H indirecte dimensie20.
Deze tweedimensionale (2D) experimenten kunnen dienen als eerste controle, ongeacht of dynamiek op de R1ρ tijdschaal aanwezig is in het monster. Een overzicht van RD voor alle opgeloste pieken in de spectra kan worden verkregen en pieken van belang voor een grondigere RD-analyse kunnen worden geïdentificeerd. Dit betekent dat zelfs niet-gelabelde monsters kunnen worden gecontroleerd voordat een beslissing wordt genomen om een duurder, gelabeld monster te produceren. Zodra een piek met conformationele uitwisselingsbijdrage is geselecteerd om grondiger te worden bestudeerd, is het het beste om over te schakelen naar de 1D-versies van de bovenstaande experimenten (als de piek nog steeds kan worden opgelost) om zogenaamde off-resonance-experimenten uit te voeren. Voor de gelabelde versie wordt de HSQC-overdracht naar 13C vervangen door een selectieve heteronucleaire crosspolarisatie (HCP) stap zoals gebruikt in 13C R1ρ experimenten32,33,34,35, terwijl in het geval van het SELOPE-experiment het experiment gewoon als een 1D wordt uitgevoerd, wat vooral handig is voor H8- en H2-signalen die toch op de diagonaal in de 2D liggen. Een criterium voor de te gebruiken volgorde, op voorwaarde dat zowel een gelabeld als een niet-gelabeld monster beschikbaar is, is hoe goed de piek van belang in de twee experimenten is geïsoleerd.
Over het algemeen wordt het SELOPE-experiment aanbevolen voor RNA-monsters van maximaal 50 nucleotiden. Voor grotere RNA's zal de overlap groter zijn; structureel interessante nucleotiden komen echter vaak voor in chemische verschuivingsgebieden die minder overlappend zijn en nog steeds toegankelijk kunnen zijn in nog grotere RNA's. Een ander argument zou zijn dat in niet-gelabelde monsters geen J-koppeling plaatsvindt tussen 1H en 12C. Aangezien het minimale spinslotvermogen echter wordt gedefinieerd door het minimumvermogen dat wordt gebruikt om deze twee spins (~ 1 kHz) in het gelabelde experiment te ontkoppelen, maakt het niet-gelabelde experiment het gebruik van een breder scala aan SL-sterktes (Spin Lock) mogelijk en dus toegang tot een bredere tijdschaal van uitwisseling. Deze off-resonantie experimenten bieden aanvullende informatie aan kex, zoals populatie van de opgewekte toestand (alternatieve conformer), pES, evenals zeer waardevolle chemische verschuivingsinformatie in de vorm van Δω (het chemische verschuivingsverschil van de grondtoestand en de opgewekte toestand).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Figuur 1: Workflow van het gepresenteerde protocol. Voorbereiding vóór de daadwerkelijke grootschalige monsterproductie, bestaande uit sjabloonvoorbereiding en bevestiging van succesvolle in vitro transcriptie en RNase H-decolleté. Grootschalige productie inclusief HPLC-zuivering, vullen van NMR-buis en bevestiging van RNA-vouwen. In het geval van isotoopgelabelde synthese moet een niet-gelabelde zuivering worden uitgevoerd voor gradiëntoptimalisatie op dezelfde dag. NMR karakterisering van conformationele dynamica met R1ρ experimenten. Elke stap kan onafhankelijk worden uitgevoerd, bijv.de 1 H R 1ρRD-analyse kan worden toegepast op elk geschikt RNA-monster dat met een andere methode wordt geproduceerd. Afkortingen: IVT = in vitro transcriptie; HPLC = hoogwaardige vloeistofchromatografie; NMR = nucleaire magnetische resonantie; RD = ontspanningsdispersie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Het doel van dit protocol is om praktische details en kritische parameters te bieden voor de studie van conformatiedynamiek met 1H R1ρ ontspanningsdispersie in RNA-haarspeldmoleculen. Na het verstrekken van een gedetailleerd protocol van de ontwerp-, synthese- en ionenuitwisseling HPLC-zuivering van een doel-RNA die kan worden uitgevoerd met behulp van alle, sommige of geen NTPs als 13C/15N-gelabelde versies, is de workflow beschreven van het afronden van het NMR-monster en het bevestigen van de conformationele uitwisseling met NMR-spectroscopie. Ten slotte worden de details beschreven voor de opstelling van 1H R1ρ RD-experimenten op een Bruker NMR-spectrometer (figuur 1). Het protocol geeft elke stap om de 1D-versie in te stellen voor gelabelde voorbeelden en aanvullende opmerkingen en een tabel om aan te passen voor het instellen van de SELOPE-versie (Tabel 2). Na het protocol worden kritische stappen en alternatieve routes voor monstervoorbereiding en 1H R1ρ RD setup besproken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA is een zeer flexibel biomolecule, waarbij veranderingen in structuren cruciale rollen spelen in de functies die RNA-moleculen uitvoeren als cellulaire boodschappers en modulatoren. Hoewel deze dynamische toestanden verborgen blijven voor de meeste structurele methoden, maakt R1ρ ontspanningsdispersie (RD) spectroscopie het mogelijk om de conformatiedynamiek in het micro- tot milliseconderegime bij atoomresolutie te bestuderen. Het gebruik van 1H als waargenomen kern breidt het behandelde tijdsregime verder uit en geeft directe toegang tot waterstofbindingen en basiskoppeling.
De uitdagende stappen in een dergelijke studie zijn hoogzuiver en hoogproductief monsterpreparaat, mogelijk 13C- en 15N-gelabeld, evenals het opzetten van experimenten en het aanpassen van gegevens om populatie, wisselkoers en secundaire structuur van de voorheen onzichtbare toestand te extraheren. Dit protocol biedt cruciale praktische stappen in de monstervoorbereiding om de voorbereiding van een geschikt RNA-monster en de installatie van 1 H R1ρ-experimenten met zowel isotopisch gelabelde als niet-gelabelde RNA-monsters te garanderen.

Het protocol voor RNA-productie vergemakkelijkt zuivering door het genereren van hoogzuivere transcripties. Figuur 3A toont de resultaten van verschillende decolletéreacties van tandemtranscripties, die zowel succesvolle als onsuccesvolle reacties opleveren. Lane 1 toont het optimale geval van een volledig gespleten transcriptie met slechts vage sporen van nevenproducten. Baan 2a vertoont onvolledig decolleté, dat kan worden opgelost door opnieuw te gloeien en de toevoeging van meer RNase H (Lane 2b, stap 2.1.2). De RNA-constructies van de rijstroken 1, 2a en 2b zijn hetzelfde. Het monster in baan 3 toont een onsuccesvol decolleté. Het oplossen van deze reactie zou een controle van de splitsingsgeleidingssequentie, zuiverheid van DNA-sjabloon en gloeitemperaturen omvatten. Mogelijk moet RNase H-decolleté worden uitgevoerd na T7 IVT, zoals getoond voor monster 2.
Het monster in baan 4 toont een aanzienlijke hoeveelheid decolletézijdeproducten, die moeilijk te verwijderen zijn via ionenuitwisseling HPLC. Het oplossen van problemen met een dergelijk monster kan bestaan uit (a) het verlagen van de temperatuur, de hoeveelheid RNase H of de reactietijd, (b) het verminderen van elutiegradiënt en injectievolume en het proberen de doelfracties van de nevenproducten te scheiden. Karlsson c.s.31hebben meer informatie verstrekt over de vraag hoe de resolutie in de HPLC-zuivering van ionenuitwisseling kan worden verhoogd. HPLC scheidt het doel-RNA van langere of kortere nucleïnezuren en eiwit- of kleinmolecuulverontreinigingen. Figuur 3B toont het optimale resultaat voor de ionenuitwisseling HPLC zuivering. De elutiegradiënt moet zodanig worden gekozen dat de doel-RNA-soort ten minste één kolomvolume (in dit voorbeeld: 35 ml) na de volgende kleinere soort en één kolomvolume vóór de volgende grotere soort eluteert.
Kleinere soorten in deze methode omvatten enkele nucleotiden, abortieve producten (8-12 nt), 3' en 5' spacer sequenties (5-14 nt), en decolleté gids (12 nt chimeric nucleic acid), terwijl langere sequenties zijn potentieel onreine tandem herhalingen en de plasmide. Wanneer een goed gescheiden elutiepiek wordt bereikt, kan de zuivering worden opgeschaald tot het equivalent van ~ 20 ml IVT-reactie per injectie. De juiste vouw van een RNA-monster is cruciaal voor RD-experimenten en moet vóór elke meting worden bevestigd. Figuur 4 toont een A-gelabeld 22-mer RNA voordat het vouwprotocol in stap 2.4 (blauw) werd toegepast en hetzelfde monster nadat het juiste vouwen is bereikt (rood). Een Mc-Fold secundaire structuurvoorspelling (Figuur 4C) stelt de gepresenteerde haarspeldstructuur voor met 4 basisparen wat resulteert in 5 iminosignalen.
Beide spectra in figuur 4A bevestigen deze voorspelde signalen, zij het met iets verschillende relatieve intensiteiten, wat aangeeft dat een verkeerd gevouwen structuur (hier een dimer) problematisch kan zijn om te beoordelen met slechts 1H 1D-spectra. Een aromatisch 1H,13C-HSQC spectrum (Figuur 4B), toont echter slechts 3 van de aromatische signalen voor het monster vóór het vouwprotocol (blauw), maar alle 4 signalen voor het monster dat is gevouwen volgens stap 2.4 (rood). Het in blauw getoonde monster vormde waarschijnlijk een homodimeer (structuur voorgesteld in figuur 4D)dat zou resulteren in dezelfde iminosignalen als de haarspeld. Het signaal van A13H2 lijkt exchange-verbreed. Deze resultaten helpen om het belang van vouwbevestiging te benadrukken met zowel imino- als aromatische vingerafdrukexperimenten vóór elk RD-experiment. De 1H R1ρ pulssequenties beschreven in dit protocol maken de detectie van dynamiek in het tussenliggende uitwisselingsregime mogelijk. In eerste instantie wordt een onresonantiecurve geregistreerd en als er dynamiek aanwezig is voor een specifiek residu, is een dispersie zichtbaar binnen de verkregen R2+REX-waarden, terwijl deze curve vlak is voor residuen zonder uitwisseling.
Figuur 5 toont representatieve on-resonantiecurven verkregen voor twee verschillende H8-atomen in een synthetische RNA-haarspeld (figuur 5A), waarin G6H8 ervaringen uitwisselen (figuur 5C), terwijl A4H8 dat niet doet (Figuur 5B). Aangezien de uitwisseling in dit monster relatief traag is(kEX = 292 ± 40 Hz), werd het voordeel van het SELOPE-experiment om lage SL-sterktes te bereiken benut en werden de twee onresonantiecurven geregistreerd met behulp van de 1D-versie van de pulssequentie. Dezelfde pulssequentie werd vervolgens gebruikt om off-resonantiegegevens te verkrijgen voor het residu dat dispersie in het on-resonantieprofiel aantoont. Figuur 5D toont de verkregen R1ρ-waarden versus offset, waarbij een lichte asymmetrie van de curve al het teken van Δωaangeeft .
Dit wordt nog duidelijker in het R2+REX-perceel waar de R1-bijdrage wordt verwijderd ( figuur5E). De rechterkolom van dezelfde figuur toont representatieve on-resonantiecurven verkregen voor twee verschillende H8-atomen in een iets andere synthetische RNA-haarspeld met snellere uitwisseling, waarbij G6H8 ervaringen uitwisselt (Figuur 5G), terwijl A4H8 dat niet doet (Figuur 5F). De snellere wisselkoers (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) maakte het mogelijk om alle aromatische protonen tegelijk te registreren met behulp van de SELOPE 2D-versie om zowel on- als off-resonantiegegevens te verkrijgen (G6H8-gegevens weergegeven in figuur 5H,I).
Algemene identificatiegegevens voor positieve en negatieve resultaten Positieve resultaten in de tandem IVT en RNase H decolleté kunnen als volgt worden geïdentificeerd: 1) De doelband is de sterkste band in de denaturering PAGE gel. 2) Er zijn geen of slechts zwakke banden rond de hoofdband. 3) Er zijn geen of slechts zwakke soorten met een hoger molecuulgewicht. 4) Het HPLC-chromatogram toont een goed gescheiden piek van het doel-RNA. 5) Wanneer de hoofdpiek wordt bemonsterd, verschijnt er slechts één band op een denatureringsPAGINA-gel.
Negatieve resultaten in de tandem IVT en RNase H decolleté aanwezig als volgt: 1) Geen of alleen een zwakke hoofdband is zichtbaar op een denatureren PAGE gel. 2) Een patroon van soorten met een hoog molecuulgewicht van RNA tandem repeats is zichtbaar. 3) Hoewel de hoofdband aanwezig is, bevinden banden van vergelijkbare intensiteit zich binnen ± 3 nt boven of onder de hoofdband.
Een goed gevouwen monster kan als volgt worden geïdentificeerd: 1) Het aantal waargenomen iminoprotonen komt overeen met het aantal iminoprotonen dat wordt verwacht van een secundaire structuursimulatie(bijv.Mc-Fold39, figuur 4A). 2) Het syn G-U wiebelbasispaar in een UUCG-lus (indien aanwezig) is zichtbaar bij ~9,5 ppm, soms alleen zichtbaar bij lagere temperatuur. Verdere vingerafdrukken van de UUCG-lus zijn beschreven door Fürtig en collega's40. 3) De aromatische vingerafdruk komt overeen met een eerder toegewezen monster dat correct is gevouwen (figuur 4C).
Een verkeerd gevouwen of gedegradeerd monster kan als volgt worden geïdentificeerd: 1) Er zijn meer iminosignalen dan een secundaire structuursimulatie voorspelt (OPMERKING: minder iminosignalen impliceren niet noodzakelijkerwijs een verkeerde plooiing, omdat het sluiten van basisparen vaak niet zichtbaar is en de conformationele uitwisseling lijnen verbreedt). 2) Afwezigheid van imino signalen. 3) Smalle signalen van hoge intensiteit in het aromatische gebied, wat wijst op enkelvoudige nucleotidegradatieproducten. 4) Divergentie tussen imino- of aromatische signalen en een referentiemonster van bevestigd vouwen (figuur 4C).
Een atoom dat geen uitwisseling in de detecteerbare tijdschaal vertoont, kan als volgt worden geïdentificeerd: 1) uit een vlak RD-profiel (vanwege de ontbrekende REX-bijdrage die varieert met het toegepaste SL-vermogen) (figuur 5B en figuur 5F). 2) Er moet rekening worden gehouden met het geval van langzame tussentijdse uitwisseling wanneer kEX en Δω van dezelfde grootte zijn. In dat geval kan de bijdrage aan de resonantie zeer klein zijn, zoals te zien is in figuur 5C (in dit geval zijn de gemonteerde parameters kEX = 292 ± 40 Hz en Δω = 112 ± 4 Hz). Bij twijfel kan een lage SL off-resonantiecurve ter verificatie worden geregistreerd.
Een atoom dat uitwisseling in de tussenliggende tijdschaal vertoont, kan worden geïdentificeerd 1) aan de dee den 1) uit een niet-vlak ontspanningsdispersieprofiel in een RD-experiment met onresonantie(figuur 5B en figuur 5F); 2) een bredere lijnbreedte in het HSQC- of SELOPE-experiment kan ook een indicator zijn voor uitwisseling.
Goed geselecteerde SL-vermogenswaarden voor off-resonantiecurven(figuur 5E, F): 1) hebben een aanzienlijke k EX-bijdrage in de on-resonantiecurve (geselecteerde SL-vermogenswaarden zijn aangegeven in figuur 5C en figuur 5G). 2) Aangezien off-resonantiecurven worden gemeten voor ten minste 3 SL-vermogenswaarden, moeten de geselecteerde SL-vermogenswaarden worden verdeeld over het gebied van de onresonantiecurve met kEX-bijdrage. 3) Leiden tot niet-vlakke R2+REX-curven na de Laguerre-pasvorm (bijv. , Figuur 5D: SL-sterktes 25, 50 en 75 Hz; Figuur 5E).
Slecht geselecteerde SL-vermogenswaarden voor off-resonantiecurven(figuur 5E, F) leiden tot vlakke R2+REX-curven na de Laguerre-pasvorm. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 5E, waarin de 100 Hz off-resonance curve zeer vlak is en daarom geen significante informatie over Δω geeft.
Indicaties voor roterende frame nucleaire Overhauser effect (ROE) artefacten: 1) Δω verkregen uit off resonantie curven komen overeen met chemische verschuivingen van protonen in ruimtelijke omgeving / protonen, die een kruispiek vertonen met de piek van interesse in het nucleaire Overhauser effect spectroscopie (NOESY) spectrum. (bijvoorbeeld, figuur 5I toont brede off-resonantiecurven zoals verwacht voor snelle tussenliggende uitwisseling, maar de curven hebben ook scherpere kenmerken, bijvoorbeeldbij -3000 Hz en +1500 Hz. Deze zijn zeer waarschijnlijk te wijten aan een ROE artefact in plaats van een chemische verschuiving voor deze H8 in een andere conformer). 2) Laguerre fit werkt wel, maar werkt niet goed (geeft hoge fouten of fysiek onmogelijke waarden) voor een on-resonantie en ten minste 3 off-resonantie curven, hoewel exponentiëlen werden verkregen uit experimenten met hoge SINO (>20) (bijv. kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Vaak past elke SL individueel goed, maar het in elkaar passen geeft een veel hogere fout; het tegenovergestelde gedrag wordt verwacht voor een echte opgewonden toestand.
Indicaties voor "echte" uitwisseling Δω: 1) Δω verkregen uit off-resonantiecurven komen niet overeen met chemische verschuivingen van protonen in ruimtelijke omgeving/protonen, die een kruispiek vertonen met de piek van belang in het NOESY-spectrum (bijv. figuur 5E). 2) Laguerre fit geeft lage fouten voor een on-resonantie en ten minste 3 off-resonantie curven(bijv. figuur 5E vs. Figuur 5I, zie bijschrift voor de resultaten van de pasvorm).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Figuur 3: Monsterproductie door T7 tandem IVT en RNase H decolletéreactie. (A) Denaturering PAGINA van positieve en negatieve resultaten van tandem IVT en RNase H decolleté. Ladderhoogte verwijst naar RNA-verwijzingen, 12* verwijst naar de chimerische decolletégeleider. Lane 1: Succesvolle generatie van een 20 nt doel RNA. Er zijn weinig kortere en langere producten aanwezig. Baan 2a: Onvolledig decolleté van het tandem transcript. Hoewel HPLC-zuivering mogelijk is, zou er veel materiaal worden verspild. Lane 2b: Voortdurend rnase H decolleté van Lane 2 produceert een schoon monster klaar voor HPLC injectie (identiek aan Lane 1). Baan 4: RNase H decolleté was grotendeels niet succesvol, en er werd geen doelband geproduceerd. Het tandemtranscript over de volledige lengte is nog steeds zichtbaar op 600 nt. Lane 5: Er werd een doelband geproduceerd, maar er is een sterke -1 band aanwezig. Hoewel HPLC kan worden uitgevoerd, is een zorgvuldige verwijdering van het zijproduct noodzakelijk. (B) Voorbeeld van een succesvolle HPLC injectie. De piek van 38 min bevat zuiver RNA van de streeflengte, terwijl langere en kortere producten goed gescheiden zijn van de doel-RNA. Paneel B is gewijzigd van 21. Afkortingen: IVT = in vitro transcriptie; HPLC = hoogwaardige vloeistofchromatografie; nt = nucleotiden; AU = willekeurige eenheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Figuur 4: Voorbeeld van een RNA haarspeld voor (blauw) en na (rood) de vouwstap 2.4 (zie protocol) in NMR. (A) Imino gebied van een 1H-1D spectrum van een A-gelabeld 22-mer RNA. Verwachte regio's voor de identiteit van het basispaar van imino-signalen worden hieronder in grijs weergegeven. (B) 1H,13C-HSQC spectrum van de aromatische resonanties van het RNA uit paneel A. Het monster na het vouwen (rood) toont 4 signalen zoals verwacht, terwijl het monster voor het vouwen (blauw) slechts 3 signalen weergeeft. (C) Mc-Fold voorspelling van de 22-mer RNA als haarspeld. Van deze secundaire structuur zijn vijf iminosignalen te verwachten, die in beide monsters in paneel A te vinden zijn. (D) Voorgestelde structuur van een homodimeer gevormd door het 22-mer RNA, resulterend in dezelfde 5 basisparen als de haarspeldstructuur. Afkortingen: NMR = nucleaire magnetische resonantie; 1D = eendimensionaal; HSQC = heteronucleaire enkelvoudige kwantumcorrelatie; ppm = delen per miljoen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Figuur. 5: 1H R1ρ RD representatieve resultaten voor twee verschillende constructies op basis van een RNA haarspeld. (A) De linkerkolom toont de resultaten die op de RNA zijn verkregen met een C-G-basispaar boven de uitgepuilde U, terwijl de rechterkolom resultaten toont die zijn verkregen op een monster waarbij het basispaar in plaats daarvan op G-C is geschakeld. (B) en (F) tonen vlakke dispersieprofielen zoals verkregen voor A4H8 voor de twee constructies, wat wijst op geen conformatie-uitwisseling. (C–E) tonen on-resonantie, off-resonantie en gemonteerde gegevens verkregen voor G6 in de (G-C) constructie. De Laguerre-pasvorm leidt tot het volgende resultaat: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) tonen op resonantie, off-, resonantie en fitted gegevens. De Laguerre fit leidt tot het volgende resultaat: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43.502 ± 38.478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Dit cijfer is gewijzigd van 20. Afkorting: SL = spin lock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

We presenteren een protocol om micro- tot millisecondedynamiek te meten op 13C/15N-gelabeld en ongelabeld RNA met 1H R1ρ ontspanningsdispersie nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. De focus van dit protocol ligt op het hoogzuiver voorbereiden en opzetten van NMR-experimenten.

Praktische aspecten van monstervoorbereiding en -opstelling van 1H R1ρ ontspanningsdispersie-experimenten met RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Dit protocol beschrijft RNA-monstervoorbereiding en NMR-opstelling voor proton R1rho ontspanningsdispersiemetingen om bevestigingsuitwisseling in RNA-moleculen te onderzoeken. Omdat protonen worden onderzocht, heeft de methode geen isotopenetikettering nodig en heeft deze direct toegang tot structurele kenmerken zoals verschoven base-pairing. De pipet is vrij modulair in die zin dat R1rho ontspanningsdispersie kan worden gemeten, zelfs als het monster met een andere methode wordt geproduceerd.Begin met het voorbereiden van het plasmidemonster en het opzetten van een in vitro transcriptie en decolletéreactie zoals beschreven in het teksthandschrift. Incubeer de reactie een uur lang bij 37 graden Celsius. Verdun vervolgens een microliter van het monster vertienvoudigd in de laadoplossing.En voer een microliter uit op een denaturering PAGE gel. Als de decolletéreactie succesvol is, schaalt u de reactie op het gewenste volume en voert u deze 's nachts uit. Voer vervolgens nog een denaturering PAGE gel uit en beoordeel of de decolletéreactie is voltooid.In geval van onvolledig decolleté verwarmt u de reactieoplossing in een conventionele magnetron gedurende 15 seconden op 450 watt. Koel vervolgens de oplossing gedurende 40 minuten langzaam af tot 37 graden Celsius om de RNA en de decolletégeleider opnieuw teanneal. En let op de vorming van een nieuw neerslag.Voeg meer anorganische pyrofosfatase toe en RNase H.Incubateer de reactie gedurende één tot drie uur bij 37 graden Celsius. Bevestig vervolgens de voltooiing van de decolletéreactie met denaturering PAGE. Wanneer de RNase H-decolletéreactie is voltooid, dooft u de reactie door EDTA toe te voegen aan een eindconcentratie van 50 millimol.En vortex grondig. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 micron. En concentreer de oplossing op een volume dat kan worden geïnjecteerd in een HPLC-systeem voor zuivering.Voordat u het geconcentreerde en gezuiverde monster aan de NMR-buis toevoegt, reinigt u de buis door met overvloedig water te spoelen. Dan RNase ontsmettingsreagens, water en 95% ethanol. Laat het na de laatste spoeling met water drogen.Spoel de zuiger af met water en gebruik een pluisvrij doekje om schoon te maken met RNase decontaminatiereagens en 95% ethanol. Voeg na het drogen van de buis en zuiger 10% D2O toe aan het NMR-monster. Gebruik een grote pipettip om het RNA-monster over te brengen in de NMR-buis en deze langs de zijkant van de buiswand te laten stromen.Steek de zuiger in de buis door deze met een snelle draaiende beweging naar beneden te duwen om luchtbellen te verwijderen en trek de zuiger vervolgens langzaam omhoog zonder nieuwe luchtbellen te creëren. En repareer het met paraffinewasfilm. Maak een nieuwe gegevensset op basis van een aromatische protonkoolstof HSQC-gegevensset die wordt gebruikt op volledig gelabelde RNA-monsters voor RNA-toewijzing.Stel de algemene parameters en RD-specifieke parameters in. Stel vervolgens het protonspinslotvermogen in op 1,2 kilohertz om te testen. Genereer een vd-testlijst met slechts één item, nul milliseconden, stel TDF1 in op één en werk D30 bij om een testspectrum uit te voeren.Nadat u een vd-testlijst hebt ingesteld, werkt u D30 en TDF1 bij. En plot de intensiteit van de piek voor verschillende spin lock lengtes. Identificeer de draaivergrendelingslengte waarbij de intensiteit van de oorspronkelijke piek afneemt tot een derde.Maak op het resultaat van de testruns de definitieve vd-lijst die in het experiment moet worden gebruikt. Selecteer het aantal scans zodat de zwakste piek van de lijst een signaal-ruisverhouding van ten minste 10 heeft. De resultaten van verschillende decolletéreacties van tandemtranscripties worden hier weergegeven.Een 20 nucleotide doel RNA werd gegenereerd in een succesvolle reactie. Mislukte reacties resulteerden in onvolledige en mislukte decolleté van het monster. HPLC-injectie van het RNA-monster onthulde een piek voor pure doel-RNA na 38 minuten.Terwijl langere en kortere producten goed gescheiden waren van de piek van interesse. Analyse van de RNA-haarspeld toonde aan dat het aantal waargenomen imino-protonen overeenkwam met het aantal imino-protonen dat werd verwacht van een secundaire structuursimulatie. Het proton koolstof HSQC spectrum van de aromatische resonanties van de RNA vertoonde vier signalen na het vouwen.En slechts drie signalen voor het vouwen. In de vertegenwoordiger op resonantiecurven verkregen voor twee verschillende H8-atomen en twee verschillende synthetische RNA-haarspelden, ervaart de G6H8 bevestigingsuitwisseling. Terwijl de A4H8 dat niet doet.Voor G6H8 werden de gekleurde spinslotkrachten geselecteerd en werden off resonance-gegevens geregistreerd. In de CG-constructie waar de uitwisseling traag is, vertoonden de R1rho-rijwaarden versus offsetplot al een lichte asymmetrie van de curve, wat het teken van het chemische verschuivingsverschil delta omega aangeeft. Dit wordt nog duidelijker in het R2 plus REX-perceel waar de R1-bijdrage wordt verwijderd.Aan de andere kant ervaart de GC-constructie snellere uitwisseling en de R1rho-waarden versus offsetplot presenteerden een bredere curve waar de extractie van delta omega zelfs in de R2 plus REX-plot minder duidelijk wordt. Zodra de RNA-dynamiek is opgehelderd, kunnen de toestanden worden gekarakteriseerd en gevangen. Deze gevangen toestanden kunnen bijvoorbeeld worden getest in biologische tests.Deze methode stelt ons in staat om functionele, relevante basiskoppelingsverschuivingen te observeren in een actief microRNA miRNA-complex, lusherschikkingen in ribosomale RNA en basispaarstabiliteit van op enkele nucleotide-uitstulpingen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...