Wir danken der Protein Science Facility (PSF) am Karolinska Institutet für die Expression und Reinigung von T7 RNA Polymerase und E. coli RNase H, Martin Hällberg für die großzügige Schenkung der anorganischen Phosphatase und dem gesamten Petzoldlab für wertvolle Gespräche. Wir danken Luca Retattino für die Vorbereitung der U-Bulge-Konstrukte und Emilie Steiner und Carolina Fontana für ihren Beitrag zu Makros und passenden Skripten. Wir danken dem Karolinska Institut und der Abteilung für Medizinische Biochemie und Biophysik für die Unterstützung der Anschaffung eines 600 MHz Spektrometers und der Positionsfinanzierung (KI FoAss und KID 2-3707/2013). Wir danken für den finanziellen Beitrag von Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 und FFL15-0178) und The Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 und 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 und M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. erkennt Die Finanzierung durch ein Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF Projekt Nr. 747446) an.

K.P. ist Berater von Arrakis Therapeutics, einem Unternehmen, das kleine Moleküle entdeckt, die auf RNA abzielen.

Das hier vorgestellte Protokoll ist eine Synthese mehrerer Protokolle, die zuvor in Form vonForschungsartikeln 10,20,21,31 veröffentlichtwurden. Daher können Segmente des Protokolls angewendet werden, während andere nach Den Wünschen des Lesers ausgetauscht werden können. Zum Beispiel können die R1ρ-Messungen an einer RNA-Probe durchgeführt werden, die mit jeder Methode hergestellt wurde, vorausgesetzt, dass Faltung und Homogenität der Länge angenommen werden. Darüber hinaus enthält das Protokoll keine Informationen über die Resonanzzuordnung der RNA-Sequenz - ein Schritt, der für RD-Experimente erforderlich ist-,da dies in der früheren Literatur ausführlich behandelt wurde19,37,38. Partielle, segmentale oder ortsspezifische Markierungsschemata36,41,42,43,44 sind Ansätze zur Erleichterung der Resonanzzuordnung oder zur Verringerung der Überlappung von Resonanzen, die in RD-Experimenten von Interesse sind und in der Literatur ausführlich beschrieben wurden. Diese Methode ermöglicht die Verwendung einer einheitlichen Markierung beliebiger Nukleotididentitäten, was die Resonanzzuordnung bereits erheblich vereinfachen kann.
Die hier vorgestellte IVT-Methode überwindet bekannte Probleme mit Sequenzen und Kennzeichnung, steigert den Ertrag und senkt Kosten und Arbeitszeit im Vergleich zu anderen Methoden. Die Verwendung der viralen Initiationssequenz reduziert die Notwendigkeit einer Reaktionsoptimierung, was ein bekanntes Problem im Feld ist, das zeitaufwendig durchzuführen sein kann und im Falle einer Nicht-G-Initiation nur wenige Kopien des Transkripts liefert. Die T7 IVT- und RNase H-Spaltung des Tandem-Transkripts kann gleichzeitig im selben Gefäß durchgeführt werden. Ein Muster multimerer Tandemwiederholungen ist auf einem denaturierenden PAGE-Gel während der Reaktion zu sehen, das nach Abschluss der RNase-H-Reaktion zu einem einzigen Band auf der Ziel-RNA verschmolz(Abbildung 3A,Bahnen 1 und 2b). Typische Ausbeuten mit dieser Methode liegen zwischen 30 und 70 nmol RNA pro 1 ml IVT. Die methode, die auf der RNase H-Spaltung von Tandemwiederholungen basiert, ist jedoch nicht ohne gewisse Probleme. Die RNase H-Spaltungsreaktion geht oft nicht zum Abschluss, wenn sie gleichzeitig mit der T7-Transkription ausgeführt wird(Abbildung 3A,Bahn 2a).
Die Trennung der Tandemeinheiten kann durch Glühen der Spaltungsführung zum Transkript und Hinzufügen weiterer RNase H abgeschlossen werden(Abbildung 3A,Bahn 2b, Schritt 2.1.2). Da das Erhitzen großer Volumina langsam ist und zu einerMg2+-katalysierten Hydrolyse von RNA führt, wurde ein herkömmlicher Mikrowellenofen verwendet, der die Probe in 10-15 s auf >95 °C erhitzen wird. Schädliche Auswirkungen auf die produzierten Proben wurden bisher nicht beobachtet. Einige Konstrukte zeigen ein kleines zweites Band, das durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen nicht eliminiert werden konnte (Abbildung 3A, Spur 4). In der Regel sind diese im HPLC-Chromatogramm eher deutlich als Schulter sichtbar, wenn ein gut optimierter Elutionsgradient verwendet wird, und können entfernt werden (Schritt 2.2.5). Die folgende Diskussion zielt darauf ab, kritische Schritte im Protokoll hervorzuheben, insbesondere in Bezug auf die Gewinnung hochwertiger Daten, die eine Interpretation der Konformationsdynamik ermöglichen.
RNase-Kontamination Extrazelluläre RNasen sind allgegenwärtig, hochstabil und stellen die größte Bedrohung für die Langzeitstabilität von NMR-Proben dar. Daher ist es wichtig, in einer RNase-freien Umgebung zu arbeiten und alle Reagenzien und Kunststoffwaren RNase-frei zu halten. Die Verwendung von Filterspitzen und vielleicht sogar Gesichtsmasken wird empfohlen. Dies ist besonders wichtig nach der HPLC-Reinigung. NMR-Proben, die mit RNasen kontaminiert sind, weisen typischerweise nach Tagen oder Wochen aufgrund von Einzelnukleotidabbauprodukten enge Spitzen auf, die in 1H-1D-Spektren sichtbar sind. Eine solche Probe ist für R1ρ-Messungen nicht geeignet.
NMR-Probe Aufgrund ihrer hoch geladenen Natur kann RNA im Vergleich zu den meisten Proteinen in hohen Konzentrationen ohne Ausfällung verwendet werden. Die Verwendung von Shigemi NMR-Röhrchen (siehe Materialtabelle)ist vorteilhaft, da sie eine Zentrierung der hochkonzentrierten Probe in der Mitte der Spule ermöglichen und gleichzeitig aufgrund des anfälligkeitsmäßig abgestimmten Glasbodens und -kolbens dennoch ideale Shimming- und Locking-Bedingungen bieten. Auf diese Weise wird die B1-Inhomogenität reduziert, was zu schmaleren Linien führt. Das typische Probenvolumen in einem NMR-Röhrchen beträgt 250 μL und die typische Konzentration 1-2 mM. Proben unter 500 μM werden für RD-Experimente nicht empfohlen, da das Experiment zu lange dauern und ein gutes Shim wäre. Ebenso wird ein Probenvolumen unter 200 μL nicht empfohlen, da eine gute Shim- und Feldstabilität (Lock) erforderlich ist. Beim Einsetzen des Kolbens ist es wichtig, die Bildung von Blasen in der Probe zu vermeiden (Schritt 2.4.5). Wenn der Kolben nicht richtig fixiert wird, kann er in die Probe hineingleiten, wodurch das nachweisbare Volumen reduziert wird. Darüber hinaus können schnelle Temperaturänderungen zur Bildung neuer Blasen in der Probe führen. Daher ist beim Transport der Probe und bei der Änderung der Sondentemperatur im NMR-Spektrometer Vorsicht geboten. Überprüfen Sie die Probe bei erneuter Messung nach längerer Zeit auf Blasen.
RNA-Faltung Dynamische RNA-Moleküle können in mehreren Konformationen existieren, wenn sie nicht richtig gefaltet werden. Auch wenn die Schmelztemperaturen von Sekundärstrukturen nur geringfügig über raumtemperatur liegen können, empfiehlt sich vor der Messung ein gründliches Heiz- und Schnappkühlverfahren. Hochkonzentrierte Haarnadelproben, die unter kinetischer Kontrolle (Heizen und Schnappen) falten, können im Laufe der Zeit Homodimere bilden, was eine strenge Kontrolle der RNA-Faltung vor jeder NMR-Messung erfordert. Wenn es sich bei der gemessenen RNA nicht um eine Haarnadelstruktur, sondern um einen RNA-Duplex handelt, sollte eine langsame Faltung unter thermodynamischer Kontrolle angewendet werden.
In diesem Fall sollte der Kühlprozess nach dem Erhitzen im Bereich von Stunden liegen, während die RNA in ihrem endgültigen Volumen und ihrer Konzentration in der NMR-Probe verwendet wird. Eine erste Zählung der erwarteten Imino- und aromatischen Resonanzen kann Aufschluss über die Homogenität der Probe geben. Wenn die Probe nicht wie erwartet aussieht, sollte sie wieder gefaltet werden. Mg2+ (als Chloridsalz zugegeben) kann bei der Faltung von RNA-Strukturenhelfen 45. In der Praxis dient die Faltungssteuerung als Vergleich zu einer Probe, mit der die NMR-Resonanzen zumindest teilweise zugeordnet und die Sekundärstruktur experimentell gelöst wurden.
Überlegungen zu Leistung und Heizung der Spin-Lock Wenn die 1 H R 1ρRD-Experimente als 2D-Übersichtsexperimente ausgeführt werden, sollte die SL-Leistung nicht niedriger als 1,2 kHz sein. Die Hochfrequenz-Sendefrequenz sollte in der Mitte des ppm-Bereichs der interessierenden Peaks platziert werden(z. B.7,5 ppm für aromatische Protonen). Die Bandbreite von 1,2 kHz ist dann groß genug, um diese Protonen ohne größere Off-Resonanz-Effekte zu spinnen. Solche Effekte können im RD-Profil identifiziert werden. Treten sie auf, steigen die R2+REX-Werte mit steigenden SL-Leistungswerten an, anstatt zu sinken, insbesondere bei geringer SL-Leistung. Überprüfen Sie, ob die berechneten SL-Leistungswerte mit der an die Probe gelieferten Leistung übereinstimmen. In der Praxis kann die berechnete SL-Leistung verwendet werden, wenn der 1H 90° harte Impuls sorgfältig auf neueren Spektrometern kalibriert wurde; Dies kann jedoch überprüft werden, indem die SL-Leistung für jede gewünschte Bandbreite kalibriert wird.
Der Bereich der SL-Leistung, der in 1 H R 1ρRD-Experimenten verwendet werden kann, ist sehr breit, was zu einer unterschiedlichen Probenerwärmung führt (1,2 kHz bis 15 kHz für HSQC für HCP-basierte Sequenzen und 50 Hz bis 15 kHz für SELOPE-Experimente). Ungleiche Probenerwärmung kann als leichte Änderung der chemischen Verschiebung erkannt werden, wenn man 1Ds vergleicht, die für Low-Power-SLs mit . Hochleistungs-SLs. Dieser Effekt wird in der Regel nicht in Wärmekompensationen in R1ρ-Experimenten an Heteronukleien berücksichtigt. Die Wärmekompensation in diesen Experimenten wird normalerweise so eingerichtet, dass sie aufgrund der unterschiedlichen Spin-Lock-Dauern, die in der vd-Liste jeder Spin-Lock-Leistungsreihe angegeben sind, für unterschiedliche Erwärmungen korrigiert wird. Speziell für das SELOPE-Experiment sollte eine zweite Wärmekompensation über alle angewandten SL-Stärken wie in20beschrieben verwendet werden.
Überlegungen zur VD-Liste Wie bereits erwähnt, sollte die vd-Liste einen Zeitpunkt enthalten, der lang genug ist, um einen signifikanten Intensitätsabfall zu erhalten (idealerweise bis zu 30% des Anfangssignals oder so niedrig wie möglich, wenn es nicht möglich ist, einen 70% igen Zerfall innerhalb der Spezifikationen der Sonde zu erreichen). Obwohl die vd-Liste für eine geringe SL-Leistung (1,2 kHz) optimiert wurde, sollte diese vd-Liste auch bei der höchsten zu verwendenden SL-Leistung(z.B.15 kHz) getestet werden. Dies liegt daran, dass bei Peaks mit signifikantem REX-Beitrag der Zerfall bei hoher SL-Leistung viel langsamer ist. So sollte auch bei hoher SL-Leistung ein ausreichender Zerfall nachgewiesen werden. Gleiches gilt für Zerfälle bei hohen Offsets in Off-Resonanz-Experimenten. Der ideale maximale Zeitpunkt der vd-Liste könnte für die verschiedenen Regionen des Dispersionsexperiments signifikant unterschiedlich sein. In diesem Fall könnten mehr Punkte in die vd-Liste aufgenommen werden, und die längeren vd-Listenpunkte für höhere SL-Leistung oder höhere Offsets während der Analyse, basierend auf dem niedrigen SINO, zu dem sie führen, könnten verworfen werden. Im Allgemeinen sollten 5-8 vd-Listenpunkte in Betracht gezogen werden, um potenzielle Artefakte zu erkennen, die zu nicht-exponentiellen Zerfällen wie J-Kopplung führen (siehe unten).
1D-Überlegungen zur HCP-Selektivität Beim Ausführen der HCP-basierten 1D-Version ist besondere Vorsicht geboten, wenn sich ein weiterer Peak mit dem Peak of Interest in der 1H-Dimension des 2D HSQC-basierten Experiments überschneidet. HCP-basierte Transfers sind sehr, aber nie 100% selektiv, und es kann daher vorkommen, dass ein anderer Peak zum Intensitäts- und Zerfallsverhalten des Peak of Interest im 1D beiträgt. Ein Hinweis darauf wäre eine Differenz der On-Resonanz-R1ρ-Werte, die mit der 1D- und 2D-Version des markierten Experiments erhalten wurden.
ROE-Überlegungen: Für Off-Resonanzkurven von Atomen mit langsamem Zwischenaustausch können ROE-Artefakte basierend auf einem Vergleich des erhaltenen Δω mit einem NOESY- oder ROESY-Spektrum identifiziert werden. Wenn ein Kreuzpeak bei einer chemischen Verschiebungsdifferenz entsprechend Δωidentifiziert werden kann, dann könnte der beobachtete angeregte Zustand tatsächlich ein ROE-Artefakt sein(z. B.wurden ROEs zwischen aromatischen Protonen gefunden, die sich alle im gleichen chemischen Verschiebungsbereich befinden und daher von diesen Off-Resonanzkurven abgedeckt werden20). Erfahrungsgemäß führte dies immer auch zu schlechten Passformen mit großen Fehlern, möglicherweise weil der ROE nicht dem gleichen Muster wie REX mit zunehmender SL-Leistung folgte. Schwieriger wird die Situation für den mittelschnellen Austausch. Während die On-Resonanz-Kurve (aus dem Vergleich mit 13C-Daten, die auf dem benachbarten Kern erhalten wurden) immer noch repräsentativ für den Austauschprozess zwischen GS und ES ist, wird die Off-Resonanz-Kurve durch mehrere ROE-Artefakte beeinflusst.
In diesem Fall ist die SL-Leistung zum Nachweis des Austauschprozesses größer (>1,5 kHz) und umfasst daher eine größere Anzahl von Protonen, da sich Off-Resonanzkurven über chemische Verschiebungsdifferenzen verschiedener ROE-Kandidaten erstrecken (für H8 wären dies: Aminoprotonen bei ca. ±1000 Hz, H5/H1 bei ca. -1200 Hz, Iminoprotonen bei ca. 3500 Hz). Bisher wurde keine Methode gefunden, um diese ROE-Artefakte zu unterdrücken (außer der Verwendung von teilweise deuterierten Nukleotiden46),und Off-Resonanz-Daten sollten nicht für den schnellen Zwischenaustausch aufgezeichnet werden, da mit dieser Methode keine zuverlässigen Informationen über das tatsächliche Δω extrahiert werden können, wenn der NOE/ROE-Beitrag nicht über NOESY-Spektren ausgeschlossen werden kann.
Überlegungen zur J-Kopplung (Hartmann-Hahn) Obwohl On-Resonanz-Kurven für homonukleare J-gekoppelte Protonen, wie H6, erfolgreich10,20aufgezeichnet wurden, ist bei Off-Resonanz-Messungen besonders vorsichtshalber geboten, insbesondere bei geringer SL-Leistung, da Hartmann-Hahn-Matching-Bedingungen einen weiten Bereich der untersuchten Offsets umfassen können. Hartmann-Hahn-Artefakte können als Schwingungen auf dem exponentiellen Zerfall oder steigendeR2+ REX-Werte mit steigenden SL-Stärken in On-Resonanz-RD-Diagrammen20identifiziert werden.

RNAs erfüllen eine Vielzahl von regulatorischen1,katalytischen2und strukturellen3 Funktionen in der Zelle, von denen viele mit einer flexiblen molekularen Struktur und komplizierten Veränderungen dieser Strukturen korrelieren4,5,6,7. Dünn besiedelte Zustände bleiben für die meisten Methoden der Strukturbestimmung unsichtbar oder erlauben nicht die Untersuchung dieser verborgenen Zustände bei hoher atomarer Auflösung. Die NmR-Spektroskopie (Solution-State Nuclear Magnetic Resonance) kombiniert beide Aspekte, indem sie Zugang zu einzelnen Atomkernen bietet und eine große Toolbox von Experimenten bietet, die auf die Dynamik durch alle Zeitregime abzielen8. RD-NMR-Experimente ermöglichen den Zugang zum Konformationsaustausch in der Mittleren Zeitskala, wobei Änderungen der Basenpaarungsmuster und lokale strukturelle Umlagerungen zu erwarten sind5,9,10,11,12,13,14. RD-Experimente werden als lange R2-Messungen in Form eines Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Pulsstrangs15 oder als Relaxationsmessungen im rotierenden Rahmen,R1ρ RD-Experimente16genannt, durchgeführt.
Obwohl beide verwendet werden können, um population und Wechselkurs- und chemische Verschiebungsdifferenz zum Nebenzustand zu extrahieren, geben R1ρ RD-Experimente auch das Zeichen der chemischen Verschiebungsdifferenz des angeregten Zustands. Dies ermöglicht einen Rückschluss auf die Sekundärstruktur, die stark mit der chemischen Verschiebung in RNA-Strukturen korreliert17. Die chemische Verschiebung ist ein guter Indikator für die Hälikizität bei aromatischen Protonen und Kohlenstoffen auf den Nukleobasen, von Basenpaarpartnern für Imino-Protonen und von Zuckerpuckern an den C4'- und C1'-Atomen18,19. Es sei darauf hingewiesen, dass kürzlich ein CEST-Experiment (Chemical Exchange Saturation Transfer) mit höherer Spin-Lock-Leistung (SL) veröffentlicht wurde, wodurch die Anwendbarkeit des CEST-Experiments auf schnellere Austauschzeitskalen verschoben wurde, als Alternative zum R1ρ RD-Experiment für Systeme mit einem angeregten Zustand.
Obwohl 13C- und 15-N-Isotopeoft für den Zugang zum strukturellen Austausch verwendet wurden, verwendeten neuere Arbeiten aus diesem Labor aromatische und Imino-Protonen als Sonden für den Konformationsaustausch9,10. Die Verwendung von 1H als beobachteter Kern bringt mehrere Vorteile mit sich, zum Beispiel den Zugang zum Austausch auf immer langsameren Zeitskalen, eine höhere Empfindlichkeit und kürzere Messzeiten. Dies wird durch den SELOPE-Ansatz (SELective Optimized Proton Experiment) erleichtert, der den Zugang zu aromatischen Protonen durch Entkrümung des eindimensionalen (1D) Spektrums mit homonukleären Skalarkopplungen anstelle eines heteronuklearen Magnetisierungstransfers ermöglicht und die Notwendigkeit von Isotopenmarkierungeneliminiert 20. Dieses Protokoll adressiert die Messung in 1H R1ρ RD Experimenten von einheitlich 13C/15 N-markierten und unmarkierten Proben. Daher stellt dieser Artikel eine Probenvorbereitungsmethode vor, die sich als die vielseitigste für verschiedene Probenvorbereitungsanforderungen21 erwiesen hat, und diskutiert Alternativen im letzten Abschnitt dieses Artikels (Abbildung 1).
An dieser Stelle sollte der Leser beachten, dass andere Probenvorbereitungstechniken für 1 H R 1ρRD-Experimente akzeptabel sind und dass andere Methoden der Struktur- und Funktionsanalyse mit den mit der vorgestellten Techniksynthetisierten Proben durchgeführt werden können. 1 H R1ρ RD-Experimente erfordern hohe RNA-Konzentrationen (idealerweise >1 mM) sowie eine hohe Homogenität, sowohl in der RNA-Länge als auch in der strukturellen Konformation, um eine zuverlässige Charakterisierung der Molekulardynamik zu gewährleisten. Die In-vitro-Transkription (IVT) ist für viele Forscher die Methode der Wahl, um 13C /15N-markierte RNA-Proben herzustellen, da markierte Nukleosidtriphosphate (NTPs) verfügbar sind und die enzymatische Reaktion leicht eingebaut wird22. Die weit verbreitete T7-RNA-Polymerase (T7RNAP)23,24,25 leidet jedoch bei bestimmten Initiationssequenzen 26,27 unter einer geringen 5'-Homogenität und oft auch unter 3'-Homogenität während des Transkriptionsabflusses28. Die Reinigung der Ziel-RNA-Spezies wird aufgrund des Bedarfs an großen Mengen von ~200 nmol teurer und mühsamer. Die hier verwendete Methode wurde bereits vorgestellt, wo die Vorteile im Großen und Ganzen diskutiert wurden21. Kurz gesagt, es löst beschriebene Probleme, indem es ein größeres Tandem-Transkript transkribiert, das dann von Escherichia coli RNase H ortsspezifisch gespalten wird, geleitet von einem chimären Oligonukleotid29,30 (siehe Abbildung 2 für Details).
Die Einarbeitung einer Abstandssequenz an den Enden 5' und 3' des Tandem-Transkripts ermöglicht die Verwendung einer hochertragreichen Initiationssequenz und die Entfernung von Terminalüberhängen in der Nähe der Linearisierungsstelle der Plasmidschablone (Abbildung 2B). Es wurde gezeigt, dass die Methode die Ausbeute signifikant verbessert und gleichzeitig Kosten und Arbeit reduziert, mit dem Vorbehalt einer komplexeren Vorlagensynthese und der Notwendigkeit eines zusätzlichen Enzyms und Oligonukleotids. Die hohe Spezifität der RNase H-Spaltung erleichtert die Reinigung aufgrund des Mangels an RNA-Spezies in einem ähnlichen Größenbereich. Das vorliegende Protokoll verwendet einen Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographieschritt (HPLC), der kürzlich von diesem Labor31veröffentlicht wurde, obwohl andere Methoden mögliche Alternativen sind. 1 HR1ρ RD kann im Allgemeinen an markierten oder unmarkierten Proben mit zwei jeweiligen Pulssequenzen erfasst werden, dem "markierten" 1 H R1ρ heteronukleären Einzelquantenkorrelationsexperiment (HSQC) mit einer 13C indirekten Dimension10 und dem "unmarkierten" 1H R1ρ SELOPE-basierten Experiment mit einer 1H indirekten Dimension20. 
Diese zweidimensionalen (2D) Experimente können als erste Kontrolle dienen, unabhängig davon, ob Dynamik auf der R1ρ-Zeitskala in der Probe vorhanden ist. Es kann ein Überblick über RD für alle aufgelösten Peaks in den Spektren erhalten und Peaks identifiziert werden, die für eine gründlichere RD-Analyse von Interesse sind. Das bedeutet, dass auch unbeschriftete Proben überprüft werden können, bevor die Entscheidung getroffen wird, eine teurere, etikettierte Probe herzustellen. Sobald ein Peak mit Konformationsaustauschbeitrag ausgewählt wurde, um gründlicher untersucht zu werden, ist es am besten, zu den 1D-Versionen der oben genannten Experimente zu wechseln (wenn der Peak noch aufgelöst werden kann), um sogenannte Off-Resonanz-Experimente durchzuführen. Für die markierte Version wird der HSQC-Transfer auf 13C durch einen selektiven heteronuklearen Kreuzpolarisationsschritt (HCP) ersetzt, wie er in den 13C R1ρ Experimenten32,33,34,35verwendet wird, während im Falle des SELOPE-Experiments das Experiment einfach als 1D ausgeführt wird, was besonders nützlich für H8- und H2-Signale ist, die ohnehin auf der Diagonale im 2D liegen. Ein Kriterium, welche Sequenz zu verwenden ist, vorausgesetzt, dass sowohl eine markierte als auch eine unmarkierte Probe zur Verfügung stehen, ist, wie gut isoliert der Peak of Interest in den beiden Experimenten ist.
Generell wird das SELOPE-Experiment für RNA-Proben mit bis zu 50 Nukleotiden empfohlen. Bei größeren RNAs wird die Überlappung größer sein; Strukturell interessante Nukleotide treten jedoch häufig in chemischen Verschiebungsbereichen auf, die sich weniger überlappen und in noch größeren RNAs noch zugänglich sein könnten. Ein weiteres Argument wäre, dass in unmarkierten Proben keine J-Kopplungzwischen 1 H und 12C auftritt. Da die minimale Spin-Lock-Leistung jedoch durch die minimale Leistung definiert wird, die verwendet wird, um diese beiden Spins (~ 1 kHz) im markierten Experiment zu entkoppeln, ermöglicht das unbeschriftete Experiment die Verwendung eines breiteren Spektrums von Spin-Lock-Stärken (SL) und damit den Zugang zu einer breiteren Zeitskala des Austauschs. Diese Off-Resonanz-Experimente liefern zusätzliche Informationen zu kex, wie z.B. Population des angeregten Zustands (alternativer Konformer), pES, sowie sehr wertvolle chemische Verschiebungsinformationen in Form von Δω (die chemische Verschiebungsdifferenz des Grundzustands und des angeregten Zustands).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Workflow des dargestellten Protokolls. Vorbereitung vor der eigentlichen Großprobenproduktion, bestehend aus Vorlagenvorbereitung und Bestätigung der erfolgreichen In-vitro-Transkription und RNase H-Spaltung. Großserienproduktion einschließlich HPLC-Reinigung, Befüllung des NMR-Röhrchens und Bestätigung der RNA-Faltung. Im Falle einer isotopenmarkierten Synthese sollte noch am selben Tag eine nicht markierte Aufreinigung zur Gradientenoptimierung durchgeführt werden. NMR-Charakterisierung der Konformationsdynamik mit R1ρ-Experimenten. Jeder Schritt kann unabhängig voneinander durchgeführt werden, z.B.kann die 1HR1ρ RD-Analyse auf jede geeignete RNA-Probe angewendet werden, die mit einer anderen Methode hergestellt wurde. Abkürzungen: IVT = in vitro transkription; HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; NMR = Kernspinresonanz; RD = Relaxationsdispersion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ziel dieses Protokolls ist es, praktische Details und kritische Parameter für die Untersuchung der Konformationsdynamik mit 1 H R1ρ Relaxationsdispersion in RNA-Haarnadelmolekülen bereitzustellen. Nach der Bereitstellung eines detaillierten Protokolls des Designs, der Synthese und der HPLC-Aufreinigung einer Ziel-RNA, die mit allen, einigen oder keinem NTPs als 13C /15N-markierte Versionen durchgeführt werden kann, wurde der Workflow der Fertigstellung der NMR-Probe und der Bestätigung des Konformationsaustauschs mit NMR-Spektroskopie beschrieben. Abschließend werden die Details für den Aufbau von 1H R1ρ RD Experimenten auf einem Bruker NMR Spektrometer beschrieben (Abbildung 1). Das Protokoll enthält jeden Schritt zur Einrichtung der 1D-Version für beschriftete Muster und zusätzliche Kommentare sowie eine Tabelle zum Anpassen für die Einrichtung der SELOPE-Version (Tabelle 2). Nach dem Protokoll werden kritische Schritte und alternative Wege zur Probenvorbereitung und 1H R1ρ RD-Einrichtung besprochen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA ist ein hochflexibles Biomolekül, bei dem Veränderungen in Strukturen eine entscheidende Rolle bei den Funktionen spielen, die RNA-Moleküle als zelluläre Botenstoffe und Modulatoren ausführen. Während diese dynamischen Zustände den meisten strukturellen Methoden verborgen bleiben, ermöglicht die R1ρ Relaxation Dispersion (RD) Spektroskopie die Untersuchung der Konformationsdynamik im Mikro- bis Millisekundenbereich bei atomarer Auflösung. Die Verwendung von 1H als beobachteter Kern erweitert das abgedeckte Zeitregime weiter und ermöglicht den direkten Zugang zu Wasserstoffbrückenbindungen und Basenpaarungen.
Die herausfordernden Schritte in einer solchen Studie sind die hochreine und ertragreiche Probenvorbereitung, potenziell 13C- und 15N-markiert, sowie der Aufbau von Experimenten und die Anpassung von Daten zur Extraktion von Population, Wechselkurs und Sekundärstruktur des zuvor unsichtbaren Zustands. Dieses Protokoll bietet entscheidende praktische Schritte bei der Probenvorbereitung, um die Vorbereitung einer geeigneten RNA-Probe und den Aufbau von 1 H R1ρ-Experimenten mit isotopisch markierten und unmarkierten RNA-Proben sicherzustellen.

Das Protokoll zur RNA-Produktion erleichtert die Aufreinigung durch die Generierung hochreiner Transkripte. Abbildung 3A zeigt die Ergebnisse mehrerer Spaltreaktionen von Tandemtranskripten, die sowohl erfolgreiche als auch erfolglose Reaktionen liefern. Spur 1 zeigt den optimalen Fall eines vollständig gespaltenen Transkripts mit nur schwachen Spuren von Nebenprodukten. Spur 2a zeigt eine unvollständige Spaltung, die durch erneutes Glühen und Die Zugabe von mehr RNase H aufgelöst werden kann (Spur 2b, Schritt 2.1.2). Die RNA-Konstrukte der Bahnen 1, 2a und 2b sind gleich. Die Probe in Bahn 3 zeigt ein erfolgloses Dekolleté. Die Fehlerbehebung bei dieser Reaktion würde eine Überprüfung der Spaltungsführungssequenz, der Reinheit der DNA-Schablone und der Glühtemperaturen beinhalten. Möglicherweise muss die RNase H-Spaltung nach T7 IVT durchgeführt werden, wie für Probe 2 gezeigt.
Die Probe in Bahn 4 zeigt eine signifikante Menge an Spaltseitenprodukten, die mittels Ionenaustausch-HPLC nur schwer zu entfernen sind. Die Fehlerbehebung bei einer solchen Probe kann (a) die Senkung der Temperatur, der RNase-H-Menge oder der Reaktionszeit, (b) die Verringerung des Elutionsgradienten und des Injektionsvolumens und den Versuch, die Zielfraktionen von den Nebenprodukten zu trennen, umfassen. Weitere Informationen darüber, wie die Auflösung bei der HPLC-Reinigung des Ionenaustauschs erhöht werden kann, wurden von Karlsson et al.31diskutiert. Die HPLC trennt die Ziel-RNA von längeren oder kürzeren Nukleinsäuren und Protein- oder niedermolekularen Verunreinigungen. Abbildung 3B zeigt das optimale Ergebnis für die Ionenaustausch-HPLC-Reinigung. Der Elutionsgradient sollte so gewählt werden, dass die Ziel-RNA-Spezies mindestens ein Säulenvolumen (in diesem Beispiel: 35 ml) nach der nächstkleineren Spezies und ein Säulenvolumen vor der nächst größeren Spezies eluiert.
Kleinere Spezies in dieser Methode umfassen einzelne Nukleotide, abtreibende Produkte (8-12 nt), 3' und 5' Abstandhaltersequenzen (5-14 nt) und Spaltleiter (12 nt chimäre Nukleinsäure), während längere Sequenzen potenziell ungereinigte Tandemwiederholungen und das Plasmid sind. Wenn ein gut getrennter Elutionspeak erreicht wird, kann die Reinigung auf das Äquivalent von ~ 20 ml IVT-Reaktion pro Injektion skaliert werden. Die korrekte Faltung einer RNA-Probe ist entscheidend für RD-Experimente und muss vor jeder Messung bestätigt werden. Abbildung 4 zeigt eine A-markierte 22-mer-RNA vor dem Faltungsprotokoll in Schritt 2.4 (blau) und die gleiche Probe nach Erreichen der korrekten Faltung (rot). Eine Mc-Fold-Sekundärstrukturvorhersage (Abbildung 4C) schlägt die vorgestellte Haarnadelstruktur mit 4 Basenpaaren vor, die zu 5 Iminosignalen führen.
Beide Spektren in Abbildung 4A bestätigen diese vorhergesagten Signale, wenn auch mit leicht unterschiedlichen relativen Intensitäten, was darauf hindeutet, dass eine fehlgefaltete Struktur (hier ein Dimer) mit nur 1 H 1D-Spektrenproblematisch zu beurteilen sein kann. Ein aromatisches 1H,13C-HSQC Spektrum (Abbildung 4B), zeigt jedoch nur 3 der aromatischen Signale für die Probe vor dem Faltungsprotokoll (blau), aber alle 4 Signale für die Probe, die gemäß Schritt 2.4 (rot) gefaltet wurde. Die in Blau gezeigte Probe bildete wahrscheinlich ein Homodimer (in Abbildung 4Dvorgeschlagene Struktur), das zu den gleichen Iminosignalen wie die Haarnadel führen würde. Das Signal von A13H2 scheint börsenverbreitet zu sein. Diese Ergebnisse helfen, die Bedeutung der Faltbestätigung mit Imino- und aromatischen Fingerabdruckexperimenten vor jedem RD-Experiment hervorzuheben. Die in diesem Protokoll beschriebenen 1HR1ρ Pulssequenzen ermöglichen die Detektion von Dynamiken im Zwischenaustauschregime. Zunächst wird eine On-Resonanz-Kurve aufgezeichnet, und wenn Dynamik für einen bestimmten Rückstand vorhanden ist, ist eine Dispersion innerhalb der erhaltenen R2+REX-Werte sichtbar, während diese Kurve für Rückstände ohne Austausch flach ist.
Abbildung 5 zeigt repräsentative On-Resonanz-Kurven, die für zwei verschiedene H8-Atome in einer synthetischen RNA-Haarnadel erhalten wurden (Abbildung 5A), wobei G6H8 einen Austausch erfährt (Abbildung 5C), während A4H8 dies nicht tut (Abbildung 5B). Da der Austausch in dieser Probe relativ langsam ist (kEX = 292 ± 40 Hz), wurde der Vorteil des SELOPE-Experiments genutzt, niedrige SL-Festigkeiten zu erreichen, und die beiden On-Resonanzkurven wurden mit der 1D-Version der Pulssequenz aufgezeichnet. Die gleiche Pulssequenz wurde dann verwendet, um Off-Resonanz-Daten für den Rückstand zu erhalten, der eine Dispersion im On-Resonanz-Profil zeigt. Abbildung 5D zeigt die erhaltenenR1ρ-Werte vs. Offset, wobei eine leichte Asymmetrie der Kurve bereits das Vorzeichen von Δωanzeigt. 
Dies wird noch deutlicher imR2 +REX-Diagramm, wo derR1-Beitrag entfernt wird (Abbildung 5E). Die rechte Spalte der gleichen Abbildung zeigt repräsentative On-Resonanz-Kurven, die für zwei verschiedene H8-Atome in einer leicht unterschiedlichen synthetischen RNA-Haarnadel mit schnellerem Austausch erhalten wurden, wobei G6H8 einen Austausch erfährt (Abbildung 5G), während A4H8 dies nicht tut (Abbildung 5F). Der schnellere Wechselkurs (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) ermöglichte die RD-Aufzeichnung aller aromatischen Protonen auf einmal mit der SELOPE 2D-Version, um sowohl On- als auch Off-Resonanz-Daten zu erhalten (G6H8-Daten in Abbildung 5H,I).
Allgemeine Identifikatoren für positive und negative Ergebnisse Positive Ergebnisse im Tandem IVT und RNase H Spaltung können wie folgt identifiziert werden: 1) Das Zielband ist das stärkste Band im denaturierenden PAGE Gel. 2) Es gibt keine oder nur schwache Bänder um das Hauptband. 3) Es gibt keine oder nur schwache Spezies mit höherem Molekulargewicht. 4) Das HPLC-Chromatogramm zeigt einen gut getrennten Peak der Ziel-RNA. 5) Wenn der Hauptpeak abgetastet wird, erscheint nur ein Band auf einem denaturierenden PAGE-Gel.
Negative Ergebnisse in der Tandem-IVT- und RNase-H-Spaltung liegen wie folgt vor: 1) Auf einem denaturierenden PAGE-Gel ist kein oder nur ein schwaches Hauptband sichtbar. 2) Ein Muster hochmolekularer Spezies aus RNA-Tandem-Wiederholungen ist sichtbar. 3) Obwohl das Hauptband vorhanden ist, liegen Bänder ähnlicher Intensität über oder unter dem Hauptband innerhalb ± 3 nt.
Eine gut gefaltete Probe kann wie folgt identifiziert werden: 1) Die Anzahl der beobachteten Imino-Protonen entspricht der Anzahl der Imino-Protonen, die von einer Sekundärstruktursimulation erwartet werden(z. B.Mc-Fold39, Abbildung 4A). 2) Das syn G-U Wackelbasenpaar in einer UUCG-Schleife (falls vorhanden) ist bei ~9,5 ppm sichtbar, manchmal nur bei niedrigerer Temperatur. Weitere Fingerabdrücke der UUCG-Schleife wurden von Fürtig und Kollegenbeschrieben 40. 3) Der aromatische Fingerabdruck stimmt mit einer zuvor zugewiesenen Probe überein, deren korrekte Faltung bestätigt wurde (Abbildung 4C).
Eine falsch gefaltete oder degradierte Probe kann wie folgt identifiziert werden: 1) Es gibt mehr Imino-Signale, als eine Sekundärstruktursimulation vorhersagt (HINWEIS: Weniger Imino-Signale implizieren nicht unbedingt eine Fehlfaltung, da schließende Basenpaare oft nicht sichtbar sind und der Konformationsaustausch die Linien verbreitert). 2) Fehlen von Imino-Signalen. 3) Enge Signale von hoher Intensität im aromatischen Bereich, die auf einzelne Nukleotidabbauprodukte hinweisen. 4) Divergenz zwischen imino- oder aromatischen Signalen zu einer Referenzprobe bestätigter Faltung (Abbildung 4C).
Ein Atom, das keinen Austausch in der nachweisbaren Zeitskala zeigt, kann wie folgt identifiziert werden: 1) aus einem flachen RD-Profil (aufgrund des fehlenden R EX-Beitrags, der mit der angelegten SL-Leistung variiert) (Abbildung 5B und Abbildung 5F). 2) Auf den Fall eines langsamen Zwischenaustauschs ist zu achten, wenn kEX und Δω die gleiche Größenordnung haben. In diesem Fall kann der On-Resonanz-Beitrag sehr gering sein, wie in Abbildung 5C zu sehen ist (in diesem Fall sind die angepassten Parameter kEX = 292 ± 40 Hz und Δω = 112 ± 4 Hz). Im Zweifelsfall kann eine niedrige SL-Off-Resonanzkurve zur Verifizierung aufgezeichnet werden.
Ein Atom, das einen Austausch in der Mittleren Zeitskala zeigt, kann 1) aus einem nicht-flachen Relaxationsdispersionsprofil in einem On-Resonanz-RD-Experiment identifiziert werden (Abbildung 5B und Abbildung 5F); 2) Eine breitere Linienbreite im HSQC- oder SELOPE-Experiment kann auch ein Indikator für den Austausch sein.
Gut ausgewählte SL-Leistungswerte für Off-Resonanzkurven (Abbildung 5E, F): 1) haben einen erheblichen k EX-Beitrag in der On-Resonanz-Kurve (ausgewählte SL-Leistungswerte sind in Abbildung 5C und Abbildung 5Gangegeben). 2) Da Off-Resonanzkurven für mindestens 3 SL-Leistungswerte gemessen werden, sollten die gewählten SL-Leistungswerte über den Bereich der On-Resonanz-Kurve mit kEX-Beitrag verteilt werden. 3) Führen Sie zu nicht flachen R2+REX-Kurven nach der Laguerre-Passform(z. B. Abbildung 5D:SL-Stärken 25, 50 und 75 Hz; Abbildung 5E).
Schlecht gewählte SL-Leistungswerte für Off-Resonanzkurven (Abbildung 5E, F) führen nach der Laguerre-Passform zu flachen R2+REX-Kurven. Ein Beispiel ist in Abbildung 5Edargestellt, wobei die 100 Hz Off-Resonanzkurve sehr flach ist und daher keine signifikanten Informationen über Δωliefert.
Indikationen für rotierende Kern-Overhauser-Effekt-Artefakte (ROE): 1) Δω, die aus Off-Resonanzkurven erhalten werden, stimmen mit chemischen Verschiebungen von Protonen in räumlicher Nähe / Protonen überein, die einen Kreuzpeak mit dem Peak von Interesse im Kern-Overhauser-Effekt-Spektroskopie -Spektrum (NOESY) zeigen. (z.B.zeigt Abbildung 5I breite Off-Resonanzkurven, wie sie für den schnellen Zwischenaustausch erwartet werden, aber die Kurven haben auch schärfere Merkmale, z.B.bei -3000 Hz und +1500 Hz. Diese sind sehr wahrscheinlich eher auf ein ROE-Artefakt als auf eine chemische Verschiebung für dieses H8 in einem anderen Konformer zurückzuführen). 2) Laguerre-Fit funktioniert, funktioniert aber nicht gut (gibt hohe Fehler oder physikalisch unmögliche Werte) für eine On-Resonanz- und mindestens 3 Off-Resonanz-Kurven, obwohl Exponentiale aus Experimenten mit hohem SINO (>20) erhalten wurden(z.B. kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Oft passt jeder SL einzeln gut, aber wenn man sie zusammenfügt, ergibt sich ein viel höherer Fehler; das gegenteilige Verhalten wird für einen echten angeregten Zustand erwartet.
Indikationen für den "wahren" Austausch Δω: 1) Δω, die aus Off-Resonanzkurven erhalten werden, stimmen nicht mit chemischen Verschiebungen von Protonen in räumlicher Nähe/Protonen überein, die einen Kreuzpeak mit dem Peak von Interesse im NOESY-Spektrum zeigen (z. B. Abbildung 5E). 2) Laguerre-Passform ergibt geringe Fehler für eine On-Resonanz- und mindestens 3 Off-Resonanz-Kurven(z. B. Abbildung 5E vs. Abbildung 5I, siehe Beschriftung für Anpassungsergebnisse).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Abbildung 3: Probenproduktion durch T7-Tandem-IVT und RNase-H-Spaltungsreaktion. (A) Denaturierungsseite positiver und negativer Ergebnisse von Tandem-IVT und RNase H-Spaltung. Leiterhöhe bezieht sich auf RNA-Referenzen, 12* bezieht sich auf den chimären Spaltungsleitfaden. Spur 1: Erfolgreiche Generierung einer 20 nt Ziel-RNA. Es gibt nur wenige kürzere und längere Produkte. Spur 2a: Unvollständige Spaltung des Tandem-Transkripts. Obwohl eine HPLC-Reinigung möglich ist, würde viel Material verschwendet. Lane 2b: Die fortgesetzte RNase H-Spaltung von Lane 2 erzeugt eine saubere Probe, die für die HPLC-Injektion bereit ist (identisch mit Lane 1). Lane 4: RNase H Dekolleté war weitgehend erfolglos, und es wurde kein Zielband produziert. Das Tandem-Transkript in voller Länge ist bei 600 nt noch sichtbar. Lane 5: Es wurde ein Zielband produziert, aber ein starkes -1-Band ist vorhanden. Obwohl HPLC durchgeführt werden kann, ist eine sorgfältige Entfernung des Nebenprodukts erforderlich. (B) Beispiel für eine erfolgreiche HPLC-Injektion. Der Peak bei 38 min enthält reine RNA der Ziellänge, während längere und kürzere Produkte gut von der Ziel-RNA getrennt sind. Panel B wurde von 21geändert. Abkürzungen: IVT = in vitro transkription; HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; nt = Nukleotide; AU = beliebige Einheiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Beispiel einer RNA-Haarnadel vor (blau) und nach (rot) dem Faltungsschritt 2.4 (siehe Protokoll) in NMR. (A) Imino-Region eines 1H-1D-Spektrums einer A-markierten 22-mer-RNA. Erwartete Regionen für die Basenpaaridentität von Imino-Signalen sind unten grau dargestellt. (B) 1H,13C-HSQC Spektrum der aromatischen Resonanzen der RNA aus Panel A. Die Probe nach der Faltung (rot) zeigt 4 Signale wie erwartet, während die Probe vor der Faltung (blau) nur 3 Signale zeigt. (C) Mc-Fold-Vorhersage der 22-mer-RNA als Haarnadel. Von dieser Sekundärstruktur sind fünf Iminosignale zu erwarten, die in beiden Proben in Panel A zu finden sind. (D) Vorgeschlagene Struktur eines homodimeren, das von der 22-mer-RNA gebildet wird, was zu den gleichen 5 Basenpaaren wie die Haarnadelstruktur führt. Abkürzungen: NMR = Kernspinresonanz; 1D = eindimensional; HSQC = heteronukleäre Einzelquantenkorrelation; ppm = Teile pro Million. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Abbildung 5: 1H R1ρ RD repräsentative Ergebnisse für zwei verschiedene Konstrukte basierend auf einer RNA-Haarnadel. (A) Die linke Spalte zeigt die Ergebnisse, die auf der RNA mit einem C-G-Basenpaar über dem gewölbten U erzielt wurden, während die rechte Spalte die Ergebnisse einer Probe zeigt, bei der das Basenpaar stattdessen auf G-C umgestellt wurde. (B) und (F) zeigen flache Dispersionsprofile, wie sie für A4H8 für die beiden Konstrukte erhalten wurden, was auf keinen Konformationsaustausch hinweist. (C–E) zeigen On-Resonanz-, Off-Resonanz- und Angepasste-Daten, die für G6 im (G-C) -Konstrukt erhalten wurden. Die Laguerre-Passung führt zu folgendem Ergebnis: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX = 292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) zeigen On-Resonanz-, Off-Resonanz- und Angepasste Daten, die für G6 im (G-C) Konstrukt erhalten wurden. Die Laguerre-Passform führt zu folgendem Ergebnis: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, kEX = 43.502 ± 38.478 Hz, pES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Diese Zahl wurde von 20geändert. Abkürzung: SL = Spin Lock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Mikro- bis Millisekundendynamik auf 13C/15N-markierter und unmarkierter RNA mit 1H R1ρ Relaxationsdispersion Kernspinresonanzspektroskopie (NMR). Der Fokus dieses Protokolls liegt in der hochreinen Probenvorbereitung und dem Aufbau von NMR-Experimenten.

Praktische Aspekte der Probenvorbereitung und des Aufbaus von 1H R1ρ Relaxationsdispersionsexperimenten von RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Dieses Protokoll beschreibt die RNA-Probenvorbereitung und den NMR-Aufbau für Protonen-R1rho-Relaxationsdispersionsmessungen zur Untersuchung des Bestätigungsaustauschs in RNA-Molekülen. Da Protonen untersucht werden, benötigt die Methode keine Isotopenmarkierung und kann direkt auf strukturelle Merkmale wie verschobene Basenpaarung zugreifen. Die Pipette ist ziemlich modular in dem Sinne, dass die R1rho-Relaxationsdispersion auch dann gemessen werden kann, wenn die Probe mit einem anderen Verfahren hergestellt wird.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Plasmidprobe und dem Aufbau einer In-vitro-Transkriptions- und Spaltungsreaktion, wie im Textmanuskript beschrieben. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Anschließend wird ein Mikroliter der Probe in der Ladelösung verzehnfacht.Und führen Sie einen Mikroliter auf einem denaturierenden PAGE-Gel aus. Wenn die Spaltungsreaktion erfolgreich ist, skalieren Sie die Reaktion auf das gewünschte Volumen und führen Sie sie über Nacht aus. Führen Sie dann ein weiteres denaturierendes PAGE-Gel aus und beurteilen Sie, ob die Spaltungsreaktion abgeschlossen ist.Bei unvollständiger Spaltung die Reaktionslösung in einer herkömmlichen Mikrowelle 15 Sekunden lang auf 450 Watt erhitzen. Dann kühlen Sie die Lösung langsam auf 37 Grad Celsius für 40 Minuten ab, um die RNA und den Spaltleiter wieder zuannen. Und beachten Sie die Bildung eines neuen Niederschlags.Fügen Sie mehr anorganische Pyrophosphatase hinzu und RNase H.Inkubieren Sie die Reaktion für ein bis drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Bestätigen Sie dann den Abschluss der Spaltungsreaktion mit der DenaturierungSSEITE. Wenn die RNase H-Spaltungsreaktion abgeschlossen ist, löschen Sie die Reaktion ab, indem Sie EDTA zu einer Endkonzentration von 50 Millimolaren hinzufügen.Und Wirbel gründlich. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter. Und konzentrieren Sie die Lösung auf ein Volumen, das zur Reinigung in ein HPLC-System injiziert werden kann.Bevor Sie die konzentrierte und gereinigte Probe in das NMR-Röhrchen geben, reinigen Sie das Röhrchen, indem Sie es mit reichlich Wasser spülen. Dann RNase Dekontaminationsreagenz, Wasser und 95% Ethanol. Nach dem abschließenden Spülen mit Wasser trocknen lassen.Spülen Sie den Kolben mit Wasser ab und reinigen Sie mit RNase-Dekontaminationsreagenz und 95% Ethanol mit einem fusselfreien Tuch. Nach dem Trocknen des Röhrchens und des Kolbens 10% D2O in die NMR-Probe geben. Verwenden Sie eine große Pipettenspitze, um die RNA-Probe in das NMR-Röhrchen zu übertragen und entlang der Seite der Röhrenwand zu fließen.Setzen Sie den Kolben in das Rohr ein, indem Sie ihn mit einer schnellen Drehbewegung nach unten drücken, um Luftblasen zu entfernen, und ziehen Sie den Kolben dann langsam nach oben, ohne neue Luftblasen zu erzeugen. Und fixieren Sie es mit Paraffinwachsfolie. Erstellen Sie einen neuen Datensatz basierend auf einem aromatischen Protonenkohlenstoff-HSQC-Datensatz, der auf vollständig markierten RNA-Proben für die RNA-Zuweisung verwendet wird.Legen Sie die allgemeinen Parameter und RD-spezifischen Parameter fest. Stellen Sie dann die Protonen-Spin-Lock-Leistung zum Testen auf 1,2 Kilohertz ein. Generieren Sie eine Test-VD-Liste mit nur einem Eintrag, null Millisekunden, legen Sie TDF1 auf eins fest, und aktualisieren Sie D30, um ein Testspektrum auszuführen.Nachdem Sie eine Test-vd-Liste eingerichtet haben, aktualisieren Sie D30 und TDF1. Und zeichnen Sie die Intensität des Peaks für verschiedene Spin-Lock-Längen auf. Identifizieren Sie die Spin-Lock-Länge, bei der die Intensität des ursprünglichen Peaks auf ein Drittel abnimmt.Erstellen Sie aus dem Ergebnis der Testläufe die endgültige vd-Liste, die im Experiment verwendet werden soll. Wählen Sie die Anzahl der Scans aus, sodass der schwächste Peak der Liste ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 10 aufweist. Die Ergebnisse mehrerer Spaltreaktionen von Tandem-Transkripten werden hier gezeigt.In einer erfolgreichen Reaktion wurde eine 20-Nukleotid-Ziel-RNA erzeugt. Erfolglose Reaktionen führten zu einer unvollständigen und fehlgeschlagenen Spaltung der Probe. Die HPLC-Injektion der RNA-Probe zeigte einen Peak für reine Ziel-RNA nach 38 Minuten.Während längere und kürzere Produkte gut vom Peak of Interest getrennt waren. Die Analyse der RNA-Haarnadel zeigte, dass die Anzahl der beobachteten Imino-Protonen mit der Anzahl der Imino-Protonen übereinstimmte, die aus einer Sekundärstruktursimulation erwartet wurden. Das Protonenkohlenstoff-HSQC-Spektrum der aromatischen Resonanzen der RNA zeigte nach der Faltung vier Signale.Und nur drei Signale vor dem Falten. In den repräsentativen Resonanzkurven, die für zwei verschiedene H8-Atome und zwei verschiedene synthetische RNA-Haarnadeln erhalten wurden, erfährt die G6H8 einen bestätigungserischen Austausch. Während der A4H8 dies nicht tut.Für G6H8 wurden die farbigen Spin-Lock-Kräfte ausgewählt und Off-Resonanz-Daten aufgezeichnet. Im CG-Konstrukt, in dem der Austausch langsam ist, zeigten die R1rho-Zeilenwerte im Vergleich zum Offset-Diagramm bereits eine leichte Asymmetrie der Kurve, die das Vorzeichen der chemischen Verschiebungsdifferenz Delta Omega anzeigt. Dies wird im R2 plus REX-Diagramm noch deutlicher, wo der R1-Beitrag entfernt wird.Auf der anderen Seite erfährt das GC-Konstrukt einen schnelleren Austausch und das R1rho-Werte-Offset-Diagramm stellte eine breitere Kurve dar, in der die Extraktion von Delta-Omega selbst im R2 plus REX-Diagramm weniger offensichtlich wird. Ist die RNA-Dynamik aufgeklärt, können die Zustände charakterisiert und eingefangen werden. Diese gefangenen Zustände können beispielsweise in biologischen Assays getestet werden.Diese Methode ermöglicht es uns, funktionelle, relevante Basenpaarverschiebungen in einem aktiven microRNA-miRNA-Komplex, Schleifenumlagerungen in ribosomaler RNA und Basenpaarstabilität auf einzelnen Nukleotidwölbungen zu beobachten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Forschung

Biochemie

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Detektion und Charakterisierung von Selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...