אנו מודים למתקן למדע החלבון (PSF) במכון קרולינסקה על ביטוי וטיהור של T7 RNA פולימראז ו- E. coli RNase H, מרטין האלברג על המתנה הנדיבה של הפוספטאז האנאורגני, ועל פטזולאב כולו לדיונים חשובים. אנו מודים ללוקה רטינו על הכנת מבני U-בליטה ואמילי שטיינר וקרוליינה פונטנה על תרומתם לפקודות מאקרו ותסריטים מתאימים. אנו מכירים במכון קרולינסקה ובחטיבה לביוכימיה רפואית וביופיזיקה לתמיכה ברכישת ספקטרומטר 600 מגה-הרץ ומימון פוזיציות (KI FoAss ו-KID 2-3707/2013). אנו אסירי תודה על התרומה הכספית של Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 ו- FFL15-0178) ורגנאר סודרברג סטיפלסה (M91-14), הארלד אוק גרטה ג'ינסון סטיפלסה ((באנגלית: Ragnar Söderberg Stiftelse) JS20140009), קרל טריגרס סטיפלסה (CTS14-383 ו-15-383), אווה אוק אוסקר ארנס סטיפלסה, אקה ויברג סטיפלסה (467080968 ו-M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. מכיר במימון באמצעות מארי Skłodowska-Curie אם (האיחוד האירופי H2020, פרויקט מס' 747446 של MSCA-IF).

K.P. הוא יועץ Arrakis Therapeutics, חברה המגלה מולקולות קטנות מיקוד RNA.

הפרוטוקול המוצג כאן הוא סינתזה של מספר פרוטוקולים שפורסמו בעבר בצורה של מאמרי מחקר10,20,21,31. לפיכך, ניתן להחיל מקטעים של הפרוטוקול, בעוד שאחרים יכולים להיות מוחלפים להעדפת הקורא. לדוגמה, ניתן לבצע את מדידות R1ρ על דגימת RNA המיוצרת בכל שיטה, בהתחשב בכך שקיפול והומוגניות של אורך מניחים. יתר על כן, הפרוטוקול אינו מכיל מידע על הקצאת תהודה של רצף RNA - צעד הנדרש לניסויי RD - שכן זה כוסה בהרחבה בספרותהקודמת 19,37,38. תוכניות תיוג חלקיות, מגזריות או ספציפיות לאתר36,41,42,43,44 הן גישות כדי להקל על הקצאת תהודה או להפחית את החפיפה של תהודה כי הם עניין בניסויי מו"פ תוארו באריכות בספרות. שיטה זו מאפשרת שימוש בתיוג אחיד של כל זהות נוקלאוטיד, אשר כבר יכול לפשט את הקצאת התהודה באופן משמעותי.
שיטת ה- IVT המוצגת כאן מתגברת על בעיות ידועות עם רצפים ותיוג, מגדילה את התשואה ומקטינה את העלות ואת זמן העבודה בהשוואה לשיטות אחרות. השימוש ברצף החניכה הנגיפי מפחית את הצורך באופטימיזציה של תגובה, שהיא בעיה ידועה בתחום שיכולה לגזול זמן רב לביצועים ומניבה רק עותקים מעטים של התמליל במקרה של חניכה שאינה G. מחשוף T7 IVT ו- RNase H של תעתיק הטנדם יכול להתבצע בו זמנית באותו כלי. דפוס של חזרות דו-מושביות רב-מרתיות ניתן לראות על ג'ל PAGE מתמתק במהלך התגובה, המתמזג לפס אחד על הרנ"א היעד עם השלמת תגובת RNase H(איור 3A,נתיבים 1 ו- 2b). תשואות אופייניות בשיטה זו נעות בין RNA של 30 ל- 70 ננומטר לכל 1 מ"ל IVT. עם זאת, השיטה המבוססת על מחשוף RNase H של חזרות טנדם אינה באה ללא בעיות מסוימות משלה. תגובת מחשוף RNase H לעתים קרובות אינה יורדת להשלמה כאשר היא פועלת בו זמנית עם תמלול T7(איור 3A,נתיב 2a).
ניתן להשלים את ההפרדה בין יחידות טנדם על ידי חישול מדריך המחשוף לתעתיק והוספת RNase H(איור 3A,נתיב 2b, שלב 2.1.2). כמו חימום של כמויות גדולות הוא איטי ומוביל Mg2 +- מזורז הידרוליזה של RNA, מיקרוגל קונבנציונאלי שימש, אשר מחמם את המדגם כדי >95 °C (55 °F) ב 10-15 s. תופעות לוואי על הדגימות המיוצרות לא נצפו עד כה. מבנים מסוימים מראים רצועה שנייה קטנה שלא ניתן היה לבטלה על ידי אופטימיזציה של תנאי התגובה(איור 3A, נתיב 4). בדרך כלל אלה נראים בבירור ככתף בכרומטוגרמה של HPLC, אם נעשה שימוש בשיפוע אלוטציה ממוטב היטב, וניתן להסיר אותם (שלב 2.2.5). הדיון הבא נועד להדגיש צעדים קריטיים בפרוטוקול, במיוחד בכל הנוגע להשגת נתונים באיכות גבוהה המאפשרים פרשנות של דינמיקה קונפורמיאלית.
זיהום RNase RNases חוץ תאיים נמצאים בכל מקום, יציב מאוד, ומהווים את האיום הגדול ביותר ליציבות ארוכת טווח של דגימות NMR. לכן, זה חיוני לעבוד בסביבה ללא RNase ולשמור על כל ריאגנטים ותוכנות פלסטיק RNase ללא. מומלץ להשתמש בטיפים לסינון ואולי אפילו במסות פנים. הדבר חשוב במיוחד לאחר טיהור HPLC. דגימות NMR מזוהמות עם RNases בדרך כלל להציג פסגות צרות גלויות ספקטרום 1H-1D לאחר ימים או שבועות עקב מוצרי השפלה נוקלאוטיד יחיד. מדגם כזה אינו מתאים למדידות R1ρ. 
דגימת NMR בשל אופיו הטעון מאוד, ניתן להשתמש ב- RNA בריכוזים גבוהים ללא משקעים בהשוואה לרוב החלבונים. השימוש בצינורות שיגמי NMR (ראה טבלת החומרים) הוא יתרון שכן הם מאפשרים ריכוז המדגם המרוכז ביותר במרכז סליל תוך מתן תנאי שיימינג ונעילה אידיאליים בשל תחתית הזכוכית הבוכנה תואמת הרגישות ואת הבוכנה. בדרך זו, B1-inhomogeneity מצטמצם, מה שמוליד קווים צרים יותר. נפח המדגם הטיפוסי בצינור NMR הוא 250 μL, וריכוז טיפוסי הוא 1-2 mM. דגימות מתחת 500 מיקרומטר אינן מומלצות לניסויי מו"פ מכיוון שהניסוי ייקח יותר מדי זמן ו- shim טוב. באופן דומה, נפח מדגם מתחת 200 μL אינו מומלץ כי שיים טוב ויציבות שדה (מנעול) נדרש. בעת החדרת הבוכנה, חשוב להימנע מהיווצרות בועות במדגם (שלב 2.4.5). אם לא קבוע כראוי, הבוכנה יכולה להחליק למטה לתוך המדגם, הפחתת עוצמת הקול הניתן לזיהוי. יתר על כן, שינויים מהירים בטמפרטורה יכולים להוביל להיווצרות של בועות חדשות במדגם. לכן, יש לנקוט זהירות בעת הובלת המדגם וכאשר משנים את טמפרטורת הבדיקה בספקטרומטר NMR. בדוק את המדגם עבור בועות בעת מדידה שוב לאחר תקופה ארוכה יותר.
קיפול RNA מולקולות RNA דינמיות יכולות להתקיים בקונפורציות מרובות כאשר הן אינן מקופלות כראוי. למרות שטמפרטורות ההיתוך של מבנים משניים יכולות להיות רק מעט מעל טמפרטורת החדר, מומלץ הליך חימום וקירור יסודי לפני המדידה. דגימות סיכת ראש מרוכזות במיוחד המתקפלות תחת שליטה קינטית (חימום וקירור הצמדה) יכולות ליצור הומודימרים לאורך זמן, מה שמחייב שליטה קפדנית בקיפול RNA לפני כל מדידת NMR. אם הרנ"א הנמדד אינו מבנה סיכת ראש אלא דופלקס RNA, יש להחיל קיפול איטי תחת שליטה תרמודינמית.
במקרה זה, תהליך הקירור לאחר החימום צריך להיות בטווח של שעות, בעוד RNA משמש בנפח הסופי שלה וריכוז במדגם NMR. ספירה ראשונית של תהודה אימונית וארומטית צפויה יכולה לספק תובנה על ההומוגניות של המדגם. אם המדגם לא נראה כמו צפוי, זה צריך להיות מקופל מחדש. מ"ג2+ (נוסף כמלח כלוריד) יכול לעזור עם קיפול מבני RNA45. בפועל, בקרת הקיפול משמשת כהשוואה לדגימה ששימשה לפחות באופן חלקי להקצאת תהודה של NMR ולפתור את המבנה המשני באופן ניסיוני.
ספין נעילת שיקולי חשמל וחימום במקרה של הפעלת ניסויי 1H R1ρ RD כניסויים סקירה 2D, כוח SL צריך להיות לא פחות מ 1.2 kHz. תדר משדר גלי הרדיו צריך להיות ממוקם באמצע אזור ppm של פסגות עניין (למשל .,7.5 ppm עבור פרוטונים ארומטיים). רוחב הפס של 1.2 קילו-הרץ יהיה גדול מספיק כדי לנעול פרוטונים אלה ללא אפקטים גדולים מחוץ לתהודה. אפקטים כאלה ניתן לזהות בפרופיל RD. אם הם מתרחשים, ערכי R2+REX גדלים במקום להקטין עם הגדלת ערכי צריכת החשמל של SL, במיוחד עבור צריכת SL נמוכה. בדוק אם ערכי צריכת החשמל המחושב של SL תואמים לצרימת החשמל המועברת לדגימה. בפועל, כוח SL מחושב יכול לשמש אם הדופק הקשה 1H 90° היה מכויל בקפידה על ספקטרומטרים חדשים יותר; עם זאת, ניתן לבדוק זאת על-ידי כיול עוצמת SL עבור כל רוחב פס רצוי.
טווח ההספק של SL, אשר ניתן להשתמש בניסויי RD H R1ρ הוא רחב מאוד, המוביל לחימום מדגם משתנה (1.2 kHz עד 15 kHz עבור HSQC עבור רצפים מבוססי HCP ו 50 הרץ עד 15 kHz לניסויי SELOPE). חימום מדגם לא שוויוני ניתן לזהות כשינוי קל בשינוי כימי בעת השוואת 1Ds המתקבל עבור SLs בהספק נמוך לעומת. אס.אל. השפעה זו בדרך כלל אינה נחשבת פיצויי חום בניסויי R1ρ על heteronuclei. פיצוי חום בניסויים אלה מוגדר בדרך כלל כדי לתקן עבור חימום שונה בשל משכי נעילת ספין שונים שצוינו ברשימת vd של כל סדרת כוח נעילת ספין. במיוחד עבור ניסוי SELOPE, פיצוי חום שני צריך לשמש על פני כל נקודות החוזק SL החלות כפי שתואר ב20.
שיקולי רשימת vd כפי שהוזכר קודם לכן, רשימת VD צריך להכיל נקודת זמן מספיק זמן כדי להשיג ריקבון משמעותי של אינטנסיביות (באופן אידיאלי עד 30% של האות הראשוני, או נמוך ככל האפשר אם לא ניתן להגיע 70% ריקבון בתוך המפרט של הבדיקה). למרות שרשימת VD הייתה ממוטבת עבור הספק SL נמוך (1.2 kHz), רשימת vd זו צריכה להיבדק גם בהספק SL הגבוה ביותר לשימוש (למשל., 15 kHz). זאת בשל העובדה, כי עבור פסגות עם תרומת REX משמעותית, הריקבון יהיה הרבה יותר איטי בעוצמה SL גבוהה. אז ריקבון מספיק צריך להיות מאומת גם בעוצמה SL גבוהה. אותו הדבר יש לשקול עבור ריקבון ב קיזוזים גבוהים בניסויים מחוץ תהודה. נקודת הזמן המרבית האידיאלית של רשימת VD יכולה להיות שונה באופן משמעותי עבור האזורים השונים של ניסוי הפיזור. במקרה זה, ניתן לכלול יותר נקודות ברשימת VD, ונקודות רשימת VD הארוכות יותר עבור כוח SL גבוה יותר או היכודים גבוהים יותר במהלך הניתוח, בהתבסס על SINO נמוך הם יובילו, ניתן לבטל. באופן כללי, יש לשקול 5-8 נקודות רשימה vd להיות מסוגל לזהות חפצים פוטנציאליים המובילים ריקבון לא מעריכי כגון J-צימוד (ראה להלן).
1D-שיקולי סלקטיביות של HCP יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת הפעלת גירסת 1D מבוססת HCP אם יש שיא נוסף החופף לשיא העניין בממד 1H של הניסוי מבוסס HSQC 2D. העברות מבוססות HCP הן מאוד, אך אף פעם לא סלקטיביות ב-100%, ולכן יכול לקרות ששיא נוסף תורם לאינטנסיביות ולריקבון של שיא העניין ב-1D. אינדיקציה לכך תהיה הבדל בערכי R 1ρ בתהודה המתקבלים באמצעות גרסאות 1D ו- 2D של הניסוי שכותרתו.
שיקולי ROE: עבור עקומות מחוץ לתהודה של אטומים עם חילופי ביניים איטיים, ניתן לזהות חפצי ROE בהתבסס על השוואה של Δω המתקבל עם ספקטרום NOESY או ROESY. אם ניתן לזהות פסגת חוצה בהפרש תזוזה כימי המתאים ל- Δω, אז המצב הנרגש הנצפה עשוי למעשה להיות חפץ ROE (למשל. מניסיון, זה תמיד הוביל גם להתקפים גרועים עם שגיאות גדולות, אולי בגלל ROE לא בעקבות אותה תבנית כמו REX עם הגדלת כוח SL. המצב הופך להיות קשה יותר עבור חילופי ביניים מהירים. בעוד עקומת התהודה היא (בהשוואה לנתוני 13C המתקבלים בגרעין השכן) עדיין מייצגת את תהליך החליפין בין GS ו- ES, עקומת התהודה מושפעת מחפצי ROE מרובים.
במקרה זה, כוח SL כדי לזהות את תהליך החליפין הוא גדול יותר (>1.5 kHz) ולכן משתרע על פני מספר גדול יותר של פרוטונים כמו עקומות מחוץ תהודה משתרע על הבדלי משמרות כימיות של מועמדים ROE שונים (עבור H8 אלה יהיו: פרוטוני אמינו ב ca. ±1000 הרץ, H5 / H1 של ב ca. -1200 הרץ, פרוטונים imino ב ca. 3500 הרץ). עד כה, לא נמצאה שיטה לדיכוי חפצי ROE אלה (מלבד שימוש בנוקלאוטידים מפורקים חלקית46), ולא ניתן לכלול נתוני תהודה להחלפה מהירה, שכן לא ניתן לחלץ מידע אמין על Δω בפועל בשיטה זו, אם לא ניתן לשלול תרומת NOE /ROE באמצעות ספקטרום NOESY.
J-צימוד (הרטמן-האן) שיקולים למרות עקומות על תהודה עבור פרוטונים J-מצמיד הומונוקלאר, כגון H6, נרשמו בהצלחה10,20, יש לנקוט טיפול מיוחד עבור מדידות מחוץ תהודה, במיוחד עבור כוח SL נמוך כמו התנאים התואמים הרטמן-האן יכול להתפרש על מגוון רחב של קיזוזים נחקרים. ניתן לזהות את חפצי הרטמן-האן כתנודות על הריקבון המעריכי או להגדיל את ערכי R2+REX עם עוצמות SL הולכות וגדלות בחלקות מו"פ על התהודה20.

RNAs לבצע שפע שלרגולציה 1, קטליטי2, ופונקציות מבניות3 בתא, שרבים מהם מתואמים למבנה מולקולרי גמיש ושינויים מורכבים של מבנים אלה4,5,6,7. מדינות מאוכלסות נמוכות נשארות בלתי נראות לרוב השיטות לקביעת מבנים או אינן מאפשרות את חקר מצבים נסתרים אלה ברזולוציה אטומית גבוהה. ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) של מצב פתרון משלבת את שני ההיבטים על ידי מתן גישה לגרעיני אטומים בודדים, כמו גם הצעת ארגז כלים גדול של ניסויים המתמקדים בדינמיקה באמצעות משטרי כל הזמנים8. ניסויי RD NMR מספקים גישה לחילופי קונפורמציה בציר הזמן הבינוני, שבו צפויים שינויים בדפוסי זיווג הבסיס ובארגון מחדש מבני מקומי5,9,10,11,12,13,14. ניסויי מו"פ מבוצעים כמדידות R2 ארוכות בצורת רכבת פולס קאר-פרסל-מייבום-גיל15 או כמדידות הרפיה במסגרת המסתובבת, הנקראת ניסויי R1ρ RD16.
למרות ששניהם יכולים לשמש לחילוץ אוכלוסייה ושער חליפין והפרש תזוזה כימי למצב המשני, ניסויי R1ρ RD גם נותנים את הסימן להבדל המשמרת הכימית של המצב הנרגש. זה מאפשר מסקנה על מבנה משני, אשר מתאם מאוד לשינוי כימי במבני RNA17. השינוי הכימי הוא אינדיקטור טוב של helicity במקרה של פרוטונים ארומטיים ופחמנים על nucleobases, של שותפי זיווג בסיס עבור פרוטונים imino, ושל דסקי סוכר על C4 ' ו C1 ' אטומים18,19. יש לציין כי לאחרונה ניסוי העברת רוויית חילופי כימיקלים (CEST) באמצעות כוח נעילת ספין גבוהה יותר (SL), ובכך הסטת הישימות של ניסוי CEST כדי להחליף לוחות זמנים מהירים יותר, פורסם כחלופה לניסוי R1ρ RD למערכות עם מצב נרגש אחד.
למרות 13C ו 15N איזוטופים שימשו לעתים קרובות כדי לגשת חילופי מבנים, עבודה האחרונה ממעבדה זו השתמש פרוטונים ארומטיים imino כמו בדיקות עבור חילופי קונפורמציה9,10. השימוש ב- 1H כגרעין הנצפה מביא מספר יתרונות, לדוגמה, גישה להחלפה בלוחות זמנים מהירים ואיטיים יותר, רגישות גבוהה יותר זמני מדידה קצרים יותר. זה מתאפשר עוד יותר על ידי גישת ניסוי פרוטון ממוטב SELective (SELOPE), מתן גישה פרוטונים ארומטיים באמצעות decrowding של ספקטרום חד ממדי (1D) באמצעות צימודים סקלריים הומו-גרעיניים, במקום העברת מגנטיזציה הטרונוקלרית, וביטול הצורך בתוויות איזוטופ20. פרוטוקול זה מטפל במדידה בניסויי RD של 1H R1ρ של דגימות אחידות של 13C/15N עם תווית N ולא מתויגות. לכן, מאמר זה מציג שיטת הכנה לדוגמה שנמצאה כרב-תכליתית ביותר לצרכי הכנת מדגם שונים21 ודן בחלופות בחלק האחרון של מאמר זה (איור 1).
בשלב זה, הקורא צריך לציין כי טכניקות הכנה מדגם אחרות מקובלות עבור 1H R1ρ RD ניסויים, וכי שיטות אחרות של ניתוח מבני ופונקציונלי יכול להתבצע עם הדגימות מסונתז עם הטכניקה המוצגת. 1 ניסויי H R1ρ RD דורשים ריכוזי RNA גבוהים (באופן אידיאלי >1 mM) כמו גם הומוגניות גבוהה, הן באורך RNA והן בקונפורמציה מבנית כדי להבטיח אפיון אמין של דינמיקה מולקולרית. תמלול במבחנה (IVT) היא שיטת הבחירה עבור חוקרים רבים לייצר 13 C/15 דגימותRNA עם תווית N בשל הזמינות של טריפוספטים נוקלאוזידים מסומנים (NTPs) והתאגדות facile בתגובה אנזימטית22. עם זאת, T7 RNA פולימראז בשימוש נרחב (T7RNAP)23,24,25 סובל הומוגניות נמוכה 5 'במקרה של רצפי חניכה מסוימים26,27 ולעתים קרובות גם 3 ' הומוגניות במהלך נגר תמלול28. טיהור מינים RNA היעד הופך יקר יותר ומייגע בשל הצורך בכמויות גדולות של ~ 200 נמול. השיטה המשמשת כאן הוצגה בעבר שבה נדונו היתרונותבכללותו 21. בקצרה, הוא פותר בעיות המתוארות על ידי תעתיק דו-מושבי גדול יותר, שאז הוא נבקע במיוחד על ידי Escherichia coli RNase H, בהדרכת אוליגונוקלאוטיד כימרי29,30 (ראה איור 2 לפרטים).
שילוב של רצף מרווחים בקצוות 5' ו-3' של תמליל הטנדם מאפשר שימוש ברצף ייזום בתפוקה גבוהה והסרת אובר-התייבשות סופניות קרוב לאתר הליניאריזציה של תבנית הפלסמיד, בהתאמה (איור 2B). השיטה הוצגה כדי לשפר את התשואות באופן משמעותי, תוך הפחתת עלות ועבודה, עם אזהרה של סינתזת תבנית מורכבת יותר ואת הצורך אנזים נוסף אוליגונוקלאוטיד. הספציפיות הגבוהה של מחשוף RNase H מקלה על הטיהור בשל היעדר מינים RNA בטווח גודל דומה. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשלב כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) של החלפת יונים שפורסם על ידי מעבדה זו לאחרונה31, אם כי שיטות אחרות הן חלופות אפשריות. 1 H R1ρ RD יכול, באופן כללי, להיות נרכש על דגימות מסומנות או ללא תווית עם שני רצפי פעימה בהתאמה, "מסומן" 1H R1ρ הטרונוקליר יחיד מתאם קוונטי (HSQC) מבוסס ניסוי עם 13 C עקיף ממד 10ואת "לא תווית" 1H R1ρ SELOPE מבוסס על ממד עקיף 1H20.
ניסויים דו-ממדיים אלה (דו-ממדיים) יכולים לשמש בדיקה ראשונה, ללא קשר לשאלה אם הדינמיקה בציר הזמן R1ρ קיימת במדגם. סקירה כללית של מו"פ עבור כל הפסגות שנפתרו בספקטרום ניתן להשיג, ופסגות עניין לניתוח מו"פ יסודי יותר ניתן לזהות. משמעות הדבר היא כי אפילו דגימות ללא תווית ניתן לבדוק לפני החלטה לייצר מדגם יקר יותר, מתויג מתקבל. לאחר שיא עם תרומת חילופי קונפורמציה נבחר להיחקר ביסודיות רבה יותר, עדיף לעבור לגרסאות 1D של הניסויים לעיל (אם השיא עדיין ניתן לפתור) כדי לבצע מה שנקרא ניסויים מחוץ תהודה. עבור הגירסה המסומנת, העברת HSQC ל- 13C מוחלפת בשלב סלקטיבי של קיטוב הטרונוקלרי (HCP) כפי שנעשה שימוש בניסויים 32,33,34,35, בעוד שבמקרה של ניסוי SELOPE, הניסוי פשוט מנוהל כ- 1D, אשר שימושי במיוחד עבור אותות H8 ו- H2 השוכבים באלכסון ב- 2D בכל מקרה. קריטריון אחד לגבי איזה רצף להשתמש, בתנאי ששניהם, מסומנים כמו גם מדגם ללא תווית זמינים, הוא עד כמה מבודד שיא העניין בשני הניסויים.
באופן כללי, הניסוי SELOPE מומלץ עבור דגימות RNA של עד 50 נוקלאוטידים. עבור RNAs גדולים יותר, החפיפה תהיה גדולה יותר; עם זאת, נוקלאוטידים מעניינים מבחינה מבנית מופיעים לעתים קרובות באזורי שינוי כימיים שהם פחות חופפים ועדיין עשויים להיות נגישים ב- RNAs גדולים עוד יותר. טיעון נוסף יהיה כי בדגימות ללא תווית, אין J-צימוד מתרחש בין 1H ו 12C. עם זאת, מכיוון שכוח נעילת הסיבוב המינימלי מוגדר על ידי הכוח המינימלי המשמש לניתוק שני הסיבובים הללו (~ 1 kHz) בניסוי המסומן, הניסוי הלא מתויג מאפשר שימוש בטווח רחב יותר של עוצמות נעילת ספין (SL) ולכן, גישה לטווח זמן רחב יותר של חליפין. ניסויים אלה מחוץ תהודה לספק מידע נוסף kex, כגון אוכלוסיית המצב הנרגש (קונפורמייר חלופי), pES, כמו גם מידע משמרת כימית יקר מאוד בצורה של Δω (ההבדל שינוי כימי של מצב הקרקע ואת המצב הנרגש).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> איור 1: זרימת עבודה של הפרוטוקול המוצג. הכנה לפני ייצור מדגם בקנה מידה גדול בפועל, המורכב הכנת תבנית ואישור מוצלח של תמלול במבחנה ומחשוף RNase H. ייצור בקנה מידה גדול כולל טיהור HPLC, מילוי צינור NMR ואישור של קיפול RNA. במקרה של סינתזה עם תווית איזוטופ, יש לבצע טיהור ללא תווית לאופטימיזציה הדרגתית באותו יום. אפיון NMR של דינמיקה קונפורמציה עם ניסויי R1ρ. כל שלב יכול להתבצע באופן עצמאי, למשל., ניתוח 1H R1ρ RD ניתן להחיל על כל דגימת RNA מתאימה המיוצרת בשיטה אחרת. קיצורים: IVT = תמלול במבחנה; HPLC = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים; NMR = תהודה מגנטית גרעינית; RD = פיזור הרפיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מטרת פרוטוקול זה היא לספק פרטיםמעשיים ופרמטרים קריטיים לחקר הדינמיקה הקונפורמציה עם פיזור הרפיה 1 H R1ρ במולקולות סיכת ראש RNA. לאחר מתן פרוטוקול מפורט של טיהור HPLC של תכנון, סינתזה והחלפת יונים של RNA יעד שניתן לבצע באמצעות כל, חלקם, או אף אחד NTPs כגירסאות 13C /15N-labeled, זרימת העבודה של השלמת מדגם NMR ואישור חילופי הקונפורמציה עם ספקטרוסקופיית NMR תוארה. לבסוף, הפרטים על ההתקנה של 1H R1ρ RD ניסויים על ספקטרומטר NMR Bruker מתוארים (איור 1). הפרוטוקול נותן כל שלב כדי להגדיר את גירסת 1D עבור דוגמאות מסומנות בתווית והערות נוספות וטבלה להתאמה עבור ההגדרה של גירסת SELOPE (טבלה 2). לאחר הפרוטוקול, נדונים צעדים קריטיים ודרכים חלופיות להכנת מדגם והגדרת RD 1H R1ρ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA הוא ביומולקולה גמישה מאוד, שבה שינויים במבנים ממלאים תפקידים מכריעים בפונקציות שמולקולות RNA מבצעות כשליחים ומאפננים תאיים. בעוד מצבים דינמיים אלה נשארים מוסתרים לרוב השיטות המבניות, ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה (RD) R 1ρ מאפשרת לחקור דינמיקה קונפורמציה במשטר מיקרו-אלפיות השנייה ברזולוציה אטומית. השימוש ב- 1H כגרעין הנצפה מרחיב עוד יותר את משטר הזמן המכוסה ונותן גישה ישירה לקשרי מימן ולזוג בסיסים.
הצעדים המאתגרים במחקר כזה הם טוהר גבוה והכנת מדגם בתפוקה גבוהה, פוטנציאל 13C- ו 15N-labeled, כמו גם הגדרת ניסויים והתאמה של נתונים כדי לחלץ אוכלוסייה, שער חליפין, ומבנה משני של המצב הבלתי נראה בעבר. פרוטוקול זה מספק צעדים מעשיים קריטיים בהכנת מדגם כדי להבטיח הכנת דגימת RNA מתאימה והגדרת ניסויי 1 H R1ρ עם דגימותRNA איזוטופיות ולא מתויגות.

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

אנו מציגים פרוטוקול למדידת דינמיקה מיקרו-אלפית השנייה על ספקטרוסקופיית RNA עם תווית N של 13C/15עם תווית N עם ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה של 1H R1ρ. המוקד של פרוטוקול זה טמון הכנה מדגם טוהר גבוהה והגדרת ניסויי NMR.

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

פרוטוקול זה מתאר הכנת מדגם RNA והגדרת NMR למדידות פיזור הרפיה של פרוטון R1rho כדי לבחון חילופי אישור במולקולות RNA. מאז פרוטונים נחקרים, השיטה אינה זקוקה לתיוג איזוטופי ויכולה לגשת לתכונות מבניות כמו שיוך בסיס מוזז ישירות. הפיפטה היא מודולרית למדי במובן זה פיזור הרפיה R1rho ניתן למדוד גם אם המדגם מיוצר בשיטה אחרת.התחל בהכנת דגימת הפלסמיד והקמת תגובת תמלול ויוחן ומחשוף כמתואר בכתב היד של הטקסט. לדגור על התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז לדלל microliter אחד של המדגם פי עשרה בתמיסת טעינה.ולהפעיל microliter אחד על ג'ל דף denaturing. אם תגובת המחשוף מוצלחת, שנה את קנה המידה של התגובה לנפח הרצוי והפעל אותו בן לילה. לאחר מכן הפעל ג'ל PAGE דנטורינג נוסף ולהעריך אם תגובת המחשוף הושלמה.במקרה של מחשוף לא שלם, לחמם את פתרון התגובה במיקרוגל קונבנציונאלי ב 450 וואט במשך 15 שניות. ואז לקרר את הפתרון לאט ל 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות כדי לתזנות מחדש את הרנ"א ואת מדריך המחשוף. ושימו לב להיווצרות של משקעים חדשים.הוסף עוד pyrophosphatase אנאורגני ו RNase H.Incubate התגובה במשך שעה עד שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אשר את השלמת תגובת המחשוף עם דף denaturing. כאשר תגובת מחשוף RNase H הושלמה, להרוות את התגובה על ידי הוספת EDTA לריכוז סופי 50 מילימולר.ומערבולת ביסודיות. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרון. ולרכז את הפתרון לאמצעי אחסון להזרקה למערכת HPLC לטיהור.לפני הוספת המדגם המרוכז והמטוהר לצינור NMR, לנקות את הצינור על ידי שטיפה עם מים בשפע. ואז ריאגנט טיהור RNase, מים, ו 95%אתנול. לאחר השטיפה הסופית במים, להשאיר אותו לייבוש.יש לשטוף את הבוכנה במים ולהשתמש במחיקה ללא מוך לניקוי עם טיהור RNase reagent ו-95%אתנול. לאחר ייבוש הצינור ואת הבוכנה, להוסיף 10% D2O לדגימת NMR. השתמש קצה פיפטה גדול כדי להעביר את דגימת ה- RNA לתוך צינור NMR, זורם אותו לאורך הצד של קיר הצינור.הכנס את הבוכנה לתוך הצינור על ידי דחיפת אותו למטה עם תנועה פיתול מהירה כדי להסיר בועות אוויר, ולאחר מכן למשוך את הבוכנה למעלה לאט מבלי ליצור בועות אוויר חדשות. ולתקן את זה עם סרט שעווה פרפין. צור ערכת נתונים חדשה המבוססת על ערכת נתונים ארומטית של פחמן פרוטון HSQC המשמשת בדגימות RNA עם תוויות מלאות להקצאת RNA.הגדר את הפרמטרים הכלליים ואת הפרמטרים הספציפיים RD. ואז להגדיר כוח נעילת ספין פרוטון ל 1.2 קילוהרץ לבדיקה. צור רשימת VD לבדיקה עם ערך אחד בלבד, אפס אלפיות שניה, הגדר את TDF1 לאחד ועדכן את D30 כדי להפעיל ספקטרום בדיקה.לאחר הגדרת רשימת VD בדיקה, עדכן D30 ו- TDF1. ולתוות את עוצמת הפסגה לאורכים שונים של נעילת ספין. זהה את אורך נעילת הסיבוב שבו עוצמת השיא המקורי יורדת לשליש.מהתוצאה של ריצות הבדיקה, צור את רשימת VD הסופית לשימוש בניסוי. בחר את מספר הסריקות כך שהשיא החלש ביותר ברשימה יהיה בעל יחס אות לרעש של 10 לפחות. התוצאות של מספר תגובות מחשוף של תמלילי טנדם מוצגים כאן.RNA יעד נוקלאוטיד 20 נוצר בתגובה מוצלחת. תגובות לא מוצלחות גרמו למחשוף לא שלם ונכשל של המדגם. הזרקת HPLC של דגימת הרנ"א חשפה שיא עבור RNA מטרה טהורה ב 38 דקות.בעוד מוצרים ארוכים וקצרים יותר הופרדו היטב משיא העניין. ניתוח סיכת הראש של הרנ"א הראה כי מספר הפרוטונים של האימינו שנצפו תאם את מספר הפרוטונים האימינו הצפויים מסימולציית מבנה משנית. ספקטרום הפחמן הפרוטוני HSQC של התהודה הארומטית של הרנ"א הראה ארבעה אותות לאחר הקיפול.ורק שלושה אותות לפני הקיפול. בנציג על עקומות תהודה המתקבלים עבור שני אטומי H8 שונים ושני סיכות שיער RNA סינתטי שונים, G6H8 חווה חילופי אישור. בעוד A4H8 לא.עבור G6H8, נבחרו כוחות נעילת הסיבוב הצבעוניים ונרשמו נתוני תהודה כבויים. במבנה CG שבו ההחלפה איטית, ערכי השורה R1rho לעומת חלקת היסט כבר הציגו א-סימטריה קלה של העקומה, המציינת את הסימן של הפרש השינוי הכימי דלתא אומגה. זה הופך להיות אפילו יותר ברור בעלילת R2 פלוס REX שבו תרומת R1 מוסרת.מצד שני, מבנה GC חווה החלפה מהירה יותר וערכי R1rho לעומת חלקת היסט הציגו עקומה רחבה יותר שבה החילוץ של אומגה דלתא הופך פחות ברור אפילו בחלקת R2 פלוס REX. לאחר שהדינמיקה של הרנ"א התבהרה, ניתן לאפיין וללכד את המדינות. מצבים לכודים אלה יכולים, למשל, להיבדק בבדיקות ביולוגיות.שיטה זו מאפשרת לנו להתבונן בשינויי זיווג בסיס פונקציונליים ורלוונטיים בקומפלקס מיקרו-רנ"א פעיל, סידורים מחדש של לולאות ברנ"א ריבוזומלי ויציבות זוג בסיס של בליטות נוקלאוטיד בודדות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...