Ringraziamo la struttura di scienza delle proteine (PSF) presso il Karolinska Institutet per l'espressione e la purificazione della T7 RNA polimerasi ed E. coli RNasi H, Martin Hällberg per il generoso dono della fosfatasi inorganica e l'intero Petzoldlab per preziose discussioni. Ringraziamo Luca Retattino per la preparazione dei costrutti U-bulge ed Emilie Steiner e Carolina Fontana per il loro contributo alle macro e agli script di montaggio. Riconosciamo l'Istituto Karolinska e il Dipartimento di Biochimica Medica e Biofisica per il supporto all'acquisto di uno spettrometro a 600 MHz e al finanziamento della posizione (KI FoAss e KID 2-3707/2013). Siamo grati per il contributo finanziario di Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 e FFL15-0178) e The Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 e 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 e M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. riconosce il finanziamento attraverso un Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF project no. 747446).

K.P. è consulente di Arrakis Therapeutics, una società che scopre piccole molecole che prendono di mira l'RNA.

Il protocollo qui presentato è una sintesi di diversi protocolli pubblicati in precedenza sotto forma di articoli di ricerca10,20,21,31. Quindi, i segmenti del protocollo possono essere applicati, mentre altri possono essere scambiati secondo le preferenze del lettore. Ad esempio, le misurazioni di R1ρ possono essere eseguite su un campione di RNA prodotto con qualsiasi metodo, dato che si presume il ripiegamento e l'omogeneità della lunghezza. Inoltre, il protocollo non contiene informazioni sull'assegnazione di risonanza della sequenza di RNA - un passaggio richiesto per gli esperimenti RD - in quanto questo è stato ampiamente trattato nella letteratura precedente19,37,38. Schemi di etichettatura parziali, segmentali o specifici del sito36,41,42,43,44sono approcci per facilitare l'assegnazione della risonanza o ridurre la sovrapposizione di risonanze che sono di interesse negli esperimenti RD e sono stati descritti a lungo in letteratura. Questo metodo consente l'uso di un'etichettatura uniforme di qualsiasi identità nucleotidica, che può già semplificare significativamente l'assegnazione della risonanza.
Il metodo IVT qui presentato supera i problemi noti con le sequenze e l'etichettatura, aumenta la resa e riduce i costi e i tempi di lavoro rispetto ad altri metodi. L'uso della sequenza di avvio virale riduce la necessità di ottimizzazione della reazione, che è un problema noto nel campo che può richiedere molto tempo per l'esecuzione e produce solo poche copie del trascritto in caso di iniziazione non G. La scissione T7 IVT e RNase H della trascrizione tandem può essere eseguita contemporaneamente nella stessa nave. Un modello di ripetizioni tandem multimeriche può essere visto su un gel PAGE denaturante durante la reazione, che si fonde in una singola banda sull'RNA bersaglio al completamento della reazione RNasi H(Figura 3A,corsie 1 e 2b). Le rese tipiche che utilizzano questo metodo variano tra 30 e 70 nmol RNA per 1 mL IVT. Tuttavia, il metodo basato sulla scissione RNasi H delle ripetizioni in tandem non viene senza alcuni problemi propri. La reazione di scissione della RNasi H spesso non va a compimento quando viene eseguita contemporaneamente alla trascrizione T7(Figura 3A,corsia 2a).
La separazione delle unità tandem può essere finalizzata ricotturando la guida di scissione al trascritto e aggiungendo più RNasi H(Figura 3A,corsia 2b, passo 2.1.2). Poiché il riscaldamento di grandi volumi è lento e porta all'idrolisi catalizzato mg2+dell'RNA, è stato utilizzato un forno a microonde convenzionale, che riscalda il campione a >95 °C in 10-15 s. Finora non sono stati osservati effetti avversi sui campioni prodotti. Alcuni costrutti mostrano una seconda banda minore che non poteva essere eliminata dall'ottimizzazione delle condizioni di reazione (Figura 3A, corsia 4). Di solito questi sono piuttosto chiaramente visibili come una spalla nel cromatogramma HPLC, se si utilizza un gradiente di eluizione ben ottimizzato, e possono essere rimossi (passo 2.2.5). La seguente discussione ha lo scopo di evidenziare i passaggi critici nel protocollo, in particolare per quanto riguarda l'ottenimento di dati di alta qualità che consentano un'interpretazione delle dinamiche conformazionali.
Contaminazione da RNasi Le RNasi extracellulari sono onnipresenti, altamente stabili e rappresentano la più grande minaccia per la stabilità a lungo termine dei campioni di NMR. Pertanto, è fondamentale lavorare in un ambiente privo di RNasi e mantenere tutti i reagenti e gli articoli in plastica privi di RNasi. Si consiglia l'uso di punte filtranti e forse anche maschere facciali. Questo è particolarmente importante dopo la purificazione HPLC. I campioni NMR contaminati da RNasi presentano tipicamente picchi stretti visibili in 1spettri H-1D dopo giorni o settimane a causa di prodotti di degradazione a singolo nucleotide. Tale campione non è adatto per misurazioni R1ρ. 
Campione NMR A causa della sua natura altamente carica, l'RNA può essere utilizzato in alte concentrazioni senza precipitazioni rispetto alla maggior parte delle proteine. L'uso di tubi NmR Shigemi (vedi la Tabella dei materiali)è vantaggioso in quanto consentono il centraggio del campione altamente concentrato al centro della bobina, pur fornendo condizioni ideali di shimming e bloccaggio a causa del fondo e dello stantuffo di vetro abbinati alla suscettibilità. In questo modo, la disomogeneità B1 viene ridotta, dando origine a linee più strette. Il volume tipico del campione in un tubo NMR è di 250 μL e la concentrazione tipica è di 1-2 mM. I campioni al di sotto di 500 μM non sono raccomandati per gli esperimenti RD in quanto l'esperimento richiederebbe troppo tempo e un buon spessore. Allo stesso modo, il volume del campione inferiore a 200 μL non è raccomandato perché è richiesta una buona stabilità di spessore e campo (blocco). Quando si inserisce lo stantuffo, è fondamentale evitare la formazione di bolle nel campione (punto 2.4.5). Se non fissato correttamente, lo stantuffo può scivolare verso il basso nel campione, riducendo il volume rilevabile. Inoltre, rapidi cambiamenti di temperatura possono portare alla formazione di nuove bolle nel campione. Pertanto, è necessario prestare attenzione durante il trasporto del campione e quando si modifica la temperatura della sonda nello spettrometro NMR. Controllare il campione per le bolle quando si misura di nuovo dopo un periodo più lungo.
Piegatura dell'RNA Le molecole di RNA dinamico possono esistere in più conformazioni quando non piegate correttamente. Anche se le temperature di fusione delle strutture secondarie possono essere solo leggermente superiori alla temperatura ambiente, si consiglia un'accurata procedura di riscaldamento e raffreddamento a scatto prima della misurazione. Campioni di forcine altamente concentrati che si piegano sotto controllo cinetico (riscaldamento e raffreddamento a scatto) possono formare omodimeri nel tempo, il che richiede un controllo rigoroso del ripiegamento dell'RNA prima di ogni misurazione NMR. Se l'RNA misurato non è una struttura a forcina ma un duplex di RNA, deve essere applicato un lento ripiegamento sotto controllo termodinamico.
In questo caso, il processo di raffreddamento dopo il riscaldamento dovrebbe essere nell'intervallo di ore, mentre l'RNA viene utilizzato al suo volume finale e alla sua concentrazione nel campione NMR. Un conteggio iniziale delle risonanze imino e aromatiche attese può fornire informazioni sull'omogeneità del campione. Se il campione non sembra come previsto, dovrebbe essere ripiegato. Mg2+ (aggiunto come sale di cloruro) può aiutare con il ripiegamento delle strutturedell'RNA 45. In pratica, il controllo di piegatura serve come confronto con un campione che è stato utilizzato per assegnare almeno parzialmente le risonanze NMR e per risolvere sperimentalmente la struttura secondaria.
Considerazioni sull'alimentazione e sul riscaldamento del blocco di rotazione In caso di esecuzione degli esperimenti 1H R1ρ RD come esperimenti di panoramica 2D, la potenza SL non deve essere inferiore a 1,2 kHz. La frequenza del trasmettitore di radiofrequenza deve essere posizionata al centro della regione ppm dei picchi di interesse(ad esempio,7,5 ppm per i protoni aromatici). La larghezza di banda di 1,2 kHz sarà quindi abbastanza grande da bloccare questi protoni senza importanti effetti di off-risonanza. Tali effetti possono essere identificati nel profilo RD. Se si verificano, i valori R2+REX aumentano invece di diminuire con l'aumentare dei valori di potenza SL, in particolare per la bassa potenza SL. Verificare se i valori di potenza SL calcolati corrispondono alla potenza erogata al campione. In pratica, la potenza SL calcolata può essere utilizzata se l'impulso rigido 1H 90 ° è stato calibrato attentamente su spettrometri più recenti; tuttavia, questo può essere verificato calibrando la potenza SL per ogni larghezza di banda desiderata.
La gamma di potenza SL, che può essere utilizzata negli esperimenti 1H R1ρ RD è molto ampia, portando a un riscaldamento del campione variabile (da 1,2 kHz a 15 kHz per HSQC per sequenze basate su HCP e da 50 Hz a 15 kHz per esperimenti SELOPE). Il riscaldamento disuguale del campione può essere rilevato come un leggero cambiamento nello spostamento chimico quando si confrontano 1D ottenuti per SLs a bassa potenza rispetto a. SLs ad alta potenza. Questo effetto di solito non è considerato nelle compensazioni di calore negli esperimenti R1ρ sugli eteronuclei. La compensazione del calore in questi esperimenti è solitamente impostata per correggere il riscaldamento diverso a causa delle diverse durate di blocco dello spin specificate nell'elenco vd di ciascuna serie di potenza di blocco dello spin. Soprattutto per l'esperimento SELOPE, una seconda compensazione del calore dovrebbe essere utilizzata su tutti i punti di forza SL applicati come descritto in20.
Considerazioni sull'elenco vD Come accennato in precedenza, l'elenco vd dovrebbe contenere un punto temporale abbastanza lungo da ottenere un decadimento significativo dell'intensità (idealmente fino al 30% del segnale iniziale, o il più basso possibile se non è possibile raggiungere un decadimento del 70% all'interno delle specifiche della sonda). Sebbene l'elenco vd sia stato ottimizzato per una bassa potenza SL (1,2 kHz), questo elenco vd dovrebbe anche essere testato alla massima potenza SL da utilizzare(ad esempio,15 kHz). Ciò è dovuto al fatto che per i picchi con un significativo contributo REX, il decadimento sarà molto più lento ad alta potenza SL. Quindi un decadimento sufficiente dovrebbe essere verificato anche ad alta potenza SL. Lo stesso deve essere considerato per i decadimenti ad alti offset in esperimenti fuori risonanza. Il punto temporale massimo ideale dell'elenco vd potrebbe essere significativamente diverso per le diverse regioni dell'esperimento di dispersione. In tal caso, più punti potrebbero essere inclusi nell'elenco vd e i punti elenco vd più lunghi per una maggiore potenza SL o offset più elevati durante l'analisi, in base al basso SINO a cui porteranno, potrebbero essere scartati. In generale, 5-8 punti elenco vd dovrebbero essere considerati in grado di individuare potenziali artefatti che portano a decadimenti non esponenziali come J-coupling (vedi sotto).
1D- Considerazionisulla selettività dell'HCP È necessario prestare particolare attenzione quando si esegue la versione 1D basata su HCP se c'è un altro picco che si sovrappone al picco di interesse nella dimensione 1H dell'esperimento basato su HSQC 2D. I trasferimenti basati su HCP sono molto, ma mai selettivi al 100%, e può quindi accadere che un altro picco contribuisca all'intensità e al comportamento di decadimento del picco di interesse nella 1D. Un'indicazione per questo sarebbe una differenza nei valori R1ρ in risonanza ottenuti usando le versioni 1D e 2D dell'esperimento etichettato.
Considerazioni sul ROE: Per le curve off-risonanza di atomi con scambio lento-intermedio, gli artefatti ROE possono essere identificati sulla base di un confronto del Δω ottenuto con uno spettro NOESY o ROESY. Se un picco incrociato può essere identificato ad una differenza di spostamento chimico corrispondente a Δω,allora lo stato eccitato osservato potrebbe in realtà essere un artefatto ROE(ad esempio,sono stati trovati ROE tra protoni aromatici, che sono tutti nello stesso intervallo di spostamento chimico e quindi coperti da quelle curve di off-risonanza20). Per esperienza, questo ha sempre portato anche a scarsi adattamenti con errori di grandi dimensioni, probabilmente a causa del ROE che non segue lo stesso schema di REX con l'aumento della potenza SL. La situazione diventa più difficile per lo scambio intermedio-veloce. Mentre la curva on-resonance è (dal confronto con i dati di 13C ottenuti sul nucleo vicino) ancora rappresentativa del processo di scambio tra GS ed ES, la curva off-resonance è influenzata da più artefatti ROE.
In tal caso, la potenza SL per rilevare il processo di scambio è maggiore (>1,5 kHz) e quindi si estende su un numero maggiore di protoni mentre le curve fuori risonanza si estendono su differenze di spostamento chimico di vari candidati ROE (per H8 questi sarebbero: protoni amminici a circa ±1000 Hz, H5 / H1 a circa -1200 Hz, protoni imino a circa 3500 Hz). Finora, non è stato trovato alcun metodo per sopprimere questi artefatti ROE (a parte l'uso di nucleotidi parzialmente deuterati46), e i dati fuori risonanza non dovrebbero essere registrati per lo scambio intermedio veloce, poiché nessuna informazione affidabile sul Δω effettivo può essere estratta con questo metodo, se il contributo NOE / ROE non può essere escluso tramite spettri NOESY.
Considerazioni sul J-Coupling (Hartmann-Hahn) Sebbene le curve di risonanza per i protoni accoppiati a J omonucleari, come H6, siano state registrate con successo10,20, è necessario prestare particolare attenzione per le misurazioni fuori risonanza, specialmente per la bassa potenza SL poiché le condizioni di corrispondenza hartmann-Hahn possono coprire una vasta gamma di offset studiati. Gli artefatti di Hartmann-Hahn possono essere identificati come oscillazioni sul decadimento esponenziale o valori crescenti di R2+REX con forze SL crescenti in grafici RD a risonanza20.

Gli RNA svolgono una moltitudine di funzioni regolatorie1,catalitiche2e strutturali3 nella cellula, molte delle quali sono correlate a una struttura molecolare flessibile e a intricati cambiamenti di quelle strutture4,5,6,7. Gli stati a bassa popolazione rimangono invisibili alla maggior parte dei metodi di determinazione della struttura o non consentono lo studio di questi stati nascosti ad alta risoluzione atomica. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) allo stato di soluzione combina entrambi gli aspetti fornendo accesso ai singoli nuclei atomici e offrendo una vasta gamma di esperimenti mirati alla dinamica attraverso tutti i regimi temporali8. Gli esperimenti RD NMR forniscono l'accesso allo scambio conformazionale nella scala temporale intermedia, in cui ci si possono aspettare cambiamenti nei modelli di accoppiamento delle basi e riarrangiamenti strutturali locali5,9,10,11,12,13,14. Gli esperimenti RD vengono eseguiti come misurazioni lunghe R2 sotto forma di un treno di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill15 o come misure di rilassamento nel telaio rotante, chiamate esperimenti R1ρ RD16.
Sebbene entrambi possano essere usati per estrarre la popolazione e il tasso di cambio e la differenza di spostamento chimico nello stato minore, gli esperimenti R1ρ RD danno anche il segno della differenza di spostamento chimico dello stato eccitato. Ciò consente un'inferenza sulla struttura secondaria, che è fortemente correlata allo spostamento chimico nelle strutturedell'RNA 17. Lo spostamento chimico è un buon indicatore di elicità nel caso di protoni aromatici e carboni sulle nucleobasi, di partner di accoppiamento di basi per protoni imino e di pucker di zucchero sugli atomi C4' e C1'18,19. Va notato che recentemente un esperimento di trasferimento di saturazione dello scambio chimico (CEST) che utilizza una maggiore potenza di spin lock (SL), spostando così l'applicabilità dell'esperimento CEST su scale temporali di scambio più veloci, è stato pubblicato come alternativa all'esperimento R1ρ RD per sistemi con uno stato eccitato.
Sebbene gli isotopi 13C e 15N siano stati spesso utilizzati per accedere allo scambio strutturale, lavori recenti di questo laboratorio hanno utilizzato protoni aromatici e imino come sonde per lo scambio conformazionale9,10. L'uso di 1H come nucleo osservato porta diversi vantaggi, ad esempio l'accesso allo scambio su scale temporali più veloci e lente, una maggiore sensibilità e tempi di misurazione più brevi. Ciò è ulteriormente facilitato dall'approccio SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), che fornisce accesso ai protoni aromatici attraverso il decrowding dello spettro unidimensionale (1D) utilizzando accoppiamenti scalari omonucleari, invece di un trasferimento di magnetizzazione eteronucleare ed eliminando la necessità di etichette isotopiche20. Questo protocollo affronta la misurazione in esperimenti 1H R1ρ RD di campioni uniformemente etichettati e non etichettati con N 13C/15. Pertanto, questo documento presenta un metodo di preparazione del campione che è risultato essere il più versatile per le diverse esigenze di preparazione del campione21 e discute le alternative nell'ultima sezione di questo articolo (Figura 1).
A questo punto, il lettore dovrebbe notare che altre tecniche di preparazione del campione sono accettabili per gli esperimenti 1H R1ρ RD e che altri metodi di analisi strutturale e funzionale possono essere eseguiti con i campioni sintetizzati con la tecnica presentata. 1 Gli esperimenti H R1ρ RD richiedono alte concentrazioni di RNA (idealmente >1 mM) e un'elevata omogeneità, sia nella lunghezza dell'RNA che nella conformazione strutturale per garantire una caratterizzazione affidabile della dinamica molecolare. La trascrizione in vitro (IVT) è il metodo di scelta per molti ricercatori per produrre 13campioni di RNA C /15N-labeled a causa della disponibilità di trifosfati nucleosidici etichettati (NTP) e facile incorporazione nella reazione enzimatica22. Tuttavia, la T7 RNA polimerasi (T7RNAP) ampiamente utilizzata23,24,25 soffre di bassa omogeneità di 5' in caso di alcune sequenze di inizio26,27 e spesso anche di omogeneità di 3' durante il deflusso della trascrizione28. La purificazione delle specie di RNA bersaglio diventa più costosa e laboriosa a causa della necessità di grandi quantità di ~ 200 nmol. Il metodo qui utilizzato è stato presentato in precedenza in cui i vantaggi sono stati discussi in generale21. In breve, risolve i problemi descritti trascrivendo un trascritto tandem più ampio che viene poi scisso in modo site-specific da Escherichia coli RNasi H, guidato da un oligonucleotidechimerico 29,30 (vedi Figura 2 per i dettagli).
L'incorporazione di una sequenza distanziatrice alle estremità 5' e 3' del trascritto tandem consente l'uso di una sequenza di inizio ad alto rendimento e la rimozione di sporgenze terminali vicine al sito di linearizzazione del modello plasmidica, rispettivamente (Figura 2B). Il metodo ha dimostrato di migliorare significativamente i rendimenti, riducendo al contempo i costi e la manodopera, con l'avvertenza di una sintesi di modelli più complessa e la necessità di un enzima e di un oligonucleotide aggiuntivi. L'elevata specificità della scissione della RNasi H facilita la purificazione a causa della mancanza di specie di RNA in un intervallo di dimensioni simile. Il presente protocollo utilizza una fase di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) a scambio ionico che è stata pubblicata da questo laboratorio di recente31, sebbene altri metodi siano possibili alternative. 1 H R1ρ RD può, in generale, essere acquisito su campioni etichettati o non etichettati con due rispettive sequenze di impulsi, l'esperimento basato sulla correlazione quantistica singola (HSQC) "etichettata" 1H R1ρ eteronucleare con una dimensione indiretta10 di 13 C e l'esperimento "nonetichettato" 1H R1ρ basato su SELOPE con una dimensione indiretta 1H20.
Questi esperimenti bidimensionali (2D) possono servire come primo controllo, indipendentemente dal fatto che nel campione siano presenti dinamiche sulla scala temporale R1ρ. È possibile ottenere una panoramica di RD per tutti i picchi risolti negli spettri e identificare i picchi di interesse per un'analisi RD più approfondita. Ciò significa che anche i campioni non etichettati possono essere controllati prima di prendere la decisione di produrre un campione più costoso ed etichettato. Una volta selezionato un picco con contributo di scambio conformazionale da studiare più a fondo, è meglio passare alle versioni 1D degli esperimenti di cui sopra (se il picco può ancora essere risolto) per eseguire i cosiddetti esperimenti di off-risonanza. Per la versione etichettata, il trasferimento HSQC a 13C viene sostituito con un passaggio di crosspolarizzazione eteronucleare selettiva (HCP) come utilizzato negli esperimenti 13C R1ρ 32,33,34,35, mentre nel caso dell'esperimento SELOPE, l'esperimento viene semplicemente eseguito come 1D, che è particolarmente utile per i segnali H8 e H2 che si trovano comunque sulla diagonale nel 2D. Un criterio su quale sequenza utilizzare, a condizione che siano disponibili sia un campione etichettato che un campione non etichettato, è quanto sia ben isolato il picco di interesse nei due esperimenti.
In generale, l'esperimento SELOPE è raccomandato per campioni di RNA fino a 50 nucleotidi. Per gli RNA più grandi, la sovrapposizione sarà maggiore; tuttavia, nucleotidi strutturalmente interessanti appaiono spesso in regioni di spostamento chimico che sono meno sovrapposte e potrebbero comunque essere accessibili in RNA ancora più grandi. Un altro argomento sarebbe che nei campioni non etichettati, non si verifica alcun accoppiamento J tra 1H e 12C. Tuttavia, poiché la potenza minima di blocco dello spin è definita dalla potenza minima utilizzata per disaccoppiare questi due spin (~ 1 kHz) nell'esperimento etichettato, l'esperimento senza etichetta consente l'uso di una gamma più ampia di punti di forza del blocco di spin (SL) e, quindi, l'accesso a una scala temporale più ampia di scambio. Questi esperimenti off-resonance forniscono informazioni aggiuntive a kex, come la popolazione dello stato eccitato (conformatore alternativo), pES, così come informazioni molto preziose sullo spostamento chimico sotto forma di Δω (la differenza di spostamento chimico dello stato fondamentale e dello stato eccitato).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro del protocollo presentato. Preparazione prima dell'effettiva produzione di campioni su larga scala, consistente nella preparazione del modello e nella conferma del successo della trascrizione in vitro e della scissione della RNasi H. Produzione su larga scala che include la purificazione HPLC, il riempimento del tubo NMR e la conferma del ripiegamento dell'RNA. In caso di sintesi con etichetta isotopica, è necessario eseguire una purificazione senza etichetta per l'ottimizzazione del gradiente nello stesso giorno. Caratterizzazione NMR di dinamica conformazionale con esperimenti R1ρ. Ogni fase può essere eseguita in modo indipendente, ad esempio,l'analisi 1H R1ρ RD può essere applicata a qualsiasi campione di RNA adatto prodotto con un altro metodo. Abbreviazioni: IVT = trascrizione in vitro; HPLC = cromatografia liquida ad alte prestazioni; NMR = risonanza magnetica nucleare; RD = dispersione di rilassamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire dettagli pratici e parametri critici per lo studio della dinamica conformazionale con dispersione di rilassamento 1H R1ρ in molecole di forcina di RNA. Dopo aver fornito un protocollo dettagliato della progettazione, sintesi e purificazione HPLC a scambio ionico di un RNA bersaglio che può essere eseguito utilizzando tutti, alcuni o nessuno NTP come 13C /15versioni N-labeled, è stato descritto il flusso di lavoro di finalizzazione del campione NMR e conferma dello scambio conformazionale con la spettroscopia NMR. Infine, vengono descritti i dettagli per la configurazione di esperimenti 1H R1ρ RD su uno spettrometro Bruker NMR (Figura 1). Il protocollo fornisce ogni passaggio per impostare la versione 1D per campioni etichettati e commenti aggiuntivi e una tabella da regolare per l'impostazione della versione SELOPE (Tabella 2). Dopo il protocollo, vengono discussi i passaggi critici e i percorsi alternativi per la preparazione del campione e la configurazione di1 H R1ρ RD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

L'RNA è una biomolecola altamente flessibile, in cui i cambiamenti nelle strutture svolgono ruoli cruciali nelle funzioni che le molecole di RNA eseguono come messaggeri e modulatori cellulari. Mentre questi stati dinamici rimangono nascosti alla maggior parte dei metodi strutturali, la spettroscopia di dispersione di rilassamento (RD) R1ρ consente lo studio della dinamica conformazionale nel regime da micro- a millisecondo a risoluzione atomica. L'uso di 1H come nucleo osservato espande ulteriormente il regime temporale coperto e dà accesso diretto ai legami idrogeno e all'accoppiamento delle basi.
I passaggi impegnativi in tale studio sono la preparazione di campioni ad alta purezza e ad alto rendimento, potenzialmente etichettati con 13C e 15N, nonché la configurazione di esperimenti e l'adattamento dei dati per estrarre popolazione, tasso di cambio e struttura secondaria dello stato precedentemente invisibile. Questo protocollo fornisce passaggi pratici cruciali nella preparazione del campione per garantire la preparazione di un campione diRNA adatto e la configurazione di esperimenti 1 H R1ρ con campioni di RNA sia etichettati isotopicamente che non etichettati.

Il protocollo per la produzione di RNA facilita la purificazione attraverso la generazione di trascritti ad alta purezza. La Figura 3A mostra i risultati di diverse reazioni di scissione di trascrizioni tandem, fornendo reazioni sia riuscite che non riuscite. La corsia 1 mostra il caso ottimale di una trascrizione completamente scissa con solo deboli tracce di prodotti collaterali. La corsia 2a mostra una scissione incompleta, che può essere risolta mediante ricottura e l'aggiunta di più RNasi H (corsia 2b, punto 2.1.2). I costrutti di RNA delle corsie 1, 2a e 2b sono gli stessi. Il campione nella corsia 3 mostra una scissione non riuscita. La risoluzione dei problemi di questa reazione comporterebbe un controllo della sequenza della guida di scissione, della purezza del modello di DNA e delle temperature di ricottura. Potenzialmente, la scissione della RNasi H dovrà essere eseguita dopo T7 IVT come mostrato per il campione 2.
Il campione nella corsia 4 mostra una quantità significativa di prodotti laterali di scissione, che sono difficili da rimuovere tramite HPLC a scambio ionico. La risoluzione dei problemi di un tale campione può comportare (a) l'abbassamento della temperatura, della quantità di RNasi H o del tempo di reazione, (b) la riduzione del gradiente di eluizione e del volume di iniezione e il tentativo di separare le frazioni target dai prodotti laterali. Ulteriori informazioni su come aumentare la risoluzione nella purificazione HPLC a scambio ionico sono state discusse da Karlsson et al.31. L'HPLC separa l'RNA bersaglio dagli acidi nucleici più lunghi o più corti e dai contaminanti proteici o a piccole molecole. La Figura 3B mostra il risultato ottimale per la purificazione HPLC a scambio ionico. Il gradiente di eluizione dovrebbe essere scelto in modo tale che la specie di RNA bersaglio eluiti almeno un volume di colonna (in questo esempio: 35 ml) dopo la successiva specie più piccola e un volume di colonna prima della successiva specie più grande.
Le specie più piccole in questo metodo includono singoli nucleotidi, prodotti abortivi (8-12 nt), sequenze distanziali 3' e 5' (5-14 nt) e guida di scissione (acido nucleico chimerico 12 nt), mentre sequenze più lunghe sono ripetizioni tandem potenzialmente uncleaved e il plasmide. Quando si raggiunge un picco di eluizione ben separato, la purificazione può essere scalata fino all'equivalente di ~ 20 mL di reazione IVT per iniezione. La corretta piega di un campione di RNA è fondamentale per gli esperimenti RD e deve essere confermata prima di ogni misurazione. La Figura 4 mostra un RNA 22-mer con etichetta A prima dell'applicazione del protocollo di piegatura nella fase 2.4 (blu) e lo stesso campione dopo che è stato raggiunto il corretto ripiegamento (rosso). Una previsione della struttura secondaria di Mc-Fold (Figura 4C) propone la struttura a forcina presentata con 4 coppie di basi risultanti in 5 segnali imino.
Entrambi gli spettri nella Figura 4A confermano questi segnali previsti, anche se con intensità relative leggermente diverse, il che indica che alcune strutture mal ripiegata (qui, un dimero) possono essere problematiche da valutare con solo spettri 1H 1D. Uno spettro aromatico 1H,13C-HSQC (Figura 4B), tuttavia, mostra solo 3 dei segnali aromatici per il campione prima del protocollo di piegatura (blu), ma tutti e 4 i segnali per il campione che è stato piegato secondo il passaggio 2.4 (rosso). Il campione mostrato in blu probabilmente formava un omodimero (struttura proposta in Figura 4D)che avrebbe prodotto gli stessi segnali imino della forcina. Il segnale di A13H2 sembra ampliato in scambio. Questi risultati aiutano a evidenziare l'importanza della conferma di piegatura con esperimenti di impronte digitali sia imino che aromatiche prima di ogni esperimento RD. Le sequenze di impulsi 1H R1ρ descritte in questo protocollo consentono la rilevazione di dinamiche nel regime di scambio intermedio. Inizialmente viene registrata una curva di risonanza, e se sono presenti dinamiche per un residuo specifico, una dispersione è visibile all'interno dei valori R2+REX ottenuti, mentre questa curva è piatta per i residui senza scambio.
La Figura 5 mostra curve di risonanza rappresentative ottenute per due diversi atomi di H8 in una forcina di RNA sintetico (Figura 5A), in cui G6H8 sperimenta lo scambio (Figura 5C), mentre A4H8 no (Figura 5B). Poiché lo scambio è relativamente lento in questo campione (kEX = 292 ± 40 Hz), è stato sfruttato il vantaggio dell'esperimento SELOPE per ottenere basse forze SL e le due curve di risonanza sono state registrate utilizzando la versione 1D della sequenza di impulsi. La stessa sequenza di impulsi è stata poi utilizzata per ottenere dati di off-risonanza per il residuo che mostra dispersione nel profilo on-resonance. La figura 5D mostra i valori R1ρ ottenuti rispetto all'offset in cui una leggera asimmetria della curva indica già il segno di Δω.
Ciò diventa ancora più evidente nel grafico R2+REX in cui viene rimosso il contributo R1 ( Figura5E). La colonna di destra della stessa figura mostra curve di risonanza rappresentative ottenute per due diversi atomi di H8 in una forcina di RNA sintetico leggermente diversa con scambio più veloce, in cui G6H8 sperimenta lo scambio (Figura 5G), mentre A4H8 no (Figura 5F). Il tasso di cambio più veloce(kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) ha permesso la registrazione RD di tutti i protoni aromatici contemporaneamente utilizzando la versione SELOPE 2D per ottenere dati sia on- che off-resonance (dati G6H8 visualizzati in Figura 5H,I).
Identificatori generali per risultati positivi e negativi I risultati positivi nella scissione tandem IVT e RNasi H possono essere identificati come segue: 1) La banda target è la banda più forte nel gel PAGE denaturante. 2) Non ci sono o ci sono solo bande deboli intorno alla banda principale. 3) Non ci sono specie deboli o solo deboli ad alto peso molecolare. 4) Il cromatogramma HPLC mostra un picco ben separato dell'RNA bersaglio. 5) Quando viene campionato il picco principale, solo una banda appare su un gel PAGE denaturante.
I risultati negativi nella scissione tandem IVT e RNasi H sono presenti come segue: 1) Nessuna o solo una banda principale debole è visibile su un gel PAGE denaturante. 2) È visibile un modello di specie ad alto peso molecolare da ripetizioni tandem di RNA. 3) Sebbene sia presente la banda principale, bande di intensità simile sono al di sopra o al di sotto della banda principale all'interno ± 3 nt.
Un campione ben piegato può essere identificato come segue: 1) Il numero di protoni imino osservati corrisponde al numero di protoni imino attesi da una simulazione di struttura secondaria(ad esempio,Mc-Fold39, Figura 4A). 2) La coppia di basi oscillante syn G-U in un loop UUCG (se presente) è visibile a ~ 9,5 ppm, a volte visibile solo a temperature più basse. Un ulteriore rilevamento delle impronte digitali del circuito UUCG è stato descritto da Fürtig e colleghi40. 3) L'impronta aromatica concorda con un campione precedentemente assegnato che è stato confermato per piegarsi correttamente (Figura 4C).
Un campione mal ripiegato o degradato può essere identificato come segue: 1) Ci sono più segnali imino di quanto previsto da una simulazione di struttura secondaria (NOTA: meno segnali imino non implicano necessariamente un misfolding, poiché le coppie di basi di chiusura spesso non sono visibili e lo scambio conformazionale allarga le linee). 2) Assenza di segnali imino. 3) Segnali stretti di alta intensità nella regione aromatica, che indicano prodotti di degradazione a singolo nucleotide. 4) Divergenza tra segnali imino o aromatici ad un campione di riferimento di ripiegamento confermato (Figura 4C).
Un atomo che non mostra alcuno scambio nella scala temporale rilevabile può essere identificato come segue: 1) da un profilo RD piatto (a causa del contributo REX mancante che varia con la potenza SL applicata) (Figura 5B e Figura 5F). 2) Bisogna fare attenzione al caso di scambio lento-intermedio quando kEX e Δω sono della stessa grandezza. In tal caso, il contributo di risonanza può essere molto piccolo come si può vedere nella Figura 5C (in questo caso i parametri montati sono kEX = 292 ± 40 Hz e Δω = 112 ± 4 Hz). In caso di dubbio, è possibile registrare una curva di off-risonanza SL bassa per la verifica.
Un atomo che mostra lo scambio nella scala temporale intermedia può essere identificato 1) da un profilo di dispersione di rilassamento non piatto in un esperimento RD a risonanza (Figura 5B e Figura 5F); 2) una più ampia lalarghenza di linea nell'esperimento HSQC o SELOPE può anche essere un indicatore per lo scambio.
Valori di potenza SL ben selezionati per curve off-resonance (Figura 5E,F): 1) hanno un notevole contributo kEX nella curva di risonanza (i valori di potenza SL selezionati sono indicati in Figura 5C e Figura 5G). 2) Poiché le curve di off-resonance sono misurate per almeno 3 valori di potenza SL, i valori di potenza SL selezionati devono essere distribuiti sulla regione della curva di risonanza con contributo kEX. 3) Portare a curve R2+REX non piatte dopo l'adattamento di Laguerre(ad esempio, Figura 5D:forze SL 25, 50 e 75 Hz; Figura 5E).
Valori di potenza SL scarsamente selezionati per curve fuori risonanza(Figura 5E,F)portano a curve piatte R2+REX dopo l'adattamento di Laguerre. Un esempio è mostrato nella Figura 5E, in cui la curva di off-risonanza a 100 Hz è molto piatta e quindi non fornisce informazioni significative su Δω.
Indicazioni per gli artefatti dell'effetto Overhauser nucleare rotante-frame (ROE): 1) Δω ottenuto da curve di risonanza off corrispondono a spostamenti chimici di protoni in prossimità spaziale / protoni, che mostrano un picco incrociato con il picco di interesse nello spettro della spettroscopia nucleare ad effetto Overhauser (NOESY). (ad esempio, la Figura 5I mostra ampie curve fuori risonanza come previsto per lo scambio intermedio veloce, ma le curve hanno anche caratteristiche più nitide, ad esempioa -3000 Hz e +1500 Hz. Questi sono molto probabilmente dovuti a un artefatto ROE piuttosto che a uno spostamento chimico per questo H8 in un conformatore diverso). 2) Laguerre fit funziona, ma non funziona bene (dà errori elevati o valori fisicamente impossibili) per una on-risonanza e almeno 3 curve off-resonance, anche se gli esponenziali sono stati ottenuti da esperimenti con sino alto (>20)(ad esempio, kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Spesso ogni SL si adatta bene individualmente, ma montarli insieme dà un errore molto più alto; il comportamento opposto è previsto per un vero stato eccitato.
Le indicazioni per lo scambio "vero" Δω: 1) Δω ottenuto da curve off-risonanza non corrispondono agli spostamenti chimici dei protoni nelle vicinanze spaziali / protoni, che mostrano un picco incrociato con il picco di interesse nello spettro NOESY (ad esempio, Figura 5E). 2) Laguerre fit fornisce bassi errori per una risonanza on-resonance e almeno 3 curve off-resonance(ad esempio., Figura 5E vs. Figura 5I, vedere la didascalia per i risultati di adattamento).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Figura 3: Produzione di campioni mediante reazione di scissione del tandem T7 IVT e RNasi H. (A) PAGINA di denaturazione dei risultati positivi e negativi della scissione tandem IVT e RNasi H. L'altezza della scala si riferisce ai riferimenti dell'RNA, 12 * si riferisce alla guida di scissione chimerica. Corsia 1: Generazione di successo di un RNA bersaglio da 20 nt. Sono presenti pochi prodotti più corti e più lunghi. Corsia 2a: Scissione incompleta della trascrizione in tandem. Sebbene la purificazione HPLC sia possibile, molto materiale verrebbe sprecato. Lane 2b: La scissione continua della RNasi H della Corsia 2 produce un campione pulito pronto per l'iniezione di HPLC (identico alla Corsia 1). Lane 4: La scissione della RNasi H non ha avuto successo e non è stata prodotta alcuna banda bersaglio. La trascrizione tandem a figura intera è ancora visibile a 600 nt. Corsia 5: È stata prodotta una banda target, ma è presente una forte banda -1. Sebbene l'HPLC possa essere eseguito, è necessaria un'attenta rimozione del prodotto laterale. (B) Esempio di iniezione HPLC riuscita. Il picco a 38 minuti contiene RNA puro della lunghezza target, mentre i prodotti più lunghi e più corti sono ben separati dall'RNA target. Il pannello B è stato modificato da 21. Abbreviazioni: IVT = trascrizione in vitro; HPLC = cromatografia liquida ad alte prestazioni; nt = nucleotidi; AU = unità arbitrarie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Figura 4: Esempio di una forcina di RNA prima (blu) e dopo (rosso) della fase di piegatura 2.4 (vedi protocollo) in NMR. (A) Regione Imino di uno spettro 1H-1D di un RNA 22-mer etichettato A. Le regioni previste per l'identità della coppia di basi dei segnali imino sono indicate in grigio di seguito. (B) 1H,13C-HSQC spettro delle risonanze aromatiche dell'RNA dal pannello A. Il campione dopo la piegatura (rosso) mostra 4 segnali come previsto, mentre il campione prima della piegatura (blu) mostra solo 3 segnali. (C) Previsione di Mc-Fold dell'RNA 22-mer come forcina. Cinque segnali imino sono da aspettarsi da questa struttura secondaria, che può essere trovata in entrambi i campioni nel pannello A. (D) Struttura proposta di un omodimero formato dall'RNA 22-mer, risultante nelle stesse 5 coppie di basi della struttura a forcina. Abbreviazioni: NMR = risonanza magnetica nucleare; 1D = unidimensionale; HSQC = correlazione quantistica singola eteronucleare; ppm = parti per milione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Figura 5: 1H R1ρ RD risultati rappresentativi per due diversi costrutti basati su una forcina di RNA. (A) La colonna di sinistra mostra i risultati ottenuti sull'RNA con una coppia di basi C-G sopra la U rigonfiata, mentre la colonna di destra mostra i risultati ottenuti su un campione in cui la coppia di basi è stata invece commutata in G-C. (B) e (F) mostrano profili di dispersione piatti come ottenuti per A4H8 per i due costrutti, indicando nessuna sostituzione conformazionale. (C–E) mostrano i dati on-resonance, off-resonance e montati ottenuti per G6 nel costrutto (G-C). L'adattamento di Laguerre porta al seguente risultato: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX = 292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) mostrano dati on-resonance, off-resonance e montati ottenuti per G6 nel costrutto (G-C). Il Laguerre fit porta al seguente risultato: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43,502 ± 38,478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Questa cifra è stata modificata da 20. Abbreviazione: SL = spin lock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Presentiamo un protocollo per misurare la dinamica da micro a millisecondo su 13C/15RNA N-labeled e unlabel con spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) a dispersione di rilassamento 1H R1ρ. Il focus di questo protocollo risiede nella preparazione di campioni ad alta purezza e nella configurazione di esperimenti NMR.

Aspetti pratici della preparazione del campione e della configurazione di 1H R1ρ Esperimenti di dispersione di rilassamento dell'RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Questo protocollo descrive la preparazione del campione di RNA e la configurazione NMR per le misurazioni della dispersione di rilassamento del protone R1rho per esaminare lo scambio confermativo nelle molecole di RNA. Poiché i protoni vengono sondati, il metodo non ha bisogno di etichettatura isotopica e può accedere direttamente a caratteristiche strutturali come l'accoppiamento di basi spostato. La pipetta è abbastanza modulare nel senso che la dispersione di rilassamento R1rho può essere misurata anche se il campione è prodotto con un metodo diverso.Inizia preparando il campione di plasmide e impostando una trascrizione in vitro e una reazione di scissione come descritto nel manoscritto di testo. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi diluire un microlitro del campione dieci volte nella soluzione di carico.Ed esegui un microlitro su un gel PAGE denaturante. Se la reazione di scissione ha successo, ridimensionare la reazione al volume desiderato ed eseguirla durante la notte. Quindi eseguire un altro gel PAGE denaturante e valutare se la reazione di scissione è stata completata.In caso di scissione incompleta, riscaldare la soluzione di reazione in un forno a microonde convenzionale a 450 watt per 15 secondi. Quindi raffreddare lentamente la soluzione a 37 gradi Celsius per 40 minuti per rianvanere l'RNA e la guida alla scissione. E nota la formazione di un nuovo precipitato.Aggiungere più pirofosfatasi inorganica e RNasi H.Incubare la reazione per una o tre ore a 37 gradi Celsius. Quindi confermare il completamento della reazione di scissione con page denaturante. Quando la reazione di scissione della RNasi H è completata, spegnere la reazione aggiungendo EDTA a una concentrazione finale di 50 millimolari.E vortice completamente. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron. E concentrare la soluzione su un volume iniettabile in un sistema HPLC per la purificazione.Prima di aggiungere il campione concentrato e purificato al tubo NMR, pulire il tubo lavandolo con abbondante acqua. Quindi reagente di decontaminazione della RNasi, acqua ed etanolo al 95%. Dopo il risciacquo finale con acqua, lasciarlo asciugare.Risciacquare lo stantuffo con acqua e utilizzare una salvietta priva di lanugine per pulire con reagente di decontaminazione RNase ed etanolo al 95%. Dopo aver asciugato il tubo e lo stantuffo, aggiungere il 10% D2O al campione NMR. Utilizzare una grande punta della pipetta per trasferire il campione di RNA nel tubo NMR, scorrendolo lungo il lato della parete del tubo.Inserire lo stantuffo nel tubo spingendolo verso il basso con un rapido movimento di torsione per rimuovere le bolle d'aria, quindi tirare lo stantuffo lentamente verso l'alto senza creare nuove bolle d'aria. E fissalo con un film di cera di paraffina. Creare un nuovo set di dati basato su un set di dati HSQC di carbonio protonico aromatico utilizzato su campioni di RNA completamente etichettati per l'assegnazione dell'RNA.Impostare i parametri generali e i parametri specifici di RD. Quindi impostare la potenza di blocco dello spin protonico a 1,2 kilohertz per il test. Genera un elenco vd di test con una sola voce, zero millisecondi, imposta TDF1 su uno e aggiorna D30 per eseguire uno spettro di test.Dopo aver impostato un elenco vd di test, aggiornare D30 e TDF1. E traccia l'intensità del picco per diverse lunghezze di blocco di rotazione. Identificare la lunghezza del blocco di rotazione alla quale l'intensità del picco originale diminuisce a un terzo.Dal risultato delle esecuzioni dei test, creare l'elenco vd finale da utilizzare nell'esperimento. Selezionare il numero di scansioni in modo che il picco più debole dell'elenco abbia un rapporto segnale/rumore di almeno 10. I risultati di diverse reazioni di scissione dei trascritti in tandem sono mostrati qui.Un RNA bersaglio a 20 nucleotidi è stato generato in una reazione di successo. Le reazioni infruttuose hanno provocato una scissione incompleta e fallita del campione. L'iniezione HPLC del campione di RNA ha rivelato un picco per l'RNA bersaglio puro a 38 minuti.Mentre i prodotti più lunghi e più corti erano ben separati dal picco di interesse. L'analisi della forcina dell'RNA ha mostrato che il numero di protoni imino osservati corrispondeva al numero di protoni imino attesi da una simulazione della struttura secondaria. Lo spettro HSQC del carbonio protonico delle risonanze aromatiche dell'RNA ha mostrato quattro segnali dopo il ripiegamento.E solo tre segnali prima di piegare. Nel rappresentante sulle curve di risonanza ottenute per due diversi atomi di H8 e due diverse forcine di RNA sintetico, il G6H8 sperimenta uno scambio confermativo. Mentre l'A4H8 non lo fa.Per G6H8, sono stati selezionati i poteri di blocco dello spin colorati e sono stati registrati i dati di risonanza off. Nel costrutto CG in cui lo scambio è lento, i valori della riga R1rho rispetto al grafico di offset mostravano già una leggera asimmetria della curva, indicando il segno della differenza di spostamento chimico delta omega. Questo diventa ancora più evidente nel grafico R2 più REX in cui il contributo R1 viene rimosso.D'altra parte, il costrutto GC sperimenta uno scambio più veloce e i valori R1rho rispetto al grafico offset hanno presentato una curva più ampia in cui l'estrazione di delta omega diventa meno evidente anche nel grafico R2 più REX. Una volta chiarite le dinamiche dell'RNA, gli stati possono essere caratterizzati e intrappolati. Questi stati intrappolati possono, ad esempio, essere testati in saggi biologici.Questo metodo ci consente di osservare spostamenti funzionali e rilevanti dell'accoppiamento di basi in un complesso di miRNA di microRNA attivo, riarrangiamenti del loop nell'RNA ribosomiale e stabilità della coppia di basi su rigonfiamenti a singolo nucleotide.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Ricerca

Biochimica

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una pipeline di preparazione del campione per microcristalli presso la linea di fascio VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 di cui: la commissione per i N CPMG Relaxation Dispersion per lo studio delle dinamiche conformazionali proteiche sulla scala cronologica μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...