カロリンスカ研究所のタンパク質科学施設(PSF)は、T7 RNAポリメラーゼと 大腸菌 RNase H、マーティン・ヘルバーグの無機ホスファターゼの寛大な贈り物、そして貴重な議論のためにペッツロルドラボ全体の発現と精製に感謝します。ルカ・レタッティノは、Uバルジ構造の準備と、マクロとフィッティングスクリプトへの貢献に感謝します。カロリンスカ研究所と医学生化学・生物物理学部は、600 MHz分光計の購入とポジションファイナンス(KI FoAssおよびKID 2-3707/2013)の購入を支援していることを認めます。ヴェテンスカプスローデ(#2014-4303)、スティフテルセン・フォル・ストラテギスク・フォークスクニング(ICA14-0023、FFL15-0178)、ラグナー・セーダーベルク・スティフテルス(M91-14)、ハラルド・グレタ・ジーンズソン・スティフ (JS20140009)、カール・トリガース・スティフテルス(CTS14-383と15-383)、エヴァ・オック・オスカー・アーレンス・スティフテルス、オーケ・ウィバーグ・スティフテルス(467080968とM14-0109)、ガンフォンデン(CAN 2015/388)、J.S. マリー・スクウォトフスカ・キュリーIF(EU H2020、 MSCA-IF プロジェクト no. 747446)。

K.P.は、RNAを標的とする低分子を発見するアラキス・セラピューティクスのコンサルタントです。

本明細書に記載されているプロトコルは、研究論文10、20、21、31の形で以前に公開されたいくつかのプロトコルの合成です。したがって、プロトコルのセグメントを適用することができ、他のセグメントは、リーダーの好みに交換することができます。例えば、R1ρ測定は、長さの折り畳みと均質性が想定されていることを考えると、任意の方法で製造されたRNAサンプルに対して行うことができる。さらに、このプロトコルには、以前の文献19、37、38で広く取り上げられてきたRD実験に必要なRNA配列の共鳴割り当てに関する情報は含まれていない。部分的、セグメント、または部位特異的な標識スキーム36、41、42、43、44は、共鳴割り当てを容易にする、またはRD実験に関心のある共鳴の重複を低減するためのアプローチであり、文献に長々と記載されている。この方法は、任意のヌクレオチド同一性の均一な標識を使用することを可能にし、すでに共鳴割り当てを大幅に簡素化することができる。
ここで示す IVT 法は、シーケンスとラベリングに関する既知の問題を克服し、歩留まりを増加させ、他の方法と比較してコストと作業時間を削減します。ウイルス開始シーケンスの使用は、反応最適化の必要性を減らしますが、これは、実行に時間がかかり、非G開始の場合にトランスクリプトのコピーをわずか数コピーしか得ることができない分野で既知の問題です。タンデム転写のT7 IVTとRNase H切断は、同じ容器内で同時に行うことができる。多量体タンデム反復のパターンは、RNase H反応の完了時にターゲットRNA上の単一バンドに合合う反応中の変性PAGEゲル上で見ることができます(図3A、レーン1および2b)。この方法を用いた典型的な収量は、1 mL IVT当たり30~70nmol RNAの範囲です。しかし、タンデム反復のRNase H切断に基づく方法は、それ自身の特定の問題なしには来ない。RNase H切断反応は、T7転写と同時に実行すると完了しないことがよくあります(図3A、レーン2a)。
タンデム単位の分離は、転写産物に切断ガイドをアニールし、RNase Hを追加することによって確定することができる(図3A、レーン2b、ステップ2.1.2)。大量の加熱が遅く、RNAのMg2+触媒加水分解につながるため、従来の電子レンジを使用し、10〜15sで>95°Cに試料を加熱した。生産されたサンプルに対する有害な影響は、今のところ観察されていない。いくつかの構成体は、反応条件の最適化によって排除できなかったマイナーな第2バンドを示す(図3A、レーン4)。通常これらはHPLCクロマトグラムの肩としてかなりはっきりと見え、適切に最適化された溶出勾配が使用される場合、除去することができる(ステップ2.2.5)。次の議論は、特に立体構造ダイナミクスの解釈を可能にする高品質のデータを得るためのプロトコルの重要なステップを強調することを目的としています。
RNase汚染 細胞外RNasesは、ユビキタスで、安定性が高く、NMRサンプルの長期安定性に対する最大の脅威となっています。そのため、RNaseフリーの環境で作業し、すべての試薬とプラスチック製品をRNaseフリーに保つことが重要です。フィルターのヒントや多分フェイスマスクの使用をお勧めします。これは、HPLC精製後に特に重要です。RNasesで汚染されたNMRサンプルは、典型的には、一塩基分解産物による数日または数週間後に1H-1Dスペクトルで見える狭いピークを示す。このようなサンプルはR1ρ測定には適していません。
NMR サンプル 高い荷電性により、ほとんどのタンパク質と比較して、RNAは沈殿のない高濃度で使用できます。Shigemi NMRチューブ( 材料表参照)の使用は、コイルの中心に高濃度サンプルを集中させる一方で、感受性に一致したガラス底部とプランジャーによる理想的なシミングとロック条件を提供するため、有利です。このようにして、B1-不均一性が低下し、より狭い線を生じさせる。NMRチューブの代表的なサンプル容量は250μLで、一般的な濃度は1〜2mMです。500 μM 未満のサンプルは、実験に時間がかかりすぎて良いシムとなるため、RD 実験には推奨されません。同様に、200 μL 未満のサンプルボリュームは、良好なシムとフィールドの安定性(ロック)が必要であるため、推奨されません。プランジャを挿入する場合、サンプル内の気泡の形成を避けるために重要です(ステップ2.4.5)。適切に固定しないと、プランジャがサンプルに滑り込み、検出可能なボリュームを減らします。さらに、温度の急激な変化は、サンプル中の新しい気泡の形成につながることができます。したがって、試料を輸送する際や、NMR分光計でプローブ温度を変更する際には注意が必要です。より長い期間後に再度測定する場合は、サンプルの気泡を確認してください。
RNA折りたたみ 動的RNA分子は、適切に折り畳まれていない場合、複数の立体構造に存在する可能性があります。二次構造の融解温度は室温よりわずかに高くしかできないが、測定前に徹底した加熱・スナップ冷却手順を推奨する。キネティックコントロール(加熱・スナップ冷却)下で折り畳まれた高濃度のヘアピンサンプルは、時間の経過とともにホモダイマーを形成することができ、各NMR測定の前にRNAフォールディングの厳格な制御を必要とします。測定されたRNAがヘアピン構造ではなく、RNA二重である場合、熱力学制御下での遅い折り畳みを適用する必要があります。
この場合、加熱後の冷却プロセスは時間の範囲内にする必要があり、RNAはNMRサンプル中の最終体積および濃度で使用されます。期待イミノと芳香族共鳴の初期カウントは、サンプルの均質性についての洞察を提供することができます。サンプルが期待どおりに表示されない場合は、再折り曲げする必要があります。Mg2+( 塩化物塩として添加)は、RNA構造45を折り畳むのに役立つ。実際には、折りたたみ制御は、少なくとも部分的にNMR共鳴を割り当て、実験して二次構造を解くために使用されたサンプルとの比較として機能する。
スピンロックの電力と加熱に関する考慮事項 2Dの概観実験として1HR1ρ RD実験を実行する場合、SL電力は1.2kHz以下でなければなりません。 無線周波送信周波数は、関心のあるピークのppm領域の真ん中に配置する必要があります(例えば、芳香陽子の場合は7.5ppm)。1.2 kHzの帯域幅は、大きなオフ共振効果なしにこれらの陽子をスピンロックするのに十分な大きさになります。このような影響は、RD プロファイルで識別できます。これらの値が発生した場合、R2+REX値は、SL 電力値の増加に伴って減少する代わりに増加します(特に SL 電力が低い場合)。計算された SL 電力値がサンプルに送達される電力に対応しているかどうかを確認します。実際には、1H 90°のハードパルスが新しい分光計で慎重に較正された場合、計算されたSLパワーを使用することができます。ただし、このチェックは、必要な帯域幅ごとに SL 電力を校正することで確認できます。
1H R1ρ RD実験で使用できるSLパワーの範囲は非常に広く、サンプル加熱の変化につながります(HCPベースのシーケンスでは1.2 kHz~15 kHz、SELOPE実験では50 Hz~15 kHz)。低消費電力SLs対の1Dを比較すると、非等しいサンプル加熱は、化学シフトのわずかな変化として検出することができます。高出力の SL。この効果は、通常、ヘテロ核に対するR1ρ実験における熱補償では考慮されない。これらの実験における熱補償は、通常、各スピンロック電源シリーズのvdリストで指定された異なるスピンロック持続時間のために異なる加熱を補正するように設定されています。特に、SELOPE実験では、20に記載されているように、適用されたすべての SL 強度で第 2 の熱補償を使用する必要があります。
vd リストに関する考慮事項 前述のように、vd リストには、強度の有意な減衰を得るのに十分な長さの時間ポイントが含まれている必要があります (理想的には、初期信号の 30% まで下がるか、プローブの仕様の範囲内で 70% の減衰に達することができない場合はできるだけ低い)。vd リストは低い SL 電力 (1.2 kHz) に最適化されましたが、この vd リストは、使用する SL 電力の最高値 (例:., 15 kHz) でもテストする必要があります。これは 、REX の寄与度が著しいピークの場合、高SL電力では減衰がはるかに遅くなるという事実によるものです。したがって、十分な減衰も高SL電力で検証する必要があります。同じ点は、オフ共鳴実験における高オフセットでの減衰について考慮する必要があります。vd リストの理想的な最大時間ポイントは、分散実験の領域によって大きく異なる可能性があります。その場合、vd リストに含まれるポイントが増え、解析中に高い SL 電力または高いオフセットの vd リスト ポイントが長いほど、下位 SINO に基づいて破棄される可能性があります。一般に、5~8 vdリストポイントは、J結合などの非指数的な崩壊につながる潜在的なアーティファクトを発見できると考えるべきです(下記参照)。
1D-HCP 選択性に関する考慮事項 2D HSQC ベースの実験の 1 H 次元で関心のピークと重なり合う別のピークがある場合は、HCP ベースの1Dバージョンを実行する際には、特別な注意が必要です。HCPベースの転送は非常に、しかし、100%選択的ではないので、別のピークが1Dの関心のピークの強度と崩壊の挙動に寄与することが起こり得る。このことを示す指標は、ラベル付き実験の1Dバージョンと2Dバージョンを使用して得られたオン共鳴R1ρ値の差です。
ROE に関する考慮事項: 遅い中間の交換を用いた原子のオフ共鳴曲線の場合、ROEアーティファクトは、得られた Δω とNOESYまたはROESYスペクトルの比較に基づいて同定することができる。交差ピークが Δωに対応する化学シフト差で同定できる場合、観測された励起状態は実際にはROEアーティファクトである可能性があります(例えば、芳香陽子の間にROEが見つかり、これらはすべて同じ化学シフト範囲にあり、したがってそれらのオフ共鳴曲線20で覆われています)。経験から、これは常に大きなエラーに対する不十分な適合につながり、おそらくROEがSLパワーの増加に伴って REX と同じパターンに従っていないためでした。中間-高速交換の状況はより困難になります。オン共鳴曲線は(隣接核上で得られた 13Cデータとの比較から)GSとES間の交換プロセスを代表するが、オフ共鳴曲線は複数のROEアーティファクトの影響を受ける。
その場合、交換プロセスを検出するSLパワーは、より大きい(>1.5kHz)ため、オフ共鳴曲線が様々なROE候補の化学シフト差に及ぶため、より多くのプロトンに及びます(H8の場合:ca.±1000Hzのアミノ陽子、Ca.-1200HzのH5/H1、Hz.3500のHzimo陽子)。NOE/ROEの寄与がNOESYスペクトルを介して排除できない場合、実際のΔωに関する信頼できる情報を抽出できないため、これらのROEアーティファクトを抑制する方法(部分的に重いヌクレオチド46を使用する以外)、およびオフ共鳴データを高速中間交換のために記録すべきではない。
Jカップリング(ハルトマン・ハーン)に関する考慮事項 H6などのホモ核J結合陽子のオン共鳴曲線は10,20個の記録に成功したが、特にハルトマン・ハーンのマッチング条件が広範囲に及ぶ可能性があるため、オフ共鳴測定には特別な注意が必要である。ハルトマン・ハーンのアーティファクトは、オン共鳴RDプロット20におけるSL強度の増加に伴う指数崩壊または増加するR2+REX値の振動として同定することができる。

RNAは、細胞内で多数の調節1、触媒2、および構造3機能を実行し、その多くは、4、5、6、7の柔軟な分子構造およびそれらの構造の複雑な変化と相関している。人口の少ない状態は、構造決定のほとんどの方法では見えないままであるか、高い原子分解能でこれらの隠れた状態の研究を許可していません。溶液状態核磁気共鳴(NMR)分光法は、個々の原子核へのアクセスを提供することによって、ならびにすべての時間体制を通じてダイナミクスを標的とする実験の大規模なツールボックスを提供することによって、両方の側面を組み合わせた8。RD NMR実験は中間タイムスケールにおける立体構造交換へのアクセスを提供し、ここで、基本対形成パターンおよび局所構造の変化は、5、9、10、11、12、13、14を期待することができる。RD実験は、Carr-パーセル-メイブーム-ギルパルス列15の形態でR2測定を長く行うか、またはR1ρ RD実験16と呼ばれる回転フレームにおける緩和測定として行われる。
両者ともに母集団の抽出や相場の割合や化学シフトの違いをマイナーな状態に抽出することができるが、R1ρRD実験は励起状態の化学シフト差の兆候も与える。 これにより、RNA構造17における化学的変化と強く相関する二次構造の推論が可能になる。化学シフトは、核酸塩基上の芳香陽子および炭素の場合のヘリシティ、イミノ陽子の塩基対パートナー、およびC4'およびC1'原子18、19の糖パッカーの良好な指標である。なお、最近より高いスピンロック(SL)パワーを用いた化学交換飽和伝達(CEST)実験により、CEST実験の適用性をより速い交換タイムスケールに移行し、1つの励起状態のシステムに対するR1ρRD実験の代替として公表された。
13Cおよび15N同位体は構造交換にアクセスするためにしばしば使用されてきたが、この研究室の最近の研究では、立体構造交換9,10のプローブとして芳香族陽子とイミノ陽子を用いた。観察された核として1Hを使用すると、例えば、より速く、より遅いタイムスケールでの交換へのアクセス、高感度、および短い測定時間のアクセスなど、いくつかの利点をもたらします。これは、SELective最適化プロトン実験(SELOPE)アプローチによってさらに促進され、多重核磁化伝達の代わりに、ホモ核スカラーカップリングを用いた一次元(1D)スペクトルの消圧を通じて芳香陽子へのアクセスを提供し、同位体ラベル20の必要性を排除する。このプロトコルは、13C/15 N標識されていないサンプルの1H R 1ρRD実験で測定に取り組みます。したがって、このペーパーでは、さまざまなサンプル準備ニーズ21に最も汎用性の高いサンプル準備方法を示し、この記事の最後のセクションで代替案について説明します (図 1)。
この時点で、読者は、他のサンプル調製技術は1HR1ρ RD実験に許容され、また、提示された技術で合成されたサンプルで構造および機能解析の他の方法を実行することができることに注意すべきである。 1H R1ρ RD実験では、高いRNA濃度(理想的には>1mM)と高い均質性が必要であり、RNAの長さと構造の両方で分子動力学の信頼性を確保します。in vitro転写(IVT)は、酵素反応22における標識型ヌクレオシド三リン酸(NtP)およびファシリティの組み込みの可用性に起因して、13C/15N標識RNAサンプルを産生する多くの研究者にとって選択の方法である。しかしながら、広く使用されているT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)23、24、25は、転写流出28中の特定の開始配列26、27およびしばしば3'均質性の場合に低5'均質性に苦しんでいる。標的RNA種の精製は、〜200nmolの大量の必要性のために、より高価で、手間がかかります。ここで使用される方法は、以前に大きな21で利点が議論された場所で提示されています。簡単に言うと、大きなタンデム転写物を転写することによって、大きなタンデム転写物を転写し、次いで、キメラオリゴヌクレオチド29、30によって導かれた、大きなタンデム転写物を、大腸菌RNase Hによって切断する(詳細については図2参照)。
タンデム転写物の5'と3'の端部にスペーサー配列を組み込むことによって、それぞれプラスミド鋳型の線形化部位に近い高収率開始シーケンスおよび端子張り出しの除去を使用することができる(図2B)。この方法は、より複雑なテンプレート合成の注意点と追加の酵素およびオリゴヌクレオチドの必要性を伴って、コストと労力を削減しながら、収率を大幅に改善することが示された。RNase H切断の高い特異性は、同様のサイズ範囲におけるRNA種の欠如による精製を促進する。本プロトコルは、最近31本本の本研究室で発表されたイオン交換高速液体クロマトグラフィー(HPLC)ステップを用いるが、他の方法は可能である。1H R1ρ RDは、一般に、2つのそれぞれのパルス配列を有する標識または非標識サンプル上で取得することができ、13C間接次元10と「1HRρ SELOPEベースの実験を1H間接次元20で「標識された」1H R1ρ核単一量子相関(HSQC)ベースの実験。
これらの2次元(2D)実験は、R1ρタイムスケールのダイナミクスがサンプルに存在するかどうかに関係なく、最初の検査として機能します。スペクトル内のすべての解決されたピークのRDの概要を取得することができ、より徹底的なRD分析のための関心のピークを特定することができます。つまり、ラベルのないサンプルでも、より高価なラベル付きサンプルを作成する決定が行われる前にチェックできます。より徹底的に研究するために立体構造交換寄与を有するピークが選択されたら、上記の実験の1Dバージョンに切り替えて(ピークがまだ解決できる場合)、いわゆるオフ共鳴実験を行うことが最善です。ラベル付けされたバージョンの場合、13CへのHSQC転送は、13CR1ρ実験32、33、34、35で使用される選択的異核間偏光(HCP)ステップに置き換えられ、SELOPE実験の場合、実験は単に1Dとして実行され、これは、とにかく対角線上に横たわっているH8およびH2信号に特に有用である。 どのシーケンスを使用するのかについて、ラベル付けされたサンプルとラベルなしのサンプルが利用可能である限り、2つの実験で関心のピークがどれだけうまく分離されているかが規定されています。
一般に、最大50ヌクレオチドのRNAサンプルに対して、SELOPE実験が推奨されます。大きなRNAの場合、オーバーラップは大きくなります。しかし、構造的に興味深いヌクレオチドは、重複が少なく、さらに大きなRNAではまだアクセス可能である化学シフト領域にしばしば現れます。別の議論は、ラベルなしサンプルでは、1H と12C の間で J 結合が発生しないということです。しかし、最小スピンロックパワーは、標識実験でこれら2つのスピン(約1kHz)を切り離すために使用される最小電力によって定義されるため、ラベルなし実験では、より広い範囲のスピンロック(SL)強度を使用できるため、より広範なタイムスケールの交換にアクセスできます。これらのオフ共鳴実験は、励起状態(代替コンフォーマ)の母集団、pES、ならびにΔω(地盤状態と励起状態の化学的シフト差)の形で非常に貴重な化学シフト情報などの追加情報をkexに提供する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> 図1: 提示されたプロトコルのワークフロー実際の大規模サンプル製造の前に調製し、鋳型調製および正常なインビトロ転写およびRNase H切断の確認からなる。HPLC精製、NMRチューブの充填、RNA折りたたみの確認などの大規模な生産。同位体標識合成の場合、同じ日に勾配最適化のためにラベルなし精製を行う必要があります。R1ρ実験による立体構造ダイナミクスのNMR特性評価各ステップは、それぞれ独立して行うことができる、例えば、1HR1ρRD分析は、別の方法で産生される任意の適切なRNAサンプルに適用することができる。 略語: IVT =インビトロ転写;HPLC = 高速液体クロマトグラフィー;NMR = 核磁気共鳴;RD = 緩和分散。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このプロトコルの目的は、RNAヘアピン分子における1HR1ρ緩和分散を用いた立体ダイナミクスの研究のための実用的な詳細と重要なパラメータを提供することである。13C/15 N標識バージョンとして全て、一部、または全てのN標識バージョンを用いて行うことができる標的RNAの設計、合成、イオン交換HPLC精製の詳細なプロトコルを提供した後、NMRサンプルを確定し、NMR分光法との立体構造交換を確認するワークフローが記載されている。最後に、ブルカーNMR分光計に対する1HR1ρ RD実験の設定の詳細を説明する(図1)。このプロトコルでは、ラベル付きサンプルと追加コメント用の 1D バージョンを設定する各ステップと、SELOPE バージョンの設定を調整するためのテーブルが用意されています (表 2)。プロトコルの後、サンプル準備と1H R1ρ RDセットアップへの重要なステップと代替ルートについて説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNAは非常に柔軟な生体分子であり、構造の変化はRNA分子が細胞伝達物質およびモジュレーターとして実行する機能において重要な役割を果たす。これらの動的状態はほとんどの構造法に隠されたままであるが、R1ρ緩和分散(RD)分光法は、原子分解能でマイクロ〜ミリ秒の体制における立体ダイナミクスの研究を可能にする。観察された核として1Hを使用すると、さらにカバーされた時間体制を拡大し、水素結合および塩基対合への直接アクセスを提供する。
このような研究の困難なステップは、高純度および高収率サンプル調製、潜在的に13Cおよび15Nラベル付け、ならびに以前に見えなかった状態の人口、為替レート、および二次構造を抽出するためのデータの実験と適合の設定である。このプロトコルは、適切なRNAサンプルの調製と、同位体標識およびラベルなしRNAサンプルの両方を用いた1HR1ρ実験の設定を確実にするための、サンプル調製における重要なハンズオンステップを提供します。

RNA製造プロトコルは、高純度のトランスクリプトの生成を通じて精製を促進します。 図3A は、タンデム転写物のいくつかの切断反応の結果を示し、成功した反応と失敗した反応の両方を提供する。レーン1は、副産物のかすかな痕跡のみを有する完全切断されたトランスクリプトの最適なケースを示す。レーン2aは不完全な切断を示し、再アニーリングおよびRNase Hの添加によって解決することができる(Lane 2b、ステップ2.1.2)。レーン1、2a、および2bのRNA構築物は同一である。レーン3のサンプルは、切断の失敗を示す。この反応のトラブルシューティングには、切断ガイド配列のチェック、DNAテンプレートの純度、およびアニーリング温度が含まれます。場合によっては、RNase H切断は、サンプル2に示すようにT7 IVTの後に行われなければなりません。
レーン4のサンプルは、かなりの量の切断側製品を示しており、これはイオン交換HPLCを介して除去することが困難である。このようなサンプルのトラブルシューティングには、(a)温度の低下、RNase Hの量、または反応時間、(b)溶出勾配および注入量の低減および副産物からターゲット分数の分離を伴う。イオン交換HPLC精製における分解能を高める方法についてのさらなる情報は、カールソンらら31によって議論された。HPLCは、標的RNAを、より長くまたは短い核酸およびタンパク質または低分子汚染物質から分離する。 図3B は、イオン交換HPLC精製に最適な結果を示す。溶出勾配は、ターゲットRNA種が次の小さな種の後に少なくとも1つのカラム体積(この例では35 mL)、次の大きな種の前に1列の体積を溶出するような選択が必要です。
この方法の小さい種は、単一ヌクレオチド、中止生成物(8-12nt)、3'および5'スペーサー配列(5-14 nt)、および切断ガイド(12 ntキメラ核酸)を含むが、より長い配列はタンデム反復およびプラスミドを潜在的にアンリーブ解除される。溶出ピークが十分に分離されると、精製は、1回のインジェクションあたりIVT反応の〜20 mLに相当する量にまでスケールアップすることができる。RNAサンプルの正しい折り目はRD実験にとって非常に重要であり、すべての測定の前に確認する必要があります。 図4 は、ステップ2.4(青)の折りたたみプロトコルが適用される前のA標識22-mer RNAと、正しい折りたたみが達成された後の同じサンプル(赤)を示しています。Mc-Fold二次構造予測(図4C)は、提示されたヘアピン構造を提案し、4塩基対を有し、5つのイミノ信号を生じる。
図4Aの両方のスペクトルは、これらの予測信号を確認し、わずかに異なる相対強度を有するが、これはいくつかの誤った構造(ここではダイマー)が1H1Dスペクトルのみで評価するのに問題があることを示している。芳香族1H、13C-HSQCスペクトル(図4B)は、折りたたみプロトコル(青)前のサンプルの芳香族信号のうち3つだけを示しますが、ステップ2.4(赤)に従って折り畳まれたサンプルに対するすべての4つの信号を示しています。青色で示されたサンプルは、ヘアピンと同じイミノ信号をもたらすホモメーマ(図4Dで提案された構造)を形成した可能性が高い。A13H2の信号は、交流が広がっているようです。これらの結果は、各RD実験の前にイミノと芳香族指紋実験の両方で折りたたみ確認の重要性を強調するのに役立ちます。このプロトコルに記載されている1HR1ρパルス配列は、中間交換体制におけるダイナミクスの検出を可能にする。 最初にオン共鳴曲線が記録され、特定の残基にダイナミクスが存在する場合、分散は得られたR2+REX値内に見えますが、この曲線は交換のない残基に対して平坦です。
図5は、合成RNAヘアピン(図5A)において2つの異なるH8原子について得られた代表的なオン共鳴曲線を示し、G6H8経験交換(図5C)は交換しない(図5B)。このサンプル(kEX = 292±40Hz)では交換が比較的遅いため、SELOPE実験の利点が低いSL強度を達成し、1Dバージョンのパルスシーケンスを用いて2つのオン共鳴曲線を記録しました。その後、同じパルス系列を使用して、オン共鳴プロファイルの分散を示す残渣のオフ共鳴データを取得した。図5Dは、得られたR1ρ値とオフセットを示し、曲線のわずかな非対称性は既にΔωの符号を示している。 
これは、R1寄与が除去されるR2+REXプロットでさらに明らかになる(図5E)。同じ図の右の列は、G6H8経験交換(図5G)が交換しないのに対し、わずかに異なる合成RNAヘアピンで2つの異なるH8原子に対して得られた代表的なオン共鳴曲線を示している(図5F)。より速い為替レート(kEX = 43,502 ± 38,478 Hz)により、SELOPE 2Dバージョンを使用してすべての芳香族陽子のRD記録を一度に可能にし、オンレゾナンスデータとオフレゾナンスデータ(図5H,Iに表示されるG6H8データ)の両方を取得することができました。
正と負の結果の一般的な識別子 タンデムIVTおよびRNase H切断における肯定的な結果は以下のように識別することができる:1)ターゲットバンドは変性PAGEゲルの中で最も強いバンドである。2)メインバンドの周りに弱いバンドは存在しない、または弱いバンドしかありません。3)より低い分子量種は存在しない、または弱いだけである。4)HPLCクロマトグラムは、標的RNAの十分に分離されたピークを示す。5)主ピークがサンプリングされると、変性PAGEゲル上に1つのバンドのみが現れます。
以下のように存在するタンデムIVTおよびRNase H切断における負の結果:1)否定または弱いメインバンドが変性ページゲル上に見える。2) RNAタンデム反復から高分子量種のパターンが見える。3) メインバンドが存在するが、同程度の強度のバンドは、± 3 nt 内のメインバンドの上または下にある。
適切に折り曲げたサンプルは次のように識別できます:1)観察されたイミノ陽子の数は、二次構造シミュレーションから予想されるイミノ陽子の数と一致します(例えば、Mc-Fold39、図4A)。2)UUCGループ内のシンG-Uのぐらつきベースペア(存在する場合)は、〜9.5ppmで見えるが、時には低い温度でしか見えない。UUCGループのさらなるフィンガープリントは、Fürtigたちの同僚40によって説明されている。3) 芳香族指紋は、正しく折り畳まれることが確認された以前に割り当てられたサンプルと一致します(図4C)。
誤って折り畳まれたサンプルまたは劣化したサンプルは次のように識別できます:1)二次構造シミュレーションが予測するよりも多くのイミノ信号があります(注:塩基対を閉じることがしばしば見えないため、イミノ信号が少ないことは必ずしも誤って折り返すわけではありません)。2)イミノ信号の不在。3)芳香領域における高強度の狭いシグナルは、単一ヌクレオチド分解産物を示す。4) イミノ信号または芳香族信号間の発散が、確認された折りたたみの参考サンプルに (図 4C)
検出可能なタイムスケールでの交換を示さない原子は、次のように識別できます: 1) フラットなRDプロファイルから (適用されたSLパワーによって変化するREX寄与が欠落しているため) (図5Bおよび図5F)。2) kEXとΔωが同じ大きさの場合は、低速-中間交換の場合には注意が必要です。その場合、オン共鳴寄与度は図5Cに見られるように非常に小さくすることができます(この場合、適合パラメータはkEX = 292 ±40Hz、Δω = 112±4Hzです)。 疑わしい場合は、低SLオフ共鳴曲線を記録して検証することができます。
中間時間スケールにおける交換を示す原子は、オン共鳴RD実験における非平坦緩和分散プロファイルから1)同定することができる(図5B および 図5F)。HSQCまたはSELOPE実験における幅広い線幅は、交換の指標にもなることができます。
オフレゾナンス曲線の SL パワー値を適切に選択した (図5E、F):1) は、オン共鳴曲線にかなりのkEXの寄与を有します (選択された SL 電力値は図 5Cおよび図 5Gに示されています)。2) オフ共鳴曲線は、少なくとも 3 つの SL 電力値を測定するので、選択された SL パワー値はkEXの寄与を伴うオン共鳴曲線の領域に広がる必要があります。3)ラゲールフィット後の非フラットR2+REX曲線(例えば、図5D:SL強度25、50、75Hz;図 5E)。
オフレゾナンスカーブのSLパワー値の選択が不十分な(図5E、F)は、ラゲールフィット後にフラットなR2+REX曲線につながります。例は図5Eに示されていますが、100 Hzのオフ共鳴曲線は非常に平坦であるため、Δωに関する重要な情報は提供していません。
回転フレーム核オーバーハウザー効果(ROE)アーティファクトの適応症:1)オフ共鳴曲線から得られたΔωは、空間近傍/陽子の陽子の化学シフトと一致し、核オーバーハウザー効果分光(NOESY)スペクトルにおける関心のピークと交差ピークを示す。(例えば、図5Iは、高速中間交換に期待される広いオフ共鳴曲線を示していますが、曲線には-3000 Hzと+1500 Hzのなど、より鋭い特徴もあります。これらは、異なるコンフォーマーにおけるこのH8の化学シフトではなく、ROEアーティファクトが原因である可能性が非常に高い)。2)ラゲールフィットはうまくいきますが、高いSIN(>20)(例えば、kEX = 43,502 ±38,478 Hz)の実験から指数関数が得られたにもかかわらず、オン共鳴と少なくとも3つのオフ共鳴曲線ではうまく機能しません(高い誤差または物理的に不可能な値を与えます)。各 SL は個別にフィットする場合が多いですが、それらを一緒に合わせると、はるかに高い誤差が発生します。真の励起状態では、逆の動作が期待されます。
「真」交換Δω:1)オフ共鳴曲線から得られたΔωは、NOESYスペクトルの関心ピークを有する交差ピークを示す空間近傍/陽子における陽子の化学的シフトと一致しない(例えば、図5E)。2) ラゲールフィットは、オン共鳴と少なくとも3つのオフ共鳴曲線に対して低い誤差を与える(例えば、図5E対.図 5Iは、適合結果のキャプションを参照してください。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> 図3:T7タンデムIVTおよびRNase H切断反応によるサンプル産生.(A)タンデムIVTおよびRNase H切断の陽性および陰性の結果の変性ページ。ラダー高さはRNA参照を指し、12*はキメラ切断ガイドを指す。レーン1:20nt標的RNAの生成に成功。短く、より長い製品が存在する少数。レーン2a:タンデム転写産物の不完全な切断。HPLC精製は可能ですが、多くの材料が無駄になります。レーン2b:レーン2のRNase H切断を続けて、HPLC注入の準備ができてクリーンなサンプルを生成する(レーン1と同一)。レーン4:RNase H切断はほとんど失敗し、標的バンドは産生されなかった。全長タンデムトランスクリプトは、600 ntでまだ見えます。レーン5:ターゲットバンドが製作されたが、強い-1バンドが存在する。HPLCは行うことができるが、副産物の取り外しには注意が必要である。(B) HPLC注入に成功した例38分のピークには、ターゲット長の純粋なRNAが含まれ、長く短い製品はターゲットRNAから十分に分離されています。パネル B は21から変更されました。略語: IVT =インビトロ転写;HPLC = 高速液体クロマトグラフィー;nt = ヌクレオチド;AU = 任意の単位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> 図4:NMRにおける折りたたみ工程2.4(プロトコル参照)の前(青色)および後(赤色)のRNAヘアピンの例(A)A標識22-mer RNAの1H-1Dスペクトルのイミノ領域。 イミノ信号の基本ペアのアイデンティティに期待される領域は、下の灰色で示されています。(B)1H、13C-HSQCスペクトルのパネルAからのRNAの芳香共鳴。 折りたたみ後のサンプル(赤)は予想通り4つの信号を示し、折る前のサンプル(青色)は3つの信号しか示さない。(C)ヘアピンとしての22-mer RNAのMc-Fold予測。この二次構造から5つのイミノ信号が期待され、パネルA(D)22-mer RNAによって形成されたホモモマーの提案された構造の両方のサンプルに見られ、ヘアピン構造と同じ5塩基対をもたらす。略語: NMR = 核磁気共鳴;1D = 1 次元;HSQC = ヘテロ核単一量子相関;ppm = 100 万分の 1 の部品。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> 図5: RNAヘアピンに基づく 2 つの異なる構築物に対する 1 H R1ρ RD 代表結果(A)左側のカラムは、膨らんだUの上にC-G塩基対を有するRNAで得られた結果を示し、右側の列は塩基対がG-Cに切り替えられたサンプルで得られた結果を示す。(B)および(F)は、2つの構成体に対してA4H8について得られた平坦分散プロファイルを示し、立体構造交換を示さない。(C–E)は、(G-C)構造中のG6のために得られたオン共鳴、オフ共鳴、および適合データを示す。ラゲールフィットは、0.01 Hz、± R 2 = 7.76 ± 0.03 Hz、k EX =292 ± 0.03 Hz、k EX =292 ± 00 Hz、p ES = 0.31 ± 0.03 %、Δω = 112 ± 4 Hz(G –I)のオン共鳴、オフ共鳴、および適合したデータを示す結果になります。 ラゲールフィットは、R1 = 1.93 ± 0.02 Hz、R2 = 6.71 ± 0.86 Hz、k EX = 43,502 ± 38,478Hz、p ES = 27 ± 16 %、Δω = 203 ± 166 Hz。 この図は20から変更されました。略語: SL = スピンロック。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

13C/15N標識および非標識RNA上のマイクロミリ秒のダイナミクスを測定するプロトコルを、1H R1ρ緩和分散核磁気共鳴(NMR)分光法で提示します。このプロトコルの焦点は、高純度のサンプル調製とNMR実験のセットアップにあります。

RNAの1H R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

本プロトコルは、RNA分子における確認交換を調べるプロトンR1rho緩和分散測定のためのRNAサンプル調製およびNMR設定について説明する。陽子がプローブされるため、この方法は同位体標識を必要とせず、シフトされたベースペアリングなどの構造的特徴に直接アクセスできます。ピペットは、サンプルが別の方法で製造された場合でも、R1rho緩和分散を測定することができるという意味で非常にモジュラーです。まず、プラスミドサンプルを調製し、テキスト原稿に記載されているようにインビトロ転写および切断反応を設定します。反応を摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、サンプルの1マイクロリットルを10倍の負荷溶液で希釈します。そして、変性ページゲル上の1マイクロリットルを実行します。切断反応が成功した場合は、目的のボリュームに反応をスケールし、一晩実行します。次に、別の変性PAGEゲルを実行し、切断反応が完了したかどうかを評価します。不完全な切断の場合は、反応液を450ワットの従来のマイクロ波で15秒間加熱します。その後、溶液を摂氏37度まで40分間ゆっくりと冷却し、RNAと切断ガイドを再膜します。そして、新しい沈殿物の形成に注意してください。さらに無機のパイロホスファターゼとRNase H.Incubate摂氏37度で1〜3時間の反応を加えます。次に、変性PAGEで切断反応の完了を確認する。RNase H切断反応が完了したら、EDTAを50ミリモル最終濃度に添加して反応を焼き付ける。そして、徹底的に渦。0.2ミクロンのシリンジフィルターを使用して溶液をフィルター処理します。そして、浄化のためにHPLCシステムに注入可能な容積に溶液を濃縮する。濃縮および精製サンプルをNMRチューブに加える前に、豊富な水で洗い流してチューブを洗浄してください。次いで、RNase除染試薬、水、および95%エタノールを除いた。最後の水ですすった後、乾燥させておきます。プランジャーを水で洗い流し、リントフリーワイプを使用してRNase除染試薬と95%エタノールで洗浄します。チューブとプランジャーを乾燥させた後、NMRサンプルに10%D2Oを加えます。大きなピペットチップを使用してRNAサンプルをNMRチューブに移し、チューブ壁の側面に沿って流します。気泡を取り除くために速いねじれ運動でそれを押し下げてチューブにプランジャーを挿入し、新しい気泡を作成せずにゆっくりとプランジャーを引き上げます。そして、パラフィンワックスフィルムでそれを修正します。RNA 割り当てのために完全に標識された RNA サンプルに使用される芳香族陽子炭素 HSQC データセットに基づいて、新しいデータセットを作成します。一般的なパラメータと RD 固有のパラメータを設定します。次に、テスト用にプロトンスピンロックパワーを1.2キロヘルツに設定します。1 つのエントリ、0 ミリ秒のテスト vd リストを生成し、TDF1 を 1 に設定し、D30 を更新してテスト スペクトラムを実行します。テスト vd リストを設定した後、D30 と TDF1 を更新します。そして、異なるスピンロックの長さのためにピークの強度をプロットします。元のピークの強度が 3 分の 1 に減少するスピン ロックの長さを識別します。テストの実行結果から、実験で使用する最終的な vd リストを作成します。スキャン数を選択して、リストの最も弱いピークの信号対ノイズ比が少なくとも10になるようにします。タンデム転写物のいくつかの切断反応の結果をここに示す。20ヌクレオチド標的RNAを、正常な反応で生成した。失敗した反応は、サンプルの不完全で失敗した切断をもたらした。RNAサンプルのHPLC注入は、38分で純粋な標的RNAのピークを明らかにした。より長く、より短い製品は、関心のピークから十分に分離されていました。RNAヘアピンの分析は、観察されたイミノ陽子の数が二次構造シミュレーションから予想されるイミノ陽子の数と一致することを示した。RNAの芳香共鳴のプロトン炭素HSQCスペクトルは、フォールディング後に4つのシグナルを示した。そして折る前に3つの信号だけ。2つの異なるH8原子および2つの異なる合成RNAヘアピンについて得られた共鳴曲線の代表において、G6H8は確認交換を経験する。A4H8はしませんが。G6H8では、色付きのスピンロック力を選択し、オフ共鳴データを記録した。交換が遅いCG構成体では、R1rho行値対オフセットプロットは、すでに微小な曲線の非対称性を示し、化学シフト差δΩの兆候を示した。R2 と REX プロットでは、R1 寄与が除去される場合に、このことがさらに明らかになります。一方、GC構築物は交換が速く、R1rho値対オフセットプロットは、R2とREXプロットでもデルタオメガの抽出があまり明白にならないほど広い曲線を示した。RNAのダイナミクスが解明されると、状態を特徴づけ、閉じ込めることができます。これらの閉じ込められた状態は、例えば、生物学的アッセイで試験することができる。この方法により、活性マイクロRNA miRNA複合体における機能的で関連する塩基対合シフト、リボソームRNAにおけるループ再配列、および一塩基膨らみの塩基対安定性を観察することができます。

Research

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15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

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