우리는 T7 RNA 폴리머라제와 대장균 RNase H, 마틴 Hällberg의 발현 및 정제에 대한 카롤린스카 연구소의 단백질 과학 시설 (PSF)에 감사, 그리고 귀중한 토론을위한 전체 Petzoldlab. 우리는 매크로와 피팅 스크립트에 대한 기여에 대한 U-벌지 구조와 에밀리 스타이너와 캐롤라이나 폰타나의 준비루카 레타티노 감사합니다. 우리는 카롤린스카 연구소와 의료 생화학 및 생물 물리학학과가 600 MHz 분광기 및 위치 파이낸싱 (KI FoAss 및 KID 2-3707/2013)의 구매 지원을 지원한 것을 인정합니다. 베텐스코프로데트(#2014-4303), 스티프텔슨 포르스크닝(ICA14-0023, FFL15-0178), 라그나르 쇠데르베르크 스티펠스(M91-14), 하랄드 오크 그레타 청바지 의 재정적 기여에 감사드립니다. (JS20140009), 칼 트리거스티스 스티펠스 (CTS14-383 및 15-383), 에바 오크 오스카 아렌스티펠스, 오케 위버그 스티펠스 (467080968 및 M14-0109), 암폰덴 (CAN 2015/388), J.S. 마리 Skłodowska-Curie IF를 통해 자금을 인정 (EU H2020, MSCA-IF 프로젝트 no. 747446).

K.P.는 RNA를 표적으로 하는 작은 분자를 발견하는 회사인 아라키스 치료제의 컨설턴트입니다.

본 명세서에 제시된 프로토콜은 연구기사10, 20,21, 31의형태로 이전에 발표된 여러 프로토콜의 합성이다. 따라서 프로토콜의 세그먼트를 적용할 수 있으며 다른 프로토콜은 판독기의 기본 설정으로 교환할 수 있습니다. 예를 들어, R1θ 측정은 길이의 접기 및 균일성이 가정된다는 점을 감안할 때 임의의 방법으로 생성된 RNA 샘플에서 수행될 수 있다. 더욱이, 프로토콜은 R 실험에 필요한 RNA 서열계의 공명 할당에 대한 정보를 포함하지 않는다-이는 이전 문헌19,37,38에서광범위하게 다루어졌기 때문이다. 부분, 세그먼트, 또는 사이트별 라벨링방식(36,41,42,43,44)은 공진 할당을 용이하게 하거나 RD 실험에 관심이 있는 공진의 중복을 감소시키고 문헌의 길이로 기술된 접근법이다. 이 방법은 이미 공명 할당을 크게 단순화 할 수있는 모든 뉴클레오티드 정체성의 균일 한 라벨링을 사용할 수 있습니다.
여기에 제시된 IVT 메서드는 시퀀스 및 라벨링으로 알려진 문제를 극복하고 수율을 증가시키고 다른 방법에 비해 비용과 작업 시간을 줄입니다. 바이러스 개시 서열의 사용은 반응 최적화의 필요성을 감소시키며, 이는 비-G 개시의 경우 성적증명서의 복사본만 수행하고 산출하는 데 시간이 많이 소요될 수 있는 현장에서 알려진 문제이다. 탠덤 전사체의 T7 IVT 및 RNase H 골짜기는 동일한 용기에서 동시에 수행될 수 있다. 다황 탠덤 반복의 패턴은 RNase H 반응의 완료 시 표적 RNA에 단일 대역에 결합되는 반응 중에 파면 페이지 겔을 볼 수있다(도 3A,차선 1 및 2b). 이 방법을 사용하는 전형적인 수율은 1mL IVT당 30~70nmol RNA 사이의 범위이다. 그러나, 탠덤 반복의 RNase H 분열에 기초한 방법은 그 자체의 특정 문제 없이 오지 않습니다. RNase H 분열 반응은 T7전사(도 3A,레인 2a)와 동시에 주행할 때 완료되지 않는 경우가 많다.
탠덤 유닛의 분리는 전사체에 대한 분열 가이드를 어닐링하고 더 많은 RNaseH(도 3A,레인 2b, 단계 2.1.2)를 추가하여 최종 확정될 수 있다. 대용량의 가열이 느리고 RNA의 Mg2+촉매 가수분해로 이어지므로, 종래의 전자레인지가 사용되어 샘플을 10-15s에서 >95°C로 가열하였다. 생산된 견본에 불리한 효력은 지금까지 관찰되지 않았습니다. 일부 구문은 반응 조건의 최적화에 의해 제거될 수 없는 작은 두 번째 대역을보여준다(도 3A,레인 4). 일반적으로 이들은 오히려 HPLC 크로마토그램에서 어깨로 명확하게 볼 수 있으며, 잘 최적화된 용출 그라데이션이 사용되는 경우 제거할 수 있다(단계 2.2.5). 다음 토론은 특히 형태 역학의 해석을 허용하는 고품질 데이터를 얻는 것과 관련하여 프로토콜의 중요한 단계를 강조하는 것을 목표로합니다.
RNase 오염 세포외 RNases는 유비쿼터스, 매우 안정적이며 NMR 샘플의 장기적인 안정성에 가장 큰 위협이됩니다. 따라서 RNase가 없는 환경에서 작업하고 모든 시약 및 플라스틱 제품 RNase를 무료로 유지하는 것이 중요합니다. 필터 팁과 어쩌면 얼굴 마스크의 사용을 권장합니다. 이것은 HPLC 정화 후에 특히 중요합니다. RNases로 오염된 NMR 샘플은 일반적으로 단일 뉴클레오티드 분해 제품으로 인해 며칠 또는 몇 주 후에 1H-1D 스펙트럼에서 보이는 좁은 봉우리를 나타낸다. 이러한 샘플은 R 1θ 측정에 적합하지 않습니다.
NMR 샘플 고도로 충전된 특성으로 인해 RNA는 대부분의 단백질과 비교할 때 강수량 없이 고농도로 사용할 수 있습니다. 시게미 NMR 튜브(재료표 참조)의사용은 코일 중앙에 고농축 시료를 중심으로 할 수 있도록 하면서도 감수성 매칭 유리 바닥과 플런저로 인한 이상적인 쉬밍 및 잠금 조건을 제공하기 때문에 유리합니다. 이렇게 하면 B1-불동성이 감소되어 더 좁은 선이 생겨나게 됩니다. NMR 튜브의 일반적인 샘플 부피는 250 μL이며 일반적인 농도는 1-2 mM입니다. 실험이 너무 오래 걸리고 좋은 쉬가 되기 때문에 500 μM 이하의 샘플은 RD 실험에 권장되지 않습니다. 마찬가지로, 200 μL 미만의 샘플 부피는 좋은 심과 필드 안정성(lock)이 필요하기 때문에 권장되지 않습니다. 플런저를 삽입할 때 시료(2.4.5단계)에서 기포의 형성을 피하는 것이 중요합니다. 제대로 고정되지 않으면 플런저가 샘플로 아래로 미끄러져 감지 가능한 볼륨을 줄일 수 있습니다. 더욱이, 온도의 급격한 변화는 견본에 있는 새로운 기포의 형성으로 이끌어 낼 수 있습니다. 따라서 샘플을 운반할 때와 NMR 분광계에서 프로브 온도를 변경할 때주의를 기울여야 합니다. 더 긴 기간 후에 다시 측정할 때 시료를 거품에 대해 확인합니다.
RNA 접이식 동적 RNA 분자는 제대로 접히지 않을 때 여러 적합성에 존재할 수 있습니다. 이차 구조물의 용융 온도는 실온보다 약간 높을 수 있지만 측정 전에 철저한 가열 및 스냅 냉각 절차를 권장합니다. 운동 제어(가열 및 스냅 냉각)에서 접이식 고농축 헤어핀 샘플은 시간이 지남에 따라 호모이머를 형성할 수 있으며, 이는 각 NMR 측정 전에 RNA 접이식의 엄격한 제어가 필요합니다. 측정된 RNA가 헤어핀 구조가 아니라 RNA 이중인 경우 열역학 제어 하에 느린 접이식이 적용되어야 합니다.
이 경우 가열 후 냉각 공정은 시간 범위에 있어야 하며 RNA는 NMR 샘플의 최종 부피 및 농도에서 사용되어야 합니다. 예상 이미노 및 방향족 공명의 초기 수는 샘플의 균질성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 샘플이 예상된 것처럼 보이지 않으면 다시 접혀야 합니다. Mg2+ (염화물 염으로 추가) 접는 RNA 구조에 도움이 될 수 있습니다(45. 실제로 접이식 제어는 적어도 부분적으로 NMR 공진을 할당하고 실험적으로 이차 구조를 해결하는 데 사용된 샘플에 대한 비교 역할을 한다.
스핀 잠금 전원 및 난방 고려 사항 1H R1θ RD 실험을 2D 개요 실험으로 실행하는 경우 SL 전력은 1.2kHz 미만이어야 합니다. 무선 주파수 송신기 주파수는 관심피크의 ppm 영역 의 중간에 배치되어야한다(예를 들어,방향족 양성자의 경우 7.5 ppm). 그런 다음 1.2 kHz의 대역폭은 주요 공진 효과없이 이러한 양성자를 스핀 잠금시킬 만큼 충분히 큽것입니다. 이러한 효과는 RD 프로파일에서 식별할 수 있습니다. 이러한 문제가 발생하면 R2+REX 값이 증가하는 대신 SL 전력 값이 증가하며 특히 낮은 SL 전력의 경우 증가합니다. 계산된 SL 전력 값이 샘플에 전달된 전력과 일치하는지 확인합니다. 실제로, 1 H90° 하드 펄스가 새로운 분광계에서 신중하게 보정된 경우 계산된 SL 전력을 사용할 수 있습니다. 그러나 원하는 각 대역폭에 대해 SL 전력을 보정하여 이를 확인할 수 있습니다.
1H R1θ RD 실험에서 사용할 수 있는 SL 전력의 범위는 매우 광범위하여 다양한 시료 가열(HCP 기반 시퀀스에 대한 HSQC의 경우 1.2kHz ~ 15kHz, SELOPE 실험을 위한 50Hz ~ 15kHz)로 이어집니다. 저전력 SLs에대해 얻은 1D를 비교할 때 화학적 시동이 약간 변화함에 따라 불평등한 시료 가열을 감지할 수 있다. 고출력 SLs. 이 효과는 일반적으로 이종핵에 대한 R1θ 실험에서 열 보정에서 고려되지 않습니다. 이러한 실험의 열 보정은 일반적으로 각 스핀 잠금 전원 시리즈의 vd 목록에 지정된 다양한 스핀 잠금 지속 시간으로 인해 다른 가열을 보정하도록 설정되어 있습니다. 특히 SELOPE 실험의경우, 20에설명된 바와 같이 적용된 모든 SL 강도에 대해 두 번째 열 보정을 사용해야 한다.
vd 목록 고려 사항 앞에서 언급했듯이, vd 목록은 강도의 상당한 붕괴를 얻을 수 있을 만큼 긴 시간점을 포함해야 합니다(이상적으로 초기 신호의 30%까지 또는 프로브의 사양 내에서 70% 부패에 도달할 수 없는 경우 가능한 한 낮음). vd 목록은 낮은 SL 전력(1.2kHz)에 최적화되었지만 이 vd 목록은 사용할 가장 높은 SL전력(예:15kHz)에서 테스트해야 합니다. 이는 REX 기여도가 높은 봉우리들의 경우 높은 SL 전력에서 부패가 훨씬 느려질 것이라는 사실 때문입니다. 따라서 높은 SL 전력에서도 충분한 부패를 검증해야 합니다. 공진 이 외에도 높은 오프셋에서 부패를 고려해야 합니다. vd 목록의 이상적인 최대 시간점은 분산 실험의 다른 영역에 대해 크게 다를 수 있습니다. 이 경우 vd 목록에 더 많은 포인트가 포함될 수 있으며, 분석 중에 더 높은 SL 전력 또는 더 높은 오프셋에 대한 더 긴 VD 목록 포인트는 낮은 SINO에 따라 폐기될 수 있습니다. 일반적으로 5-8 vd 목록 포인트는 J-커플링과 같은 비지수수하 부패로 이어지는 잠재적 인 유물을 발견 할 수 있는 것으로 간주되어야합니다(아래 참조).
1D-HCP 선택성 고려 사항 2D HSQC 기반 실험의 1H치수에 대한 관심피크와 또 다른 피크가 겹치는 경우 HCP 기반 1D 버전을 실행할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. HCP 기반 전송은 매우, 하지만 결코 100% 선택적, 따라서 그것은 또 다른 피크 1D에 관심의 피크의 강도와 부패 행동에 기여 발생할 수 있습니다. 이에 대한 표시는 레이블이 붙은 실험의 1D 및 2D 버전을 사용하여 얻은 공진 R1θ 값의 차이일 것입니다.
ROE 고려 사항: 느린 중간 교환을 가진 원자의 오프 공명 곡선의 경우, ROE 유물은 NOESY 또는 ROESY 스펙트럼과 얻은 Δω의 비교에 기초하여 식별 될 수있다. Δω에해당하는 화학 적 시프트 차이로 교차 피크를 식별 할 수 있다면, 관찰 된 흥분 상태는 실제로 ROE 아티팩트일 수 있습니다(예를 들어,ROE는 방향족 양성자 사이에 발견되었으며, 이는 모두 동일한 화학 적 변화 범위에 있으므로 공진곡선(20)에의해 덮여 있다. 경험에서, 이것은 항상 큰 오류와 가난한 적합을 주도, 아마도 때문에 ROE는 증가하는 SL 전력R EX와 같은 패턴을 따르지. 중간 빠른 교환이 상황은 더욱 어려워집니다. 온 공명 곡선은 GS와 ES 간의 교환 공정을 대표하는 (이웃 핵에서 얻은 13C 데이터와 비교하여) 여전히 여러 ROE 유물의 영향을 받습니다.
이 경우, 교환 공정을 감지하는 SL 전력은 > 더 크므로 다양한 ROE 후보의 화학적 변화 차이에 걸쳐 공진 곡선으로 더 많은 수의 양성자를 가로지르며(H8의 경우 ca. ±1000Hz, H5/H1의 ca. -1200Hz, imino protons)에서 의아컬한 양성자입니다. 지금까지, 이러한 ROE 유물을 억제하는 방법이 발견되지 않았으며(부분적으로 유족 뉴클레오티드(46)를 사용하는 것 이외에), 공진 데이터는 빠른 중간 교환을 위해 기록되어서는 안 되며, 실제 Δω에 대한 신뢰할 수 있는 정보는 이 방법으로 추출될 수 없기 때문에 NOE/ROE 기여도는 NOESY 스펙트럼을 통해 배제될 수 없다.
J-커플링(하트만-한) 고려 사항 H6과 같은 호모핵 J-커플 양성자에 대한 공진 곡선은10,20을성공적으로 기록했지만, 특히 하트만-한 매칭 조건이 조사된 오프셋의 넓은 범위에 걸쳐 있을 수 있기 때문에 낮은 SL 전력에 대해 공진 측정을 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. Hartmann-Hahn 유물은 공진 RD 플롯20에서SL 강도를 증가시켜 지수 붕괴 또는 R2+REX 값을 증가시 진동으로 식별할 수 있다.

RNA는 다수의조절1,촉매2,및 세포내 구조3 기능을 수행하며, 이들 중 상당수는4,5,6,7의유연한 분자 구조와 복잡한 변화와 상관관계가 있다. 낮은 인구 주 구조 결정의 대부분의 방법에 보이지 않는 남아 또는 높은 원자 해상도에서 이러한 숨겨진 상태의 연구를 허용하지 않습니다. 솔루션 상태 핵 자기 공명(NMR) 분광기는 개별 원자 핵에 대한 액세스를 제공하고 모든 시간 정권8을통해 역학을 대상으로 하는 대규모 실험 도구 상자를 제공함으로써 두 측면을 결합합니다. RD NMR 실험은 중간 시간대에 형성 교환에 대한 액세스를 제공하며, 여기서 기본 페어링 패턴 및 국소 구조 재배열의 변화는5,9,10,11,12,13,14를예상할 수 있다. RD 실험은 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 펄스트레인(15)의 형태로 긴R2 측정또는 회전 프레임에서 이완 측정으로 수행되며, R1θ RD실험(16)이라고불린다.
둘 다 소국가에 대한 인구와 환율 및 화학적 변화 차이를 추출하는 데 사용될 수 있지만, R1θ RD 실험은 또한 흥분 상태의 화학적 변화 차이의 징후를 준다. 이것은 RNA구조물17의화학적 변화와 강하게 상관되는 이차 구조물에 대한 추론을 허용한다. 화학적 변화는 뉴클레오베이스에 방향족 양성자와 탄소의 경우, 이미노 양성자에 대한 기본 페어링 파트너, C4및 C1의 원자18,19에설탕 퍼커의 경우 헬리시티의 좋은 지표이다. 최근에는 더 높은 스핀 락(SL) 전력을 이용한 화학교환 포화전달(CEST) 실험을 통해 CEST 실험의 적용가능성을 더 빠른 교환 시간대로 전환하여, 하나의 흥분된 상태를 가진 시스템에 대한 R1θ RD 실험의 대안으로 공표되었다는 점에 유의해야 한다.
13C 및 15N 동위원소는 종종 구조 교환에 액세스하는 데 사용되었지만,이 실험실에서 최근 작업은 형성 교환9,10에대한 프로브로 방향족과 이미노 양성자를 사용했다. 관찰된 핵으로서 1H를사용하면 몇 가지 장점이 있습니다(예: 더 빠르고 느린 시간 척도, 더 높은 감도 및 더 짧은 측정 시간에 교환할 수 있는 액세스) 등이 있습니다. 이는 SELective 최적화 양성자 실험(SELOPE) 접근법에 의해 더욱 촉진되며, 이종핵 자화 전달 대신 호모핵 스칼라 커플링을 사용하여 1차원(1D) 스펙트럼의 탈밀을 통해 방향족 양성자에 대한 접근을 제공하고, 동위원소라벨(20)의필요성을 제거한다. 이 프로토콜은 균일하게 13C/ 15 N 라벨 및 레이블이 없는 샘플의 1H R1θ RD 실험에서 측정을 다룹니다. 따라서, 본 백서는 상이한 샘플 준비요구(21)에 대해 가장 다재다능한 것으로 밝혀진 샘플 준비 방법을 제시하고, 본 문서의 마지막 섹션에서 대안을 논의한다(도1).
이 시점에서, 판독기는 다른 샘플 준비 기법이 1H R1 RD 실험에 허용되며, 다른 구조 및 기능 분석 방법은 제시된 기술로 합성된 샘플로 수행될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 1 H R1θ RD 실험은 분자 역학의 신뢰할 수 있는 특성을 보장하기 위해 RNA 길이와 구조적 형태 모두에서 높은 RNA 농도(이상적으로 >1mM)뿐만 아니라 높은 균질성을 필요로 한다. 시험관 내 전사(IVT)는 많은 연구자들이 13C/15N-표지 RNA 시료를 제조하는 데 선택되는 방법은 표기된 뉴클레오시드 삼위산염(NTPs)의 가용성으로 인해 효소반응(22)에서의 편성편성이다. 그러나, 널리 사용되는 T7 RNA 폴리머라제(T7RNAP) (T7RNAP)(23,24,25)는 특정 개시 서열(26,27)의 경우 낮은 5' 균질성을 앓고 있으며, 또한 전사유출(28)에서 3'균질성을 겪는다. 표적 RNA 종의 정제는 ~200 nmol의 다량의 필요성으로 인해 더 비싸고 힘들어집니다. 여기에 사용된 방법은 이전에 큰21에서장점이 논의된 곳에서 제시되었습니다. 간단히 말해서, 그것은 다음 사이트-구체적으로 cleaved 에세리치아 대장균 RNase H에 의해 갈라진 더 큰 탠덤 성적 증명서를 전사 하 여 설명 된 문제를 해결, 키메 라 고 뉴 클레 오 티 드에 의해 유도29,30 (자세한 내용은 그림 2 참조).
탠덤 전사체의 5' 및 3'끝에 스페이서 서열을 통합하면 플라스미드 템플릿의 선형화 부위에 가까운 터미널 오버행의 고수량 개시 서열 및 제거를각각(도 2B)할수 있다. 이 방법은 비용과 노동력을 줄이면서 수율을 크게 개선하는 것으로 나타났으며, 보다 복잡한 템플릿 합성의 주의와 추가 효소 및 올리고뉴클레오티드의 필요성이 있는 것으로 나타났다. RNase H 분열의 높은 특이성은 유사한 크기 범위에서 RNA 종의 부족으로 인한 정제를 용이하게한다. 본 프로토콜은 다른 방법이 가능한 대안이지만 최근31이실험실에서 발표 한 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 단계를 사용합니다. 1 H R1θ RD는 일반적으로 각각 의 두 펄스 서열을 가진 라벨이 부착되거나 레이블이 없는 샘플, 1H R1θ 이성핵 단일 양자 상관관계(HSQC)-13C 간접치 10및 "1HR 1selOPE 기반 실험을 1H간접 차원20으로 분류할 수 있다. 
이러한 2차원(2D) 실험은 Rθ 기간척도의 역학이 샘플에 존재하는지 여부에 관계없이 첫 번째 검사역할을 할 수 있습니다. 스펙트럼의 모든 해결된 피크에 대한 RD 개요를 얻을 수 있으며 보다 철저한 RD 분석에 대한 관심의 피크를 확인할 수 있습니다. 즉, 라벨이 부착되지 않은 샘플조차도 더 비싸고 라벨이 부착된 샘플을 생산하기로 결정하기 전에 확인할 수 있습니다. 변형 교환 기여도가 더 철저하게 연구되도록 선택되면, 소위 공진 실험을 수행하기 위해 위의 실험의 1D 버전으로 전환하는 것이 가장 좋습니다. 라벨이 부착된 버전의 경우, HSQC 는 13C R1θ 실험32, 33,34,35에사용되는 선택적 이성핵 교차 편광(HCP) 단계로 대체되며, SELOPE 실험의 경우, 실험은 단순히 1D로 실행되며, 이는 특히 H8 및 H2 신호에 대한 데 유용하다. 라벨이 부착된 샘플과 레이블이 지정되지 않은 샘플을 사용할 수 있는 경우 사용할 순서에 대한 한 가지 기준은 관심의 피크가 두 실험에서 얼마나 잘 격리되어 있는지입니다.
일반적으로 SELOPE 실험은 최대 50개의 뉴클레오티드의 RNA 샘플에 권장됩니다. 더 큰 RNA의 경우 중복이 더 커집니다. 그러나, 구조적으로 흥미로운 뉴클레오티드는 종종 덜 겹쳐지고 여전히 더 큰 RNA에서 접근할 수 있는 화학 교대 지역에서 나타납니다. 라벨이 지정되지 않은 샘플에서는 J-커플링이 1H에서 12C사이에 발생하지 않는다는 또 다른 논쟁이 있습니다. 그러나 최소 스핀 잠금 전력은 레이블이 지정된 실험에서 두 개의 스핀(~1kHz)을 분리하는 데 사용되는 최소 전력에 의해 정의되므로 레이블이 지정되지 않은 실험은 더 넓은 범위의 스핀 락(SL) 강점을 사용할 수 있으므로 더 넓은 범위의 교환 기간에 액세스할 수 있습니다. 이러한 공진 실험은 흥분 상태의 인구(대체 원포), pES, Δω의 형태로 매우 귀중한 화학적 변화 정보(지상 상태 및 흥분 상태의 화학적 변화 차이)와 같은 kex에추가 정보를 제공한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> 그림 1: 제시된 프로토콜의 워크플로우입니다. 실제 대규모 샘플 생산 전에 준비, 템플릿 준비 및 성공적인 시험관 내 전사 및 RNase H 분열의 확인으로 구성. HPLC 정화, NMR 튜브 충전, RNA 접이식 확인 을 포함한 대규모 생산. 동위원소 라벨 합성의 경우, 같은 날 그라데이션 최적화를 위해 라벨이 부착되지 않은 정제를 수행해야 합니다. R1θ 실험을 통해 형성 역학의 NMR 특성화. 각 단계는 독립적으로 수행될 수 있다, 예를 들어, 1HR1θRD 분석은 다른 방법으로 생성된 임의의 적합한 RNA 샘플에 적용될 수 있다. 약어: IVT = 시험관 내 전사; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; NMR = 핵 자기 공명; RD = 이완 분산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 프로토콜의 목적은 RNA 헤어핀 분자에서 1H R1θ 이완 분산을 가진 형성 역학의 연구를 위한 실제적인 세부 사항 및 중요한 매개변수를 제공하는 것입니다. 설계, 합성 및 이온 교환 HPLC 정제의 상세한 프로토콜을 제공 한 후 모든, 일부, 또는 없음 NTP를 13C/15N 라벨 버전으로 사용하여 수행 될 수있는 표적 RNA의 정제, NMR 샘플을 마무리하고 NMR 분광법을 사용하여 형성 교환을 확인하는 워크플로우가 설명되어 있다. 마지막으로, 브루커 NMR 분광계에 대한 1H R1θ RD 실험의 설정에 대한 세부 사항이 설명되어 있다(그림1). 이 프로토콜은 각 단계에서 레이블이 지정된 샘플및 추가 주석및 셀OPE버전(표 2)의설정에 맞게 조정할 테이블을 설정하는 1D 버전을 설정하는 데 제공합니다. 프로토콜 이후에는 샘플링 준비와 1H R1RD 설정에 대한 중요한 단계 및 대체 경로에 대해 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA는 매우 유연한 생체 분자이며, 구조의 변화는 RNA 분자가 세포 메신저 및 변조기로 실행되는 기능에 중요한 역할을합니다. 이러한 동적 상태는 대부분의 구조적 방법에 숨겨져 있지만, R1θ 이완 분산 (RD) 분광법은 원자 해상도에서 마이크로 - 밀리초 정권의 형성 역학의 연구를 할 수 있습니다. 관찰된 핵으로서 1H를사용하면 적용된 시간 정권이 더욱 확장되고 수소 결합 및 기본 페어링에 직접 접근할 수 있습니다.
이러한 연구에서 도전적인 단계는 고순도 및 고수율 샘플 준비, 잠재적으로 13C- 및 15N 라벨뿐만 아니라 이전에 보이지 않는 상태의 인구, 환율 및 이차 구조를 추출하기 위한 실험 및 데이터의 피팅 설정입니다. 이 프로토콜은 동위원소 표지 및 라벨이 부착되지 않은 RNA 샘플을 모두 사용하여 1H R1θ 실험의 적절한 RNA 샘플 및 설정의 준비를 보장하기 위해 샘플 준비에 중요한 실습 단계를 제공합니다.

RNA 생산을 위한 프로토콜은 고순도 성적증명서의 생성을 통해 정제를 용이하게 합니다. 도 3A는 탠덤 성적증명서의 여러 분열 반응의 결과를 보여 주며 성공적이고 실패한 반응을 모두 제공한다. 레인 1은 측면 제품의 희미한 흔적만으로 완전히 갈라진 성적 증명서의 최적의 사례를 보여줍니다. 레인 2a는 불완전한 분열을 나타내며, 이는 다시 어닐링하고 더 많은 RNase H(레인 2b, 단계 2.1.2)를 추가하여 해결할 수 있습니다. 차선 1, 2a 및 2b의 RNA 구조는 동일합니다. 레인 3의 샘플은 실패한 분열을 보여줍니다. 이 반응을 해결하는 것은 분열 가이드 순서, DNA 템플릿의 순도 및 온도의 검사를 포함합니다. 잠재적으로, RNase H 분열은 샘플 2에 대해 도시된 바와 같이 T7 IVT 후에 수행되어야 합니다.
레인 4의 샘플은 이온 교환 HPLC를 통해 제거하기 어려운 상당한 양의 분열 측 제품을 나타낸다. 이러한 시료를 트러블슈팅하는 것은 (a) 온도, RNase H의 양 또는 반응 시간, (b) 용출 그라데이션 및 사출 부피를 감소시키고 측 제품으로부터 표적 분획을 분리하려고 시도하는 것을 포함할 수 있다. 이온 교환 HPLC 정제의 해상도를 높이는 방법에 대한 추가 정보는 칼슨 외31에의해 논의되었다. HPLC는 표적 RNA를 더 길거나 더 짧은 핵산 및 단백질 또는 소분자 오염물질로부터 분리합니다. 도 3B는 이온 교환 HPLC 정제에 대한 최적의 결과를 나타낸다. 용출 그라데이션은 표적 RNA 종들이 다음 더 작은 종과 다음 큰 종 앞에 하나의 컬럼 부피(이 예: 35mL) 후에 적어도 하나의 컬럼 부피(이 예: 35mL)를 엘테하는 것을 선택해야 한다.
이 방법의 작은 종은 단일 뉴클레오티드, 중단 성 제품 (8-12 nt), 3' 및 5 '스페이서 서열 (5-14 nt), 및 분열 가이드 (12 nt 키메라 핵산)를 포함하지만, 더 긴 서열은 잠재적으로 항문 반복 및 플라스미드입니다. 잘 분리된 용출 피크가 달성되면, 정화는 주사당 IVT 반응의 ~20mL에 상응하는 것으로 확장될 수 있다. RNA 샘플의 정확한 접지는 RD 실험에 매우 중요하며 모든 측정 전에 확인되어야 합니다. 도 4는 2.4단계(파란색)에서 접이식 프로토콜이 적용되기 전에 A-표지된 22-mer RNA를 나타내며, 올바른 접이식 이후에도 동일한 샘플(red)이 이루어졌다. Mc-Fold 보조 구조예측(도 4C)은제시된 헤어핀 구조를 4개의 베이스 쌍으로 제안하여 5개의 이미노 신호가 생성됩니다.
그림 4A의 두 스펙트럼 모두 약간 다른 상대 강도에도 불구하고 이러한 예측 신호를 확인하며, 이는 일부 잘못 접힌 구조(여기, dimer)가 1H1D 스펙트럼으로만 평가하는 데 문제가 있을 수 있음을 나타냅니다. 방향족 1H,13C-HSQC스펙트럼(도 4B)은접이식 프로토콜(blue) 전에 시료에 대한 방향족 신호 중 3개만 나타내지만, 2.4단계(빨간색)에 따라 접힌 시료에 대한 모든 4개의 신호가 나타난다. 파란색으로 표시된 샘플은 헤어핀과 동일한 imino 신호를 초래할 호모디머(도 4D에서제안된 구조)를 형성할 가능성이 높습니다. A13H2의 신호는 교환 확대 된 것 같습니다. 이러한 결과는 각 RD 실험 전에 imino 및 방향족 지문 실험으로 접는 확인의 중요성을 강조하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜에 설명된 1H R1θ 펄스 서열은 중간 교환 체제에서 역학을 검출할 수 있게 한다. 처음에는 공진 곡선이 기록되고 특정 잔류물에 대한 역학이 존재하는 경우, 이 곡선은 교환없이 잔류물에 대해 평평한 반면, 얻어진 R2+REX 값 내에서 분산이 표시됩니다.
도 5는 합성 RNA 헤어핀(도5A)에서두 개의 상이한 H8 원자에 대해 수득된 대표적인 온공명 곡선을 나타내며, G6H8 체험 교환(도5C),A4H8은 그렇지 않은 반면(도5B). 이샘플(kEX = 292 ± 40Hz)에서 교환속도가 상대적으로 느리기 때문에, 낮은 SL 강도를 달성하기 위한 SELOPE 실험의 장점이 악용되었고, 두 개의 온 공명 곡선은 펄스 서열의 1D 버전을 사용하여 기록되었다. 동일한 펄스 서열은 공진 프로파일에서 분산을 나타내는 잔류물에 대한 공진 데이터를 얻기 위해 사용되었다. 도 5D는 얻어진 R1θ 값 대 오프셋을 나타내며, 여기서 곡선의 약간의 비대칭은 이미 Δω의기호를 나타낸다.
R 2 +REX 플롯에서 R1 기여도가 제거됩니다(그림5E). 동일한 그림의 오른쪽 컬럼은 G6H8 경험교환(도 5G)을경험하는 반면, A4H8은(도 5F)를경험하는 반면, 약간 다른 합성 RNA 헤어핀에서 두 개의 다른 H8 원자에 대해 얻은 대표적인 온 공명 곡선을 나타낸다. 빠른환율(kEX = 43,502± 38,478Hz)은 SELOPE 2D 버전을 사용하여 모든 방향족 양성자의 RD 레코딩을 한 번에 허용하여 온-오프 공명 데이터(그림 5H,I에표시됨)를 모두 얻을 수 있었습니다.
양수 및 음수 결과를 위한 일반 식별자 탠덤 IVT 및 RNase H 분열의 긍정적인 결과는 다음과 같이 식별될 수 있다: 1) 대상 밴드는 디마링 PAGE 젤에서 가장 강한 밴드이다. 2) 메인 밴드 주위에 더 또는 약한 밴드가 없습니다. 3) 더 또는 약한 더 높은 분자량 종은 없습니다. 4) HPLC 크로마토그램은 표적 RNA의 잘 분리된 피크를 나타낸다. 5) 주 피크를 샘플링하면 단 하나의 밴드만 부인 페이지 젤에 나타납니다.
다음과 같이 탠덤 IVT 및 RNase H 분열의 부정적인 결과는 다음과 같습니다: 1) 아니 또는 단지 약한 메인 밴드는 데니링 PAGE 젤에 볼 수 있습니다. 2) RNA 탠덤 반복에서 높은 분자성 종의 패턴이 눈에 띈다. 3) 메인 밴드가 있지만 유사한 강도의 밴드는 ± 3 nt 내에서 메인 밴드 보다 위 또는 아래에 있습니다.
잘 접힌 시료는 다음과 같이 식별될 수 있다: 1) 관찰된 이미노 양성자의 수는 이차 구조 시뮬레이션에서 예상되는 이미노 양성자의 수와 일치한다(예를들어,Mc-Fold39, 도 4A). 2) UUCG 루프의 G-U 동요 베이스 쌍(존재하는 경우)은 ~9.5 ppm에서 볼 수 있으며 때로는 낮은 온도에서만 볼 수 있습니다. UUCG 루프의 추가 지문은 Fürtig및 동료에 의해 설명되었다(40). 3) 방향족 지문은 올바르게 접는 것으로 확인된 이전에 할당된샘플(도 4C)에동의합니다.
잘못 접히거나 분해된 시료는 다음과 같이 식별될 수 있습니다: 1) 이차 구조 시뮬레이션보다 더 많은 이미노 신호가 예측됩니다(참고: 폐쇄 기본 쌍이 보이지 않는 경우가 많고, 형태 교환이 라인을 넓히기 때문에, 반드시 잘못된 접을 의미하지는 않습니다.). 2) 이미노 신호의 부재. 3) 방향족 영역에서 고강도의 좁은 신호, 단일 뉴클레오티드 분해 생성물을 나타낸다. 4) 확인된 접이식의 기준 샘플에 이미노 또는 방향족 신호 사이의발산(도 4C).
검출 가능한 시간대에 교환을 나타내지 않는 원자는 평면 RD 프로파일로부터 다음과 같이 식별될 수 있다(적용된 SL 전력에 따라 누락된 REX 기여로 인해)(도5B 및 도 5F). 2) kEX및 Δω이 동일한 크기의 경우 느린 중간 교환의 경우주의를 기울여야한다. 이 경우, 공진 기여도 5C에서 볼 수 있는 매우 작을 수 있다(이 경우 장착된 파라미터는 kEX = 292± 40Hz 및 Δω = 112 ± 4Hz)이다. 의심스러운 경우 검증을 위해 낮은 SL 오프 공진 곡선을 기록할 수 있습니다.
중간 시간 척도에서 교환을 나타내는 원자는 공진 RD실험(도 5B 및 도 5F)에서비평평한 이완 분산 프로파일로부터 1)을 식별할 수 있다. 2) HSQC 또는 SELOPE 실험에서 더 넓은 라인폭은 교환의 지표가 될 수 있습니다.
공진 곡선에 대해 잘 선택된 SL 전력값(도 5E,F):1)은 공진 곡선에서 상당한 kEX 기여도를 가지며(선택된 SL 전력 값은 도 5C 및 도 5G로표시됨). 2) 오프 공명 곡선이 적어도 3SL 전력 값으로 측정되기 때문에 선택한 SL 전력 값은 kEX 기여와 함께 공진 곡선의 영역에 분산되어야 합니다. 3) Laguerre 장착 후 비 플랫 R2+ REX 곡선으로 리드(예를 들어, 그림 5D: SL 강점 25, 50, 75 Hz; 그림 5E).
공진 곡선에 대해 잘못 선택된 SL 전력값(그림 5E,F)은Laguerre 장착 후 평평한 R2+ REX 곡선으로 이어집니다. 도 5E에 도 5E에예가 표시되며, 여기서 100Hz 오프 공명 곡선은 매우 평평하므로 Δω에대한 중요한 정보를 제공하지 않습니다.
회전프레임 핵 과로이저 효과(ROE) 아티팩트에 대한 징후: 1) 오프 공명 곡선으로부터 얻은 Δω은 공간 부근/양성자에서 양성자의 화학적 변화와 일치하며, 이는 핵 과다저 효과 분광법(NOESY) 스펙트럼에 대한 관심의 피크와 교차 피크를 보여줍니다. (예를들어, 도 5I는 빠른 중간 교환에 대한 예상대로 광범위한 오프 공명 곡선을 보여 주지만 곡선은 -3000 Hz 및 +1500 Hz에서 와 같은선명한 기능을 가지고 있습니다. 이들은 다른 conformer에서이 H8에 대 한 화학 변화 보다는 ROE 유물 때문에 매우 가능성이 높습니다.) 2) Laguerre 적합은 작동하지만, 잘 작동하지 않습니다 (높은 오류 또는 물리적으로 불가능한 값을 제공) 온 공명및 적어도 3 오프 공명 곡선, 지수가 높은 SINO (>20)와 실험에서 얻은 경우에도(예를 들어, kEX = 43,502 ± 38,478 Hz). 종종 각 SL은 개별적으로 잘 맞지만 함께 피팅하면 훨씬 더 높은 오류가 발생합니다. 반대 동작은 진정한 흥분 상태에 대한 것으로 예상된다.
"true" 교환 Δω: 1) 오프 공명 곡선에서 얻은 Δω은 NOESY 스펙트럼에 대한 관심의 피크와 교차 피크를 보여주는 공간 부근/양성자에서 양성자의 화학적 변화와 일치하지 않는다(예: 그림 5E). 2) Laguerre 적합은 공진에 대한 낮은 오류를 제공하고 적어도 3 오프 공명 곡선(예를 들어, 그림 5E 대. 그림 5I, 적합 결과에 대한 캡션 참조).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> 그림 3: T7 탠덤 IVT 및 RNase H 분열 반응에 의한 샘플 생산. (A)탠덤 IVT 및 RNase H 분열의 긍정적이고 부정적인 결과의 소중 한 페이지. 사다리 높이는 RNA 참조를 지칭하며, 12*는 키메라 골짜기 가이드를 지칭한다. 레인 1: 20nt 표적 RNA의 성공적인 생성. 더 짧고 긴 제품이 거의 없습니다. 레인 2a: 탠덤 성적증명서의 불완전한 분열. HPLC 정화가 가능하지만 많은 물질이 낭비될 것입니다. 레인 2b: 레인 2의 지속적인 RNase H 골짜기는 HPLC 주입에 대비한 깨끗한 샘플을 생성합니다(레인 1과 동일). 레인 4: RNase H 분열은 크게 실패했고, 대상 대역은 생산되지 않았다. 전체 길이 탠덤 성적 증명서는 여전히 600 nt에서 볼 수 있습니다. 레인 5: 대상 밴드가 제작되었지만 강력한 -1 밴드가 존재합니다. HPLC를 수행 할 수 있지만 측면 제품을 신중하게 제거해야합니다. (B)성공적인 HPLC 주입의 예. 38분피크는 표적 길이의 순수 RNA를 포함하고, 더 길고 짧은 제품은 표적 RNA로부터 잘 분리된다. 패널 B가 21에서수정되었습니다. 약어: IVT = 시험관 내 전사; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; nt = 뉴클레오티드; AU = 임의 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> 도 4: RNA 헤어핀의 예(파란색) 및 후(빨강) NMR에서 접는 단계 2.4(프로토콜 참조) (A)이미노 영역의 1H-1D 스펙트럼의 A-라벨22-mer RNA. imino 신호의 기본 쌍 ID에 대한 예상 영역은 아래 회색으로 표시됩니다. (B)패널 A로부터 RNA의 방향족 공명의 1H,13C-HSQC 스펙트럼. 접힌 후 샘플(빨간색)은 예상대로 4개의 신호를 나타내고, 접기 전 샘플(파란색)은 3개의 신호만 표시합니다. (C)22-메르 RNA의 맥접기 예측은 헤어핀으로서. 5개의 imino 신호는 패널 A.(D)22-mer RNA에 의해 형성된 호모디머의 두 샘플 모두에서 발견될 수 있는 이 이차 구조로부터 기대되어야 하며, 그 결과 헤어핀 구조와 동일한 5개의 염기 쌍을 초래한다. 약어: NMR = 핵 자기 공명; 1D = 1차원; HSQC = 이종핵 단일 양자 상관관계; ppm = 백만 개당 부품. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> 그림 5: RNA 헤어핀을 기반으로 두 개의 서로 다른 구문에 대한 1H R1θ RD 대표 결과. (A)왼쪽 컬럼은 불룩한 U 위에 C-G 베이스 쌍을 가진 RNA상에 얻어진 결과를 나타내고, 오른쪽 컬럼은 베이스 쌍이 대신 G-C로 전환된 샘플에서 얻은 결과를 나타낸다. (B)및(F)두 구문에 대해 A4H8에 대해 얻은 평평한 분산 프로파일을 나타내며, 이는 변형 교환이 없음을 나타낸다. (C–E)G-C(G-C) 구조에서 G6에 대해 얻은 공진, 오프 공명 및 장착된 데이터를 표시한다. Laguerre 적합은 다음 결과로 이어진다: R1 = 2.87 ± 0.01 Hz, R2 = 7.76 ± 0.03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0.31 ± 0.03 %, Δω = 112 ± 4Hz(G–I)에 공명, 오프-재온( G-z) 및 G6-s에 대한 G6 의 인벤션을 나타낸다. Laguerre 적합은 다음과 같은 결과로 이어진다: R1 = 1.93 ± 0.02 Hz, R2 = 6.71 ± 0.86 Hz, kEX = 43,502 ± 38,478 Hz, pES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. 이 그림은 20에서수정되었습니다. 약어: SL = 스핀 잠금. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

우리는 13C/ 15N 라벨 및 1 H R1θ 이완 분산 핵 자기 공명 (NMR) 분광기로 표시되지 않은 RNA에 마이크로 밀리초 역학을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 초점은 NMR 실험의 고순도 샘플 준비 및 설정에 있습니다.

RNA의 1 H R 1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

이 프로토콜은 RNA 분자에서 확인 교환을 검사하기 위해 양성자 R1rho 이완 분산 측정을 위한 RNA 샘플 준비 및 NMR 설정을 설명합니다. 양성자를 프로브하기 때문에 이 방법은 동위원소 라벨링이 필요하지 않으며 직접 이동된 베이스 페어링과 같은 구조적 기능에 액세스할 수 있습니다. 피펫은 시료가 다른 방법으로 제조되더라도 R1rho 이완 분산을 측정할 수 있다는 점에서 매우 모듈식입니다.플라스미드 샘플을 준비하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 체외 전사 및 분열 반응을 설정하여 시작합니다. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양하십시오. 그런 다음 로딩 용액에서 샘플 10배의 마이크로리터 1개를 희석시 희석합니다.그리고 데니링 PAGE 젤에 마이크로리터 1개를 실행합니다. 분열 반응이 성공하면 원하는 볼륨에 대한 반응을 조정하여 하룻밤 동안 실행합니다. 그런 다음 또 다른 데니스팅 PAGE 젤을 실행하고 분열 반응이 완료되었는지 여부를 평가합니다.불완전한 골짜기의 경우, 종래의 전자레인지에서 반응 용액을 450와트로 15초 동안 가열합니다. 그런 다음 RNA와 분열 가이드를 다시 음상하기 위해 40 분 동안 용액을 섭씨 37도로 천천히 식힙니다. 그리고 새로운 침전물의 형성에 유의하십시오.무기 파이로포스파타제와 RNase H.Incubate를 섭씨 37도에서 1~3시간 동안 추가합니다. 그런 다음 부인 페이지와 분열 반응의 완료를 확인합니다. RNase H 분열 반응이 완료되면, 50 밀리머 최종 농도에 EDTA를 추가하여 반응을 담금질.그리고 철저하게 소용돌이. 0.2 미크론 주사기 필터를 통해 용액을 필터링합니다. 그리고 정화를 위해 HPLC 시스템에 주입 가능한 볼륨에 용액을 농축한다.NMR 튜브에 농축 및 정제 된 샘플을 추가하기 전에 풍부한 물로 씻어 튜브를 청소하십시오. 그런 다음 RNase 오염 시약, 물 및 95 %에탄올을 제거합니다. 물로 마지막 헹구면 말리십시오.플런저를 물로 헹구고 보풀이 없는 닦기를 사용하여 RNase 제염 시약및 95%에탄올로 청소하십시오. 튜브와 플런저를 건조한 후 NMR 샘플에 10%D2O를 추가합니다. 큰 파이펫 팁을 사용하여 RNA 샘플을 NMR 튜브로 전송하여 튜브 벽의 측면을 따라 흐릅니다.플런저를 튜브에 삽입하여 빠른 비틀기 동작으로 굴착기를 아래로 밀어 기포를 제거한 다음 플런저를 천천히 당겨 새로운 기포를 만들지 않고 천천히 당깁니다. 그리고 파라핀 왁스 필름으로 고정하십시오. RNA 할당을 위해 완전히 표지된 RNA 샘플에 사용되는 방향족 양성자 탄소 HSQC 데이터 집합을 기반으로 새 데이터 집합을 만듭니다.일반 매개 변수 및 RD 별 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 테스트를 위해 양성자 스핀 잠금 전력을 1.2 킬로헤르츠로 설정합니다. 하나의 항목, 0 밀리초, TDF1을 하나로 설정하고 D30을 업데이트하여 테스트 스펙트럼을 실행하도록 테스트 VD 목록을 생성합니다.테스트 vd 목록을 설정한 후 D30 및 TDF1을 업데이트합니다. 그리고 다른 스핀 잠금 길이에 대한 피크의 강도를 플롯. 원래 피크의 강도가 1/3으로 감소하는 스핀 잠금 길이를 식별합니다.테스트 실행의 결과에서 실험에 사용할 최종 VD 목록을 만듭니다. 목록의 가장 약한 피크에 최소 10의 신호 대 잡음 비율이 있도록 검사 수를 선택합니다. 탠덤 성적증명서의 여러 골짜기 반응의 결과는 여기에 표시됩니다.20개의 뉴클레오티드 표적 RNA가 성공적인 반응에서 생성되었다. 실패한 반응은 샘플의 불완전하고 실패한 절단을 초래했습니다. RNA 샘플의 HPLC 주사는 38분에서 순수 표적 RNA에 대한 피크를 밝혀냈습니다.더 길고 짧은 제품은 관심의 절정에서 잘 분리되었지만. RNA 헤어핀의 분석은 관찰된 이미노 양성자의 수가 이차 구조 시뮬레이션에서 예상되는 이미노 양성자의 수와 일치하는 것으로 나타났다. RNA의 방향족 공명의 양성자 탄소 HSQC 스펙트럼은 접힌 후 4개의 신호를 보였다.그리고 접기 전에 세 개의 신호. 두 개의 다른 H8 원자와 두 개의 다른 합성 RNA 헤어핀에 대해 얻은 공명 곡선에 대한 대표에서, G6H8은 확인 교환을 경험한다. A4H8은 그렇지 않지만.G6H8의 경우 컬러 스핀 잠금 능력이 선택되고 공진 데이터가 기록되었습니다. 교환이 느린 CG 구조에서 R1rho 행 값과 오프셋 플롯은 이미 곡선의 약간의 비대칭을 표시하여 화학 적 변화 차이 델타 오메가의 표시를 나타냅니다. R1 기여도가 제거되는 R2 플러스 REX 플롯에서 더욱 명백해집니다.한편, GC 구조는 더 빠른 교환을 경험하고 R1rho 값과 오프셋 플롯은 R2 플러스 REX 플롯에서도 델타 오메가의 추출이 덜 분명해지는 더 넓은 곡선을 제시했습니다. 일단 RNA 역학이 해명되면, 국가는 특징과 갇혀 있을 수 있습니다. 이러한 갇힌 상태는 예를 들어 생물학적 검사에서 테스트할 수 있습니다.이 방법을 통해 활성 microRNA miRNA 복합체에서 기능적이고 관련기식 페어링 교대, 리보소말 RNA의 루프 리플렉트 및 단일 뉴클레오티드 불룩의 기본 쌍 안정성을 관찰할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

연구

생화학

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 Μs-ms 타임스케일에 단백질 형성 역학의 조사를 위한 N CPMG 이완 분산

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...