Vi takker proteinvitenskapsanlegget (PSF) ved Karolinska Institutet for uttrykk og rensing av T7 RNA polymerase og E. coli RNase H, Martin Hällberg for den sjenerøse gaven til den uorganiske fosfatase, og hele Petzoldlab for verdifulle diskusjoner. Vi takker Luca Retattino for utarbeidelsen av U-bulge-konstruksjonene og Emilie Steiner og Carolina Fontana for deres bidrag til makroer og passende manus. Vi anerkjenner Karolinska Institutet og Institutt for medisinsk biokjemi og biofysikk for støtte til kjøp av et 600 MHz spektrometer og posisjonsfinansiering (KI FoAss og KID 2-3707/2013). Vi er takknemlige for økonomiske bidrag fra Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 og FFL15-0178) og Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS20).140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 og 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 og M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. anerkjenner finansiering gjennom en Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF prosjektnr. 747446).

K.P. er konsulent for Arrakis Therapeutics, et selskap som oppdager små molekyler rettet mot RNA.

Protokollen som presenteres her er en syntese av flere protokoller publisert tidligere i form av forskningsartikler10,20,21,31. Derfor kan segmenter av protokollen brukes, mens andre kan byttes til leserens preferanse. For eksempel kan R1ρ-målingene utføres på en RNA-prøve produsert med hvilken som helst metode, gitt at folding og homogenitet av lengde antas. Protokollen inneholder heller ikke informasjon om resonanstilordning av RNA-sekvensen - et trinn som kreves for RD-eksperimenter - da dette har blitt dekket mye i tidligere litteratur19,37,38. Delvise, segmentelle eller stedsspesifikke merkingsordninger36,41,42,43,44 er tilnærminger for å lette resonanstilordning eller redusere overlappingen av resonanser som er av interesse for RD-eksperimenter og har blitt beskrevet i lengden i litteraturen. Denne metoden tillater bruk av ensartet merking av enhver nukleotididentitet, noe som allerede kan forenkle resonansoppdrag betydelig.
IVT-metoden som presenteres her, overvinner kjente problemer med sekvenser og merking, øker utbyttet og reduserer kostnader og arbeidstid sammenlignet med andre metoder. Bruken av den virale initieringssekvensen reduserer behovet for reaksjonsoptimalisering, noe som er et kjent problem i feltet som kan være tidkrevende å utføre og gir bare få kopier av transkripsjonen i tilfelle ikke-G-initiering. T7 IVT- og RNase H-spaltingen av tandemutskriften kan utføres samtidig i samme fartøy. Et mønster av multimeriske tandem repetisjoner kan ses på en denaturing PAGE gel under reaksjonen, som samles til et enkelt bånd på målet RNA etter ferdigstillelse av RNase H reaksjon (Figur 3A, baner 1 og 2b). Typiske utbytter ved bruk av denne metoden varierer mellom 30 og 70 nmol RNA per 1 ml IVT. Likevel kommer metoden basert på RNase H-spalting av tandem-repetisjoner ikke uten visse egne problemer. RNase H spalting reaksjonen går ofte ikke til ferdigstillelse når den kjøres samtidig med T7 transkripsjon (Figur 3A, lane 2a).
Separasjonen av tandemenheter kan fullføres ved å gløde spaltningsguiden til transkripsjonen og legge til mer RNase H (Figur 3A, bane 2b, trinn 2.1.2). Ettersom oppvarming av store volumer er treg og fører til Mg2+katalysert hydrolyse av RNA, ble det brukt en konvensjonell mikrobølgeovn, som varmer prøven til >95 °C i 10-15 s. Bivirkninger på de produserte prøvene er ikke observert så langt. Noen konstruksjoner viser et mindre andre bånd som ikke kunne elimineres ved optimalisering av reaksjonsforholdene (Figur 3A, bane 4). Vanligvis er disse ganske tydelig synlige som en skulder i HPLC-kromatogrammet, hvis en godt optimalisert elutiongradient brukes, og kan fjernes (trinn 2.2.5). Følgende diskusjon tar sikte på å fremheve kritiske trinn i protokollen, spesielt med hensyn til å skaffe data av høy kvalitet som tillater tolkning av konformasjonsdynamikk.
RNase forurensning Ekstracellulære RNases er allestedsnærværende, svært stabile og utgjør den største trusselen for langsiktig stabilitet av NMR-prøver. Derfor er det avgjørende å jobbe i et RNase-fritt miljø og holde alle reagenser og plastvarer RNase-fri. Bruk av filtertips og kanskje til og med ansiktsmasker anbefales. Dette er spesielt viktig etter HPLC-rensing. NMR-prøver kontaminert med RNases viser vanligvis smale topper som er synlige i 1H-1D-spektra etter dager eller uker på grunn av enkeltkjernede nedbrytningsprodukter. En slik prøve er ikke egnet for R1ρ-målinger. 
NMR-prøve På grunn av sin høyt ladede natur kan RNA brukes i høye konsentrasjoner uten nedbør sammenlignet med de fleste proteiner. Bruken av Shigemi NMR-rør (se materialtabellen) er fordelaktig, da de tillater sentrering av den svært konsentrerte prøven i midten av spolen, samtidig som den gir ideelle shimming- og låseforhold på grunn av følsomhetstilpasset glassbunn og stempel. På denne måten reduseres B1-inhomogeneity, noe som gir opphav til smalere linjer. Det typiske prøvevolumet i et NMR-rør er 250 μL, og typisk konsentrasjon er 1-2 mM. Prøver under 500 μM anbefales ikke for RD-eksperimenter, da eksperimentet vil ta for lang tid og en god shim. På samme måte anbefales ikke prøvevolum under 200 μL fordi det kreves god avstandsskive og feltstabilitet (lås). Når du setter inn stempelet, er det viktig å unngå dannelse av bobler i prøven (trinn 2.4.5). Hvis stempelet ikke er riktig festet, kan det gli ned i prøven og redusere det påvisbare volumet. Videre kan raske temperaturendringer føre til dannelse av nye bobler i prøven. Det bør derfor utvises forsiktighet ved transport av prøven og ved endring av sondetemperaturen i NMR-spektrometeret. Kontroller prøven for bobler når du måler igjen etter en lengre periode.
RNA folding Dynamiske RNA-molekyler kan eksistere i flere konformasjoner når de ikke brettes riktig. Selv om smeltetemperaturer på sekundære konstruksjoner bare kan være litt over romtemperatur, anbefales en grundig oppvarmings- og snap-kjøleprosedyre før måling. Høyt konsentrerte hårnålsprøver som brettes under kinetisk kontroll (oppvarming og snap-kjøling) kan danne homodimere over tid, noe som krever streng kontroll av RNA-folding før hver NMR-måling. Hvis den målte RNA ikke er en hårnålsstruktur, men en RNA-dupleks, bør langsom folding under termodynamisk kontroll påføres.
I dette tilfellet bør kjøleprosessen etter oppvarming være i løpet av timer, mens RNA brukes ved sitt endelige volum og konsentrasjon i NMR-prøven. En innledende telling av forventede imino- og aromatiske resonanser kan gi innsikt i homogeniteten til prøven. Hvis prøven ikke ser ut som forventet, bør den brettes på nytt. Mg2+ (tilsatt som kloridsalt) kan hjelpe med å brette RNA-strukturer45. I praksis fungerer foldekontrollen som en sammenligning med et utvalg som i det minste delvis har blitt brukt til å tildele NMR-resonansene og løse den sekundære strukturen eksperimentelt.
Hensyn til spinnlås og oppvarming Ved kjøring av 1H R1ρ RD-eksperimenter som 2D-oversiktseksperimenter, bør SL-effekten ikke være lavere enn 1,2 kHz. Radiofrekvensen for senderen skal plasseres midt i ppm-området av toppene av interesse(f.eks.7,5 ppm for aromatiske protoner). Båndbredden på 1,2 kHz vil da være stor nok til å spinne disse protonene uten noen store off-resonanseffekter. Slike effekter kan identifiseres i RD-profilen. Hvis de oppstår, øker R2+REX-verdiene i stedet for reduksjon med økende SL-kraftverdier, spesielt for lav SL-effekt. Kontroller om de beregnede SL-strømverdiene tilsvarer strømmen som leveres til prøven. I praksis kan beregnet SL-effekt brukes hvis den 1H 90° harde pulsen ble kalibrert nøye på nyere spektrometre; Dette kan imidlertid kontrolleres ved å kalibrere SL-strøm for hver ønsket båndbredde.
Utvalget av SL-effekt, som kan brukes i 1H R1ρ RD-eksperimenter, er svært bredt, noe som fører til varierende prøveoppvarming (1,2 kHz til 15 kHz for HSQC for HCP-baserte sekvenser og 50 Hz til 15 kHz for SELOPE-eksperimenter). Ulik prøveoppvarming kan påvises som en liten endring i kjemisk skift når man sammenligner 1D-er oppnådd for laveffekts SLs vs. høyeffekts SLs. Denne effekten vurderes vanligvis ikke i varmekompensasjoner i R1ρ eksperimenter på heteronuclei. Varmekompensasjon i disse eksperimentene er vanligvis satt opp for å korrigere for forskjellig oppvarming på grunn av de forskjellige spinnlåsvarighetene som er angitt i vd-listen over hver spinnlåseffektserie. Spesielt for SELOPE-eksperimentet bør en ekstra varmekompensasjon brukes på tvers av alle påførte SL-styrker som beskrevet i20.
vd-liste hensyn Som nevnt tidligere, bør vd-listen inneholde et tidspunkt lenge nok til å oppnå et betydelig forfall av intensitet (ideelt sett ned til 30% av det første signalet, eller så lavt som mulig hvis det ikke er mulig å nå et 70% forfall innenfor sondens spesifikasjoner). Selv om vd-listen ble optimalisert for en lav SL-effekt (1,2 kHz), bør denne vd-listen også testes med den høyeste SL-effekten som skal brukes (f.eks.15 kHz). Dette skyldes det faktum at for topper med betydelig REX-bidrag, vil forfallet være mye tregere ved høy SL-kraft. Så et tilstrekkelig forfall bør også verifiseres ved høy SL-kraft. Det samme må vurderes for forfall ved høye offsets i off-resonans eksperimenter. Det ideelle maksimale tidspunktet til vd-listen kan være betydelig forskjellig for de forskjellige områdene i dispersjonseksperimentet. I så fall kan flere poeng inkluderes i vd-listen, og de lengre vd-listepunktene for høyere SL-kraft eller høyere forskyvninger under analyse, basert på den lave SINO de vil føre til, kan kastes. Generelt bør 5-8 vd listepunkter vurderes å kunne oppdage potensielle gjenstander som fører til ikke-eksponentielle forfall som J-kobling (se nedenfor).
1D-HCP-selektivitetshensyn Det må utvises spesiell forsiktighet ved kjøring av den HCP-baserte 1D-versjonen hvis det er en annen topp som overlapper med toppen av interesse for 1H-dimensjonen til det 2D HSQC-baserte eksperimentet. HCP-baserte overføringer er veldig, men aldri 100% selektive, og det kan derfor skje at en annen topp bidrar til intensiteten og forfallsadferden til toppen av interesse i 1D. En indikasjon på dette vil være en forskjell i R1ρ-verdier oppnådd på resonans ved hjelp av 1D- og 2D-versjonene av det merkede eksperimentet.
ROE-hensyn: For off-resonanskurver av atomer med langsom mellomliggende utveksling, kan ROE-gjenstander identifiseres basert på en sammenligning av den oppnådde Δω med et NOESY- eller ROESY-spektrum. Hvis en krysstopp kan identifiseres ved en kjemisk skiftforskjell som tilsvarer Δω, kan den observerte spente tilstanden faktisk være en ROE-artefakt (f.eks.ROE ble funnet mellom aromatiske protoner, som alle er i samme kjemiske skiftområde og derfor dekket av de off-resonanskurvene20). Av erfaring førte dette alltid til dårlige passformer med store feil, muligens på grunn av at ROE ikke fulgte samme mønster som REX med økende SL-kraft. Situasjonen blir vanskeligere for mellom-rask utveksling. Mens resonanskurven er (fra sammenligning med 13C-data innhentet på nabokjernen) fortsatt representativ for utvekslingsprosessen mellom GS og ES, påvirkes off-resonanskurven av flere ROE-gjenstander.
I så fall er SL-kraften til å oppdage utvekslingsprosessen større (>1,5 kHz) og spenner derfor over et større antall protoner når off-resonanskurver spenner over kjemiske skiftforskjeller mellom ulike ROE-kandidater (for H8 ville disse være: aminoprotoner på ca. ± 1000 Hz, H5/H1 er på ca. -1200 Hz, imino protoner på ca. 3500 Hz). Så langt er det ikke funnet noen metode for å undertrykke disse ROE-gjenstandene (annet enn å bruke delvis deuterte nukleotider46), og off-resonansdata bør ikke registreres for rask mellomliggende utveksling, da ingen pålitelig informasjon om den faktiske Δω kan trekkes ut med denne metoden, hvis NOE / ROE-bidrag ikke kan utelukkes via NOESY-spektra.
J-Kobling (Hartmann-Hahn) hensyn Selv om resonanskurver for homonukleære J-koblede protoner, som H6, ble registrert10,20, må det tas særlig hensyn til off-resonansmålinger, spesielt for lav SL-effekt, da Hartmann-Hahn matchende forhold kan strekke seg over et bredt spekter av de undersøkte forskyvningene. Hartmann-Hahn-gjenstander kan identifiseres som svingninger på eksponentiell forfall eller økende R2+REX-verdier med økende SL-styrker i RD-plott på resonans20.

RNAer utfører en rekke regulatoriske1, katalytiske2og strukturelle3-funksjoner i cellen, hvorav mange er korrelert med en fleksibel molekylær struktur og intrikate endringer i disse strukturene4,5,6,7. Lavbefolkede tilstander forblir usynlige for de fleste metoder for strukturbestemmelse eller tillater ikke studiet av disse skjulte tilstandene ved høy atomoppløsning. Løsningstilstand kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi kombinerer begge aspekter ved å gi tilgang til individuelle atomkjerner, samt tilby en stor verktøykasse med eksperimenter rettet mot dynamikk gjennom alle tidsregimer8. RD NMR-eksperimenter gir tilgang til konformasjonsutveksling i mellomliggende tidsskala, der endringer i basisparingsmønstre og lokale strukturelle omorganiseringer kan forventes5,9,10,11,12,13,14. RD-eksperimenter utføres så lange R2-målinger i form av et Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulstog15 eller som avslapningsmålinger i den roterende rammen, kalt R1ρ RD-eksperimenter16.
Selv om begge kan brukes til å trekke ut populasjon av og valutakurs og kjemisk skiftforskjell til mindre tilstand, gir R1ρ RD-eksperimenter også tegn på den kjemiske skiftforskjellen i den begeistrede tilstanden. Dette tillater en inferens på sekundær struktur, som sterkt korrelerer med kjemisk skifte i RNA-strukturer17. Det kjemiske skiftet er en god indikator på helikitet når det gjelder aromatiske protoner og karboner på nukleobasene, av baseparingspartnere for iminoprotoner, og av sukkerpuckere på C4' og C1' atomer18,19. Det skal bemerkes at nylig et kjemisk utvekslingsmetningsoverføringseksperiment (CEST) ved hjelp av høyere spinnlås (SL) -kraft, og dermed skiftet anvendbarheten av CEST-eksperimentet til raskere utvekslingstidsskalaer, ble publisert som et alternativ til R1ρ RD-eksperimentet for systemer med en spent tilstand.
Selv om 13C og 15N isotoper ofte har blitt brukt til å få tilgang til strukturell utveksling, brukte nyere arbeid fra dette laboratoriet aromatiske og imino protoner som sonder for konformasjonsutveksling9,10. Bruken av 1H som observert kjerne gir flere fordeler, for eksempel tilgang til utveksling på raskere og langsommere tidsskalaer, høyere følsomhet og kortere måletider. Dette forenkles ytterligere av SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE)-tilnærmingen, som gir tilgang til aromatiske protoner gjennom derowding av det endimensjonale (1D) spekteret ved hjelp av homonukleære skalarkoblinger, i stedet for en heteronukleær magnetiseringsoverføring, og eliminerer behovet for isotopetiketter20. Denne protokollen tar for seg målingen i 1H R1ρ RD-eksperimenter med jevnt 13C/15N-merkede og umerkede prøver. Derfor presenterer dette dokumentet en prøveforberedelsesmetode som ble funnet å være den mest allsidige for forskjellige prøveforberedelsesbehov21 og diskuterer alternativer i den siste delen av denne artikkelen (Figur 1).
På dette tidspunktet bør leseren merke seg at andre prøveforberedelsesteknikker er akseptable for 1H R1ρ RD-eksperimenter, og at andre metoder for strukturell og funksjonell analyse kan utføres med prøvene syntetisert med den presenterte teknikken. 1 H R1ρ RD-eksperimenter krever høye RNA-konsentrasjoner (ideelt >1 mM) samt høy homogenitet, både i RNA-lengde og strukturell konformasjon for å sikre pålitelig karakterisering av molekylær dynamikk. In vitro transkripsjon (IVT) er den valgte metoden for mange forskere å produsere 13C /15N-merkede RNA-prøver på grunn av tilgjengeligheten av merkede nukleoside triphosfater (NTPs) og facile inkorporering i den enzymatiske reaksjonen22. Imidlertid lider den mye brukte T7 RNA-polymerase (T7RNAP)23,24,25 av lav 5 ' homogenitet i tilfelle visse initieringssekvenser26,27 og ofte også 3 ' homogenitet under transkripsjon avrenning28. Rensing av målet RNA-arter blir dyrere og arbeidskrevende på grunn av behovet for store mengder ~ 200 nmol. Metoden som brukes her har blitt presentert tidligere der fordeler ble diskutert på store21. Kort sagt løser den beskrevne problemer ved å transkribere en større tandemutskrift som deretter er spesielt spaltet av Escherichia coli RNase H, styrt av et chimerisk oligonukleotid29,30 (se figur 2 for detaljer).
Inkorporering av en avstandssekvens i de 5' og 3' endene av tandemutskriften tillater bruk av en høy avkastning initiering sekvens og fjerning av terminaloverheng nær lineariseringsstedet til henholdsvis plasmidmalen (Figur 2B). Metoden ble vist å forbedre utbyttet betydelig, samtidig som kostnadene og arbeidskraften reduseres, med forbehold om en mer kompleks malsyntese og behovet for et ekstra enzym og oligonukleotid. Den høye spesifisiteten til RNase H-spalting letter rensing på grunn av mangel på RNA-arter i et lignende størrelsesområde. Den nåværende protokollen bruker en ionutveksling høyytelses flytende kromatografi (HPLC) trinn som har blitt publisert av dette laboratoriet nylig31, selv om andre metoder er mulige alternativer. 1 H R1ρ RD kan generelt anskaffes på merkede eller umerkede prøver med to respektive pulssekvenser, det "merkede" 1H R1ρ heteronuclear single quantum correlation (HSQC)-basert eksperiment med en 13C indirekte dimensjon10 og det "unlabeled" 1H R1ρ SELOPE-basert eksperiment med en 1H indirekte dimensjon20. 
Disse todimensjonale (2D) eksperimentene kan fungere som en første sjekk, uavhengig av om dynamikken på R1ρ-tidsskalaen er til stede i eksemplet. En oversikt over RD for alle løste topper i spektra kan oppnås, og topper av interesse for en grundigere RD-analyse kan identifiseres. Dette betyr at selv umerkede prøver kan kontrolleres før en beslutning om å produsere en dyrere, merket prøve blir tatt. Når en topp med konformasjonsutvekslingsbidrag er valgt ut til å bli studert grundigere, er det best å bytte til 1D-versjonene av de ovennevnte eksperimentene (hvis toppen fortsatt kan løses) for å utføre såkalte off-resonanseksperimenter. For den merkede versjonen erstattes HSQC-overføringen til 13C med et selektivt heteronukleært krysspolariseringstrinn (HCP) som brukes i 13C R1ρ-eksperimenter 32,33,34,35, mens når det gjelder SELOPE-eksperimentet, kjøres eksperimentet ganske enkelt som en 1D, noe som er spesielt nyttig for H8- og H2-signaler som ligger på diagonalen i 2D uansett. Et kriterium for hvilken sekvens som skal brukes, forutsatt at både et merket og umerket utvalg er tilgjengelig, er hvor godt isolert toppen av interessen er i de to eksperimentene.
Generelt anbefales SELOPE-eksperimentet for RNA-prøver på opptil 50 nukleotider. For større RNAer blir overlappingen større. Imidlertid vises strukturelt interessante nukleotider ofte i kjemiske skiftregioner som er mindre overlappende og fortsatt kan være tilgjengelige i enda større RNAer. Et annet argument ville være at i umerkede prøver oppstår ingen J-kobling mellom 1H og 12C. Men ettersom den minste spinnlåskraften er definert av minimumskraften som brukes til å koble fra de to spinnene (~ 1 kHz) i det merkede eksperimentet, tillater det umerkede eksperimentet bruk av et bredere spekter av spinnlåsstyrker (SL) og derfor tilgang til en bredere utvekslingstid. Disse off-resonanseksperimentene gir tilleggsinformasjon til kex, for eksempel populasjonen av den begeistrede tilstanden (alternativ konform), pES, samt svært verdifull kjemisk skiftinformasjon i form av Δω (den kjemiske skiftforskjellen i bakketilstanden og den begeistrede tilstanden).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Figur 1: Arbeidsflyten til den presenterte protokollen. Forberedelse før selve storskala prøveproduksjon, bestående av malforberedelse og bekreftelse av vellykket in vitro transkripsjon og RNase H spalting. Storskala produksjon inkludert HPLC-rensing, fylling av NMR-rør og bekreftelse av RNA-folding. Ved isotopmerket syntese bør det utføres en umerket rensing for gradientoptimalisering samme dag. NMR karakterisering av konformasjonsdynamikk med R1ρ eksperimenter. Hvert trinn kan utføres uavhengig, for eksempel at 1H R1ρ RD-analysen kan brukes på alle egnede RNA-prøver som produseres med en annen metode. Forkortelser: IVT = in vitro transkripsjon; HPLC = høy ytelse flytende kromatografi; NMR = kjernemagnetisk resonans; RD = avslapping dispersjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Målet med denne protokollen er å gi praktiske detaljer og kritiske parametere for studiet av konformasjonsdynamikk med 1H R1ρ avslapningsdispersjon i RNA-hårnålsmolekyler. Etter å ha gitt en detaljert protokoll for design, syntese og ionutveksling HPLC-rensing av et mål RNA som kan utføres ved hjelp av alle, noen eller ingen NTPer som 13C /15N-merkede versjoner, er arbeidsflyten for å fullføre NMR-prøven og bekrefte samsvarsutvekslingen med NMR-spektroskopi blitt beskrevet. Til slutt beskrives detaljene for oppsettet av 1H R1ρ RD-eksperimenter på et Bruker NMR-spektrometer (Figur 1). Protokollen gir hvert trinn for å konfigurere 1D-versjonen for merkede eksempler og tilleggskommentarer, og en tabell som skal justeres for oppsettet av SELOPE-versjonen (Tabell 2). Etter protokollen diskuteres kritiske trinn og alternative ruter til prøvepreparering og 1H R1ρ RD-oppsett.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA er en svært fleksibel biomolekyl, hvor endringer i strukturer spiller avgjørende roller i funksjonene som RNA-molekyler utfører som cellulære budbringere og modulatorer. Mens disse dynamiske tilstandene forblir skjult for de fleste strukturelle metoder, tillater R1ρ avslapningsspredning (RD) spektroskopi studiet av konformasjonsdynamikk i mikro- til millisekundregimet ved atomoppløsning. Bruken av 1H som observert kjerne utvider ytterligere tidsregimet dekket og gir direkte tilgang til hydrogenbindinger og baseparing.
De utfordrende trinnene i en slik studie er høy renhet og høy avkastning prøvepreparering, potensielt 13C- og 15N-merket, samt oppsett av eksperimenter og montering av data for å trekke ut befolkning, valutakurs og sekundær struktur av den tidligere usynlige tilstanden. Denne protokollen gir viktige praktiske trinn i prøvepreparering for å sikre utarbeidelse av en passende RNA-prøve og oppsett av 1H R1ρ-eksperimenter med både isotopisk merkede og umerkede RNA-prøver.

Protokollen for RNA-produksjon letter rensing gjennom generering av transkripsjoner med høy renhet. Figur 3A viser resultatene av flere spaltingsreaksjoner av tandemutskrifter, noe som gir både vellykkede og mislykkede reaksjoner. Lane 1 viser det optimale tilfellet av en fullstendig spaltet transkripsjon med bare svake spor av sideprodukter. Lane 2a viser ufullstendig spalting, som kan løses ved å re-annealing og tillegg av mer RNase H (Lane 2b, trinn 2.1.2). RNA-konstruksjonene av baner 1, 2a og 2b er de samme. Prøven i bane 3 viser mislykket spalting. Feilsøking av denne reaksjonen vil innebære en kontroll av spaltingsguidesekvensen, renheten til DNA-malen og glødetemperaturen. Potensielt må RNase H-spalting utføres etter T7 IVT som vist for prøve 2.
Prøven i bane 4 viser en betydelig mengde spaltingssideprodukter, som er vanskelige å fjerne via ionbytte HPLC. Feilsøking av en slik prøve kan innebære (a) senketemperatur, mengde RNase H eller reaksjonstid, (b) redusere elutiongradient og injeksjonsvolum og forsøke å skille målfraksjonene fra sideproduktene. Ytterligere informasjon om hvordan du øker oppløsningen i ionbytte HPLC rensing har blitt diskutert av Karlsson et al.31. HPLC skiller målet RNA fra lengre eller kortere nukleinsyrer og protein eller småmolekyler. Figur 3B viser det optimale resultatet for ionbyttet HPLC-rensing. Elution gradient bør velges slik at målet RNA arter elutes minst ett kolonnevolum (i dette eksemplet: 35 ml) etter neste mindre arter og en kolonne volum før neste større arter.
Mindre arter i denne metoden inkluderer enkelt nukleotider, abortive produkter (8-12 nt), 3' og 5' spacer sekvenser (5-14 nt), og spalting guide (12 nt chimeric nucleic acid), mens lengre sekvenser er potensielt urent tandem repetisjoner og plasmid. Når en godt separert elutionstopp oppnås, kan rensing skaleres opp til tilsvarende ~ 20 ml IVT-reaksjon per injeksjon. Riktig fold av en RNA-prøve er avgjørende for RD-eksperimenter og må bekreftes før hver måling. Figur 4 viser en A-merket 22-mer RNA før foldeprotokollen i trinn 2.4 (blå) ble påført, og den samme prøven etter at riktig folding er oppnådd (rød). En Mc-Fold sekundær struktur prediksjon (Figur 4C) foreslår den presenterte hårnål strukturen med 4 basepar som resulterer i 5 imino signaler.
Begge spektraene i figur 4A bekrefter disse predikerte signalene, om enn med litt forskjellige relative intensiteter, noe som indikerer at en eller annen feilfoldet struktur (her en dimer) kan være problematisk å vurdere med bare 1H 1D-spektra. Et aromatisk 1H,13C-HSQC-spektrum (figur 4B), viser imidlertid bare 3 av de aromatiske signalene for prøven før foldeprotokollen (blå), men alle 4 signalene for prøven som er brettet i henhold til trinn 2.4 (rød). Prøven vist i blått dannet sannsynligvis en homodimer (struktur foreslått i figur 4D) som ville resultere i de samme iminosignalene som hårnålen. Signalet til A13H2 virker utvekslingsforse utvidet. Disse resultatene bidrar til å markere viktigheten av å brette bekreftelse med både imino- og aromatiske fingeravtrykkseksperimenter før hvert RD-eksperiment. 1H R1ρ pulssekvenser beskrevet i denne protokollen tillater deteksjon av dynamikken i mellomutvekslingsregimet. I utgangspunktet registreres en resonanskurve, og hvis dynamikken er til stede for en bestemt rest, er en dispersjon synlig innenfor de oppnådde R2+REX-verdiene, mens denne kurven er flat for rester uten utveksling.
Figur 5 viser representative resonanskurver oppnådd for to forskjellige H8-atomer i en syntetisk RNA-hårnål (figur 5A), der G6H8 opplever utveksling (Figur 5C), mens A4H8 ikke gjør det (Figur 5B). Siden utvekslingen er relativt langsom i denne prøven (kEX = 292 ± 40 Hz), ble fordelen med SELOPE-eksperimentet for å oppnå lave SL-styrker utnyttet, og de to resonanskurvene ble registrert ved hjelp av 1D-versjonen av pulssekvensen. Den samme pulssekvensen ble deretter brukt til å innhente off-resonansdata for restene som viste spredning i on-resonansprofilen. Figur 5D viser de oppnådde R1ρ -verdiene i forhold til forskyvningen, der en liten asymmetri av kurven allerede angir tegnet for Δω.
Dette blir enda tydeligere i R2+REX-plottet der R1-bidraget fjernes ( Figur5E). Høyre kolonne i samme figur viser representative resonanskurver oppnådd for to forskjellige H8-atomer i en litt annen syntetisk RNA-hårnål med raskere utveksling, der G6H8 opplever utveksling (Figur 5G), mens A4H8 ikke gjør det (Figur 5F). Den raskere valutakursen (kEX = 43 502 ± 38 478 Hz) tillot RD-registrering av alle aromatiske protoner samtidig ved hjelp av SELOPE 2D-versjonen for å få både on- og off-resonansdata (G6H8-data vist i figur 5H, I).
Generelle identifikatorer for positive og negative resultater Positive resultater i tandem IVT og RNase H spalting kan identifiseres som følger: 1) Målbåndet er det sterkeste båndet i denaturering PAGE gel. 2) Det er ingen eller bare svake bånd rundt hovedbåndet. 3) Det er ingen eller bare svake høyere molekylvektarter. 4) HPLC-kromatogrammet viser en godt separert topp av målet RNA. 5) Når hovedtoppen er samplet, vises bare ett bånd på en denaturing PAGE gel.
Negative resultater i tandem IVT og RNase H spalting til stede som følger: 1) Nei eller bare et svakt hovedbånd er synlig på en denaturing PAGE gel. 2) Et mønster av arter med høy molekylvekt fra RNA tandem repetisjoner er synlig. 3) Selv om hovedbåndet er til stede, er bånd med lignende intensitet over eller under hovedbåndet i ± 3 nt.
En godt brettet prøve kan identifiseres som følger: 1) Antall observerte iminoprotoner samsvarer med antall iminoprotoner som forventesfra en sekundær struktursimulering (f.eks. 2) Syn G-U wobble basepar i en UUCG sløyfe (hvis til stede) er synlig ved ~ 9.5 ppm, noen ganger bare synlig ved lavere temperatur. Ytterligere fingeravtrykk av UUCG-løkken er beskrevet av Fürtig og kolleger40. 3) Det aromatiske fingeravtrykket er enig med en tidligere tildelt prøve som er bekreftet å brettes riktig (Figur 4C).
En feilfoldet eller degradert prøve kan identifiseres som følger: 1) Det er flere iminosignaler enn en sekundær struktursimulering forutsier (MERK: færre iminosignaler innebærer ikke nødvendigvis feilfolding, da lukkebasepar ofte ikke er synlige, og konformasjonsutveksling utvider linjer). 2) Fravær av iminosignaler. 3) Smale signaler med høy intensitet i den aromatiske regionen, noe som indikerer enkelt nukleotidforringelsesprodukter. 4) Divergens mellom imino- eller aromatiske signaler til en referanseprøve av bekreftet folding (Figur 4C).
Et atom som ikke viser noen utveksling i den påvisbare tidsskalaen kan identifiseres som følger: 1) fra en flat RD-profil (på grunn av det manglende REX-bidraget som varierer med den påførte SL-effekten) (Figur 5B og Figur 5F). 2) Det må tas hensyn til tilfelle av langsom mellomliggende utveksling når kEX og Δω er av samme størrelsesorden. I så fall kan resonansbidraget være svært lite som det fremgår av figur 5C (i dette tilfellet er de monterte parametrene kEX = 292 ± 40 Hz og Δω = 112 ± 4 Hz). Hvis du er i tvil, kan en lav SL off-resonanskurve registreres for verifisering.
Et atom som viser utveksling i mellomtidsskalaen kan identifiseres 1) fra en ikke-flat avslapningsdispersjonsprofil i et RD-eksperiment på resonans (figur 5B og figur 5F); 2) en bredere linewidth i HSQC- eller SELOPE-eksperimentet kan også være en indikator for utveksling.
Godt valgte SL-kraftverdier for off-resonanskurver (Figur 5E,F): 1) har et betydelig kEX-bidrag i resonanskurven (utvalgte SL-kraftverdier er angitt i figur 5C og figur 5G). 2) Når off-resonanskurver måles for minst 3 SL-kraftverdier, bør de valgte SL-kraftverdiene spres ut over regionen av on-resonanskurven med kEX-bidrag. 3) Føre til ikke-flate R2+REX-kurver etter Laguerre-passformen (f.eks. Figur 5E).
Dårlig valgte SL-strømverdier for off-resonanskurver (Figur 5E,F) fører til flate R2+REX-kurver etter laguerre-passformen. Et eksempel vises i Figur 5E, der 100 Hz off-resonanskurven er svært flat og derfor ikke gir betydelig informasjon om Δω.
Indikasjoner for roterende ramme kjernefysiske Overhauser effekt (ROE) gjenstander: 1) Δω oppnådd fra off resonans kurver matche kjemiske skift av protoner i romlig nærhet / protoner, som viser en krysstopp med toppen av interesse for kjernefysisk Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) spektrum. (f.eks., figur 5I viser brede off-resonanskurver som forventet for rask mellomliggende utveksling, men kurvene har også skarpere funksjoner, for eksempelved -3000 Hz og +1500 Hz. Disse er svært sannsynlig på grunn av en ROE artefakt i stedet for et kjemisk skifte for denne H8 i en annen konform). 2) Laguerre passform fungerer, men fungerer ikke bra (gir høye feil eller fysisk umulige verdier) for en on-resonans og minst 3 off-resonans kurver, selv om eksponentielle ble oppnådd fra eksperimenter med høy SINO (>20) (f.eks., kEX = 43,502 ± 38,478 Hz). Ofte passer hver SL individuelt godt, men å montere dem sammen gir en mye høyere feil; Den motsatte virkemåten forventes for en sann opphisset tilstand.
Indikasjoner for "sann" utveksling Δω: 1) Δω oppnådd fra off-resonanskurver samsvarer ikke med kjemiske skift av protoner i romlig nærhet / protoner, som viser en krysstopp med toppen av interesse for NOESY-spekteret (f.eks. 2) Laguerre-passform gir lave feil for en resonans og minst 3 off-resonanskurver(f.eks. Figur 5I, se bildetekst for å få best mulig resultat).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Figur 3: Prøveproduksjon av T7 tandem IVT og RNase H spalting reaksjon. (A) Denaturing PAGE av positive og negative resultater av tandem IVT og RNase H spalting. Stigehøyde refererer til RNA-referanser, 12* refererer til den chimeriske spaltingsguiden. Lane 1: Vellykket generasjon av en 20 nt mål RNA. Få kortere og lengre produkter er til stede. Lane 2a: Ufullstendig spalting av tandemutskriften. Selv om HPLC-rensing er mulig, vil mye materiale være bortkastet. Lane 2b: Fortsatt RNase H spalting av Lane 2 produserer en ren prøve klar for HPLC injeksjon (identisk med Lane 1). Lane 4: RNase H spalting var stort sett mislykket, og ingen målbånd ble produsert. Tandemutskriften i full lengde er fortsatt synlig på 600 nt. Lane 5: Et målbånd ble produsert, men et sterkt -1-bånd er til stede. Selv om HPLC kan utføres, er det nødvendig med forsiktig fjerning av sideproduktet. (B) Eksempel på en vellykket HPLC-injeksjon. Toppen på 38 min inneholder ren RNA av mållengden, mens lengre og kortere produkter er godt skilt fra målet RNA. Panel B er endret fra 21. Forkortelser: IVT = in vitro transkripsjon; HPLC = høy ytelse flytende kromatografi; nt = nukleotider; AU = vilkårlige enheter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Figur 4: Eksempel på en RNA-hårnål før (blå) og etter (rød) foldetrinnet 2.4 (se protokoll) i NMR. (A) Imino-regionen i et 1H-1D-spektrum av en A-merket 22-mer RNA. Forventede regioner for basisparidentitet av iminosignaler er angitt i grått nedenfor. (B) 1H,13C-HSQC spektrum av aromatiske resonanser av RNA fra panel A. Prøven etter folding (rød) viser 4 signaler som forventet, mens prøven før folding (blå) bare viser 3 signaler. (C) Mc-Fold prediksjon av 22-mer RNA som en hårnål. Fem iminosignaler er å forvente fra denne sekundære strukturen, som finnes i begge prøvene i panel A. (D) Foreslått struktur av en homodimer dannet av 22-mer RNA, noe som resulterer i de samme 5 baseparene som hårnålstrukturen. Forkortelser: NMR = kjernemagnetisk resonans; 1D = endimensjonal; HSQC = heteronukleær enkelt kvantekorrelasjon; ppm = deler per million. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Figur 5: 1H R1ρ RD representative resultater for to forskjellige konstruksjoner basert på en RNA-hårnål. (A) Den venstre kolonnen viser resultater oppnådd på RNA med et C-G-basispar over den buede U, mens den høyre kolonnen viser resultater oppnådd på et utvalg der basisparet ble byttet til G-C i stedet. (B) og (F) viser flate dispersjonsprofiler som oppnådd for A4H8 for de to konstruksjonene, noe som indikerer ingen konformasjonsutveksling. (C–E) viser resonans, off-resonans og monterte data innhentet for G6 i (G-C)-konstruksjonen. Laguerre-passformen fører til følgende resultat: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) viser resonans, off-resonans og monterte data innhentet for G6 i (G-C)-konstruksjonen. Laguerre-passformen fører til følgende resultat: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43 502 ± 38 478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Dette tallet ble endret fra 20. Forkortelse: SL = spinnlås. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Vi presenterer en protokoll for å måle mikro- til millisekunddynamikk på 13C /15N-merket og umerket RNA med 1H R1ρ avslapningsdispersjon kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Fokuset i denne protokollen ligger i prøvepreparering og oppsett av NMR-eksperimenter med høy renhet.

Praktiske aspekter ved prøvepreparering og oppsett av 1H R1ρ avslapningsspredningsforsøk av RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Denne protokollen beskriver RNA prøvepreparering og NMR-oppsett for proton R1rho avslapningsdispersjonsmålinger for å undersøke konfirmasjonsutveksling i RNA-molekyler. Siden protoner er undersøkt, trenger ikke metoden isotopisk merking og kan få tilgang til strukturelle funksjoner som forskjøvet baseparing direkte. Pipetten er ganske modulær i den forstand at R1rho avslapningsdispersjon kan måles selv om prøven er produsert med en annen metode.Begynn med å forberede plasmidprøven og sette opp en in vitro transkripsjon og spaltingsreaksjon som beskrevet i tekstmanuskriptet. Inkuber reaksjonen ved 37 grader Celsius i en time. Fortynn deretter en mikroliter av prøven ti ganger i lasteløsning.Og kjør en mikroliter på en denaturing PAGE gel. Hvis spaltingsreaksjonen er vellykket, skalerer du reaksjonen til ønsket volum og kjører den over natten. Kjør deretter en annen denaturing PAGE gel og vurder om spaltingsreaksjonen er fullført.Ved ufullstendig spalting, varme reaksjonsløsningen i en konvensjonell mikrobølgeovn på 450 watt i 15 sekunder. Avkjøl deretter løsningen sakte til 37 grader Celsius i 40 minutter for å reanneal RNA og spaltingsguiden. Og legg merke til dannelsen av et nytt bunnfall.Tilsett mer uorganisk pyrofosfatase og RNase H.Incubate reaksjonen i en til tre timer ved 37 grader Celsius. Bekreft deretter fullføringen av spaltingsreaksjonen med denaturing PAGE. Når RNase H spalting reaksjonen er fullført, slukke reaksjonen ved å legge EDTA til en 50 millimolar endelig konsentrasjon.Og virvel grundig. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,2 mikron sprøytefilter. Og konsentrer løsningen til et volum som kan injiseres i et HPLC-system for rensing.Før du tilsetter den konsentrerte og rensede prøven på NMR-røret, rengjør du røret ved å skylle med rikelig vann. Deretter RNase dekontamineringsreagens, vann og 95% etanol. Etter den endelige skyllingen med vann, la den tørke.Skyll stempelet med vann og bruk en lofri klut til å rengjøre med RNase dekontamineringsreagens og 95% etanol. Etter tørking av røret og stempelet, tilsett 10% D2O i NMR-prøven. Bruk en stor pipettespiss til å overføre RNA-prøven til NMR-røret og strømme den langs siden av rørveggen.Sett stempelet inn i røret ved å skyve det ned med en rask vridningsbevegelse for å fjerne luftbobler, og trekk stempelet sakte opp uten å skape nye luftbobler. Og fikse det med parafinvoksfilm. Lag et nytt datasett basert på et aromatisk protonkarbon HSQC-datasett som brukes på fullt merkede RNA-prøver for RNA-oppdrag.Angi de generelle parameterne og RD-spesifikke parametere. Sett deretter proton spinnlåskraft til 1,2 kilohertz for testing. Generer en test vd-liste med bare én oppføring, null millisekunder, sett TDF1 til én og oppdater D30 for å kjøre et testspekter.Når du har konfigurert en test vd-liste, oppdaterer du D30 og TDF1. Og plott intensiteten av toppen for forskjellige spinnlåslengder. Identifiser lengden på spinnlåsen der intensiteten til den opprinnelige toppen reduseres til en tredjedel.Fra resultatet av testkjøringene oppretter du den endelige vd-listen som skal brukes i eksperimentet. Velg antall skanninger slik at den svakeste toppen på listen har et signal-til-støy-forhold på minst 10. Resultatene av flere spaltingsreaksjoner av tandemutskrifter vises her.Et 20 nukleotidmål RNA ble generert i en vellykket reaksjon. Mislykkede reaksjoner resulterte i ufullstendig og mislykket spalting av prøven. HPLC-injeksjon av RNA-prøven avslørte en topp for rent mål RNA på 38 minutter.Mens lengre og kortere produkter var godt skilt fra toppen av interessen. Analyse av RNA-hårnålen viste at antall observerte iminoprotoner samsvarte med antall iminoprotoner som forventes fra en sekundær struktursimulering. Protonkarbon HSQC-spekteret av de aromatiske resonansene til RNA viste fire signaler etter folding.Og bare tre signaler før folding. I representanten for resonanskurver oppnådd for to forskjellige H8-atomer og to forskjellige syntetiske RNA-hårnåler, opplever G6H8 konfirmasjonsutveksling. Mens A4H8 ikke gjør det.For G6H8 ble de fargede spinnlåskreftene valgt og av resonansdata ble registrert. I CG-konstruksjonen der utvekslingen er treg, viste R1rho-radverdiene kontra offsetplottet allerede en liten asymmetri av kurven, noe som indikerer tegn på kjemisk skiftforskjell delta omega. Dette blir enda tydeligere i R2 pluss REX-tomten der R1-bidraget fjernes.På den annen side opplever GC-konstruksjonen raskere utveksling, og R1rho-verdiene versus offset-plottet presenterte en bredere kurve der utvinningen av delta omega blir mindre åpenbar selv i R2 pluss REX-plottet. Når RNA-dynamikken er belyst, kan statene karakteriseres og fanges. Disse fanget statene kan for eksempel testes i biologiske analyser.Denne metoden lar oss observere funksjonelle, relevante baseparskift i et aktivt microRNA miRNA-kompleks, sløyfe omorganiseringer i ribosomal RNA, og baseparstabilitet på på enkle nukleotidbulger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG avslapning dispersjon for undersøkelse av protein konformasjonsdynamikk på μs-ms tidsskala

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Prøvepreparering og relativ kvantrasjon ved bruk av reduktiv metylering av aminer for peptidomikkstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Prøvepreparering ved hjelp av en Lipid Monolayer-metode for elektronkrystallografiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Paramagnetisk avslapningsforbedring for å oppdage og karakterisere selvforeninger av iboende uordnede proteiner

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...