Agradecemos à instalação de ciência de proteínas (PSF) do Instituto Karolinska pela expressão e purificação da polimerase T7 RNA e E. coli RNase H, Martin Hällberg pelo generoso dom da fosfatase inorgânica, e de todo o Petzoldlab para discussões valiosas. Agradecemos a Luca Retattino pela preparação das construções u-bulge e Emilie Steiner e Carolina Fontana por sua contribuição às macros e roteiros adequados. Reconhecemos o Instituto Karolinska e o Departamento de Bioquímica Médica e Biofísica pelo apoio à compra de um espectrômetro de 600 MHz e financiamento de posições (KI FoAss e KID 2-3707/2013). Somos gratos pela contribuição financeira de Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 e FFL15-0178) e The Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Gretason Stiftelse (M91-14), Harald och Gretas JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 e 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 e M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. reconhece financiamento através de uma Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, Projeto MSCA-IF nº 747446).

K.P. é consultor da Arrakis Therapeutics, uma empresa que descobre pequenas moléculas voltadas para o RNA.

O protocolo aqui apresentado é uma síntese de diversos protocolos publicados anteriormente na forma dos artigos de pesquisa10,20,21,31. Assim, segmentos do protocolo podem ser aplicados, enquanto outros podem ser trocados à preferência do leitor. Por exemplo, as medidas R1ρ podem ser realizadas em uma amostra de RNA produzida com qualquer método, dado que a dobra e a homogeneidade do comprimento são assumidas. Além disso, o protocolo não contém informações sobre a atribuição de ressonância da sequência de RNA - uma etapa necessária para experimentos RD - uma vez que isso foi extensivamente coberto na literatura anterior19,37,38. Esquemas de rotulagem parciais, segmentais ou específicos do local36,41,42,43,44 são abordagens para facilitar a atribuição de ressonância ou reduzir a sobreposição de ressonâncias que são de interesse em experimentos de RD e foram descritas longamente na literatura. Este método permite o uso de rotulagem uniforme de qualquer identidade nucleotídea, que já pode simplificar significativamente a atribuição de ressonância.
O método IVT aqui apresentado supera questões conhecidas com sequências e rotulagem, aumenta o rendimento e diminui o custo e o tempo de trabalho em comparação com outros métodos. O uso da sequência de iniciação viral reduz a necessidade de otimização da reação, que é um problema conhecido no campo que pode ser demorado para realizar e rende apenas algumas cópias da transcrição no caso de iniciação não-G. O decote T7 IVT e RNase H da transcrição tandem pode ser realizado simultaneamente no mesmo vaso. Um padrão de repetições multiméricas de tandem pode ser visto em um gel PAGE desnaturing durante a reação, que se une a uma única banda no RNA alvo após a conclusão da reação RNase H(Figura 3A,faixas 1 e 2b). Os rendimentos típicos usando este método variam entre 30 e 70 nmol RNA por 1 mL IVT. No entanto, o método baseado no decote RNase H de repetições tandem não vem sem certos problemas próprios. A reação de decote RNase H muitas vezes não vai para a conclusão quando executada simultaneamente com transcrição T7(Figura 3A, faixa 2a).
A separação das unidades tandem pode ser finalizada com a ressarção do guia de decotes à transcrição e adicionando mais RNase H (Figura 3A, faixa 2b, passo 2.1.2). Como o aquecimento de grandes volumes é lento e leva à hidrólise catalisada mg2+de RNA, foi utilizado um forno de micro-ondas convencional, que aquece a amostra para >95 °C em 10-15 s. Os efeitos adversos nas amostras produzidas não foram observados até agora. Algumas construções mostram uma pequena segunda banda que não poderia ser eliminada pela otimização das condições de reação (Figura 3A, faixa 4). Geralmente estes são claramente visíveis como um ombro no cromatógrafo HPLC, se um gradiente de elução bem otimizado for usado, e pode ser removido (passo 2.2.5). A discussão a seguir tem como objetivo destacar etapas críticas no protocolo, especificamente no que diz respeito à obtenção de dados de alta qualidade que permitam uma interpretação da dinâmica conformacional.
Contaminação rnase As RNases extracelulares são onipresentes, altamente estáveis e representam a maior ameaça para a estabilidade a longo prazo das amostras de RMR. Portanto, é crucial trabalhar em um ambiente livre de RNase e manter todos os reagentes e plásticos livres de RNase. Recomenda-se o uso de dicas de filtro e talvez até máscaras faciais. Isso é especificamente importante após a purificação do HPLC. Amostras de RMR contaminadas com RNases normalmente exibem picos estreitos visíveis em espectros de 1H-1D após dias ou semanas devido a produtos de degradação de nucleotídeos únicos. Tal amostra não é adequada para medições R1ρ. 
Amostra de NMR Devido à sua natureza altamente carregada, o RNA pode ser usado em altas concentrações sem precipitação quando comparado com a maioria das proteínas. O uso de tubos De Ressonância Magnética Shigemi (ver a Tabela de Materiais) é vantajoso, pois permitem o centro da amostra altamente concentrada no centro da bobina, ao mesmo tempo em que fornecem condições ideais de shimming e locking devido ao fundo de vidro e êmbolo compatível com suscetibilidade. Dessa forma, a B1-inhomogeneidade é reduzida, dando origem a linhas mais estreitas. O volume típico da amostra em um tubo NMR é de 250 μL, e a concentração típica é de 1-2 mM. Amostras abaixo de 500 μM não são recomendadas para experimentos rd, pois o experimento levaria muito tempo e um bom calço. Da mesma forma, o volume amostral abaixo de 200 μL não é recomendado porque é necessário um bom calço e estabilidade de campo (bloqueio). Ao inserir o êmbolo, é crucial evitar a formação de bolhas na amostra (etapa 2.4.5). Se não for fixado corretamente, o êmbolo pode deslizar para baixo na amostra, reduzindo o volume detectável. Além disso, mudanças rápidas na temperatura podem levar à formação de novas bolhas na amostra. Portanto, deve-se tomar cuidado ao transportar a amostra e ao alterar a temperatura da sonda no espectrômetro NMR. Verifique se há bolhas na amostra ao medir novamente após um período mais longo.
Dobramento de RNA Moléculas dinâmicas de RNA podem existir em múltiplas conformações quando não dobradas corretamente. Embora as temperaturas de fusão das estruturas secundárias possam ser apenas ligeiramente acima da temperatura ambiente, um procedimento de aquecimento e resfriamento completo é recomendado antes da medição. Amostras de grampos altamente concentradas dobrando sob controle cinético (aquecimento e resfriamento) podem formar homodimers ao longo do tempo, o que requer um controle rigoroso da dobra de RNA antes de cada medição de RMR. Se o RNA medido não for uma estrutura de grampos, mas um duplex RNA, deve ser aplicado dobramento lento sob controle termodinâmico.
Neste caso, o processo de resfriamento após o aquecimento deve estar na faixa de horas, enquanto o RNA é usado em seu volume final e concentração na amostra de RMN. Uma contagem inicial de ressonâncias iminos e aromáticas esperadas pode fornecer insights sobre a homogeneidade da amostra. Se a amostra não parecer esperada, deve ser re-dobrada. Mg2+ (adicionado como sal de cloreto) pode ajudar com estruturas de RNA dobráveis45. Na prática, o controle dobrável serve como comparação com uma amostra que tem sido usada para pelo menos atribuir parcialmente as ressonâncias NMR e resolver a estrutura secundária experimentalmente.
Considerações de potência de bloqueio de giro e aquecimento No caso de executar os experimentos 1H R1ρ RD como experimentos de visão geral 2D, a energia SL não deve ser inferior a 1,2 kHz. A frequência do transmissor de radiofrequência deve ser colocada no meio da região ppm dos picos de interesse (por exemplo,7,5 ppm para prótons aromáticos). A largura de banda de 1,2 kHz será então grande o suficiente para travar esses prótons sem grandes efeitos de ressonância. Tais efeitos podem ser identificados no perfil RD. Se ocorrerem, os valores R2+REX aumentam em vez de diminuir com o aumento dos valores de potência SL, especialmente para baixo poder SL. Verifique se os valores de alimentação SL calculados correspondem à potência fornecida à amostra. Na prática, a potência SL calculada pode ser usada se o pulso rígido de 1H 90° for calibrado cuidadosamente em espectrômetros mais novos; no entanto, isso pode ser verificado calibrando a potência SL para cada largura de banda desejada.
A gama de energia SL, que pode ser usada em experimentos rd de 1H R1ρ é muito ampla, levando a um aquecimento amostral variado (1,2 kHz a 15 kHz para HSQC para sequências baseadas em HCP e 50 Hz a 15 kHz para experimentos SELOPE). O aquecimento desigual da amostra pode ser detectado como uma pequena mudança na mudança química ao comparar 1Ds obtidos para SLs de baixa potência vs. SLs de alta potência. Esse efeito geralmente não é considerado em compensações térmicas em experimentos R1ρ em heteronucleos. A compensação de calor nesses experimentos é geralmente configurada para corrigir para diferentes aquecimentos devido às diferentes durações de bloqueio de giro especificadas na lista vd de cada série de potência de bloqueio de spin. Especialmente para o experimento SELOPE, uma compensação de segundo calor deve ser usada em todos os pontos fortes SL aplicados, conforme descrito em20.
considerações da lista vd Como mencionado anteriormente, a lista vd deve conter um ponto de tempo tempo suficiente para obter uma decadência significativa de intensidade (idealmente até 30% do sinal inicial, ou o mais baixo possível se não for possível alcançar uma decadência de 70% dentro das especificações da sonda). Embora a lista vd tenha sido otimizada para uma baixa potência SL (1,2 kHz), esta lista vd também deve ser testada na maior potência SL a ser usada (por exemplo,15 kHz). Isso se deve ao fato de que, para picos com contribuição significativa de REX, a decadência será muito mais lenta na alta potência de SL. Assim, uma decadência suficiente também deve ser verificada em alta potência SL. O mesmo deve ser considerado para decaimentos em altas compensações em experimentos fora da ressonância. O ponto de tempo máximo ideal da lista vd poderia ser significativamente diferente para as diferentes regiões do experimento de dispersão. Nesse caso, mais pontos poderiam ser incluídos na lista vd, e os pontos de lista vd mais longos para maior potência SL ou compensações mais altas durante a análise, com base no baixo SINO que eles levarão, poderiam ser descartados. Em geral, os pontos de lista de 5-8 vd devem ser considerados capazes de detectar artefatos potenciais que levam a decaimentos não exponenciais, como o acoplamento J (veja abaixo).
1D- Consideraçõesde seletividade do HCP Deve-se tomar cuidado especial ao executar a versão 1D baseada em HCP se houver outro pico sobreposto com o pico de interesse na dimensão 1H do experimento baseado em HSQC 2D. As transferências baseadas em HCP são muito, mas nunca 100% seletivas, e, portanto, pode acontecer que outro pico contribua para a intensidade e o comportamento de decadência do pico de interesse no 1D. Uma indicação para isso seria uma diferença nos valores de ressonância R1ρ obtidos utilizando as versões 1D e 2D do experimento rotulado.
Considerações do ROE: Para curvas fora de ressonância de átomos com câmbio lento-intermediário, os artefatos ROE podem ser identificados com base em uma comparação do Δω obtido com um espectro NOESY ou ROESY. Se um pico cruzado pode ser identificado em uma diferença de mudança química correspondente a Δω, então o estado animado observado pode de fato ser um artefato ROE (por exemplo,ROEs foram encontrados entre prótons aromáticos, que estão todos na mesma faixa de mudança química e, portanto, cobertos por aquelas curvas fora de ressonância20). Pela experiência, isso sempre levou a ataques ruins com grandes erros, possivelmente devido ao ROE não seguir o mesmo padrão que o REX com o aumento do poder SL. A situação se torna mais difícil para a troca intermediária-rápida. Enquanto a curva de ressonância (a partir da comparação com os dados de 13C obtidos no núcleo vizinho) ainda representa o processo de troca entre o GS e o ES, a curva de ressonância fora é influenciada por múltiplos artefatos roe.
Nesse caso, a potência SL para detectar o processo de troca é maior (>1,5 kHz) e, portanto, abrange um número maior de prótons à medida que as curvas de ressonância off-resonance se estendem sobre as diferenças de mudança química de vários candidatos ao ROE (para H8 estes seriam: amino protons na ca. ±1000 Hz, H5/H1's em ca. -1200 Hz, imino prótons em cerca de 3500 Hz). Até agora, nenhum método foi encontrado para suprimir esses artefatos roe (além do uso de nucleotídeos parcialmente deutados46), e dados fora da ressonância não devem ser registrados para troca rápida-intermediária, pois nenhuma informação confiável sobre o Δω real pode ser extraída com este método, se a contribuição NOE/ROE não puder ser excluída através de espectros NOESY.
J-Acoplamento (Hartmann-Hahn) considerações Embora as curvas de ressonância para prótons homonucleares acoplados a J, como H6, tenham sido registradas com sucesso10,20, cuidados especiais devem ser tomados para medições fora da ressonância, especialmente para baixo poder SL, pois as condições de correspondência Hartmann-Hahn podem abranger uma ampla gama de deslocamentos investigados. Os artefatos hartmann-hahn podem ser identificados como oscilações na decadência exponencial ou aumento dos valores R2+REX com o aumento dos pontos fortes SL nas parcelas RD de ressonância20.

As RNAs realizam uma infinidade de funções regulatórias1,catalítica2e estrutural3 na célula, muitas das quais estão correlacionadas a uma estrutura molecular flexível e mudanças intrincadas dessas estruturas4,5,6,7. Estados pouco populosos permanecem invisíveis para a maioria dos métodos de determinação da estrutura ou não permitem o estudo desses estados ocultos em alta resolução atômica. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) combina ambos os aspectos, fornecendo acesso a núcleos atômicos individuais, bem como oferecendo uma grande caixa de ferramentas de experimentos visando dinâmicas através de todos os regimes de tempo8. Os experimentos de RD NMR fornecem acesso à troca conformacional na escala de tempo intermediária, onde podem ser esperadas alterações nos padrões de emparelhamento de base e rearranjos estruturais locais5,9,10,11,12,13,14. Os experimentos RD são realizados como medidas longas R2 na forma de um trem de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill15 ou como medidas de relaxamento no quadro rotativo, chamado R1ρ RD experimentos16.
Embora ambos possam ser usados para extrair diferença populacional e cambial e de mudança química para o estado menor, os experimentos R1ρ RD também dão o sinal da diferença de mudança química do estado animado. Isso permite uma inferência sobre a estrutura secundária, que se correlaciona fortemente com a mudança química nas estruturas de RNA17. A mudança química é um bom indicador de helicidade no caso de prótons aromáticos e carbonos nas nucleobases, de parceiros de emparelhamento de base para prótons imino, e de discos de açúcar nos átomos C4' eC1' 18,19. Deve-se notar que recentemente um experimento de transferência de saturação de câmbio químico (CEST) usando maior potência de bloqueio de giro (SL), mudando assim a aplicabilidade do experimento CEST para escalas de tempo de câmbio mais rápidas, foi publicado como uma alternativa ao experimento R1ρ RD para sistemas com um estado animado.
Embora os isótopos de 13C e 15N tenham sido frequentemente usados para acessar a troca estrutural, trabalhos recentes deste laboratório usaram prótons aromáticos e iminos como sondas para troca conformacional9,10. O uso de 1H como núcleo observado traz várias vantagens, por exemplo, acesso à troca em escalas de tempo mais rápidas e lentas, maior sensibilidade e tempos de medição mais curtos. Isso é facilitado ainda pela abordagem SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), proporcionando acesso a prótons aromáticos através da despovoamento do espectro unidimensional (1D) utilizando acoplamentos escalares homonucleares, em vez de uma transferência de magnetização heteronuclear, e eliminando a necessidade de rótulos de isótopos20. Este protocolo aborda a medição em experimentos RD de 1H R1ρ de amostras uniformemente rotuladase sem rótulosN. Portanto, este artigo apresenta um método de preparação amostral que foi considerado o mais versátil para diferentes necessidades de preparação amostral21 e discute alternativas na última seção deste artigo (Figura 1).
Neste ponto, o leitor deve observar que outras técnicas de preparação da amostra são aceitáveis para experimentos rd de 1H R1ρ, e que outros métodos de análise estrutural e funcional podem ser realizados com as amostras sintetizadas com a técnica apresentada. 1 Os experimentos H R1ρ RD requerem altas concentrações de RNA (idealmente >1 mM) bem como alta homogeneidade, tanto no comprimento do RNA quanto na conformação estrutural para garantir uma caracterização confiável da dinâmica molecular. A transcrição in vitro (IVT) é o método de escolha para muitos pesquisadores produzirem amostras de RNA com 13C/15N rotulados devido à disponibilidade de triptosfatos nucleosídeos rotulados (NTPs) e incorporação fácil na reação enzimática22. No entanto, a polimerase T7 RNA amplamente utilizada (T7RNAP)23,24,25 sofre de baixa homogeneidade de 5' no caso de certas sequências de iniciação26,27 e muitas vezes também 3' homogeneidade durante o escoamento de transcrição28. A purificação das espécies de RNA alvo torna-se mais cara e trabalhosa devido à necessidade de grandes quantidades de ~200 nmol. O método aqui utilizado foi apresentado anteriormente onde as vantagens foram discutidas em geral21. Resumindo, ele resolve os problemas descritos transcrevendo uma transcrição em tandem maior que é então especificamente cortada por Escherichia coli RNase H, guiada por um oligonucleotídeoquimérico 29,30 (ver Figura 2 para detalhes).
A incorporação de uma sequência espaçadora nas extremidades de 5' e 3' da transcrição tandem permite o uso de uma sequência de iniciação de alto rendimento e remoção de saliências terminais próximas ao local de linearização do modelo plasmídeo, respectivamente (Figura 2B). O método mostrou-se para melhorar significativamente os rendimentos, ao mesmo tempo em que reduz o custo e a mão-de-obra, com a ressalva de uma síntese de modelo mais complexa e a necessidade de uma enzima adicional e oligonucleotídeo. A alta especificidade do decote RNase H facilita a purificação devido à falta de espécies de RNA em uma faixa de tamanho semelhante. O presente protocolo utiliza uma etapa de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de intercâmbio de íons que foi publicada por este laboratório recentemente31,embora outros métodos sejam alternativas possíveis. 1 H R1ρ RD pode, em geral, ser adquirido em amostras rotuladas ou não com duas respectivas sequências de pulso, o experimento "rotulado" 1H R1ρ heteronuclear single correlação (HSQC)-based experimento com uma dimensão indireta de 13C10 e o "unlabeled" 1H R1ρPE-based experimento com uma dimensão indireta 20H .
Esses experimentos bidimensionais (2D) podem servir como uma primeira verificação, independentemente de a dinâmica na escala de tempo R1ρ estar presente na amostra. Uma visão geral do RD para todos os picos resolvidos nos espectros pode ser obtida, e picos de interesse para uma análise rd mais completa podem ser identificados. Isso significa que mesmo amostras não rotuladas podem ser verificadas antes da decisão de produzir uma amostra mais cara e rotulada. Uma vez que um pico com contribuição de troca conformacional é selecionado para ser estudado mais detalhadamente, é melhor mudar para as versões 1D dos experimentos acima (se o pico ainda pode ser resolvido) para realizar os chamados experimentos fora de ressonância. Para a versão rotulada, a transferência do HSQC para 13C é substituída por um passo seletivo de polarização cruzada heteronuclear (HCP) como usado em experimentos 13C R1ρ 32,33,34,35, enquanto no caso do experimento SELOPE, o experimento é simplesmente executado como um 1D, o que é especialmente útil para sinais H8 e H2 que estão deitados na diagonal no 2D de qualquer maneira. Um critério sobre qual sequência de uso, desde que tanto, uma amostra rotulada e não rotulada estejam disponíveis, é o quão bem isolado o pico de interesse está nos dois experimentos.
Em geral, recomenda-se o experimento SELOPE para amostras de RNA de até 50 nucleotídeos. Para rnas maiores, a sobreposição será maior; no entanto, nucleotídeos estruturalmente interessantes frequentemente aparecem em regiões de mudança química que são menos sobrepostas e ainda podem ser acessíveis em RNAs ainda maiores. Outro argumento seria que, em amostras sem rótulo, nenhum acoplamento J ocorre entre 1H e 12C. No entanto, como o poder mínimo de bloqueio de rotação é definido pela potência mínima usada para desacoplar esses dois giros (~1 kHz) no experimento rotulado, o experimento sem rótulo permite o uso de uma gama mais ampla de pontos fortes de bloqueio de giro (SL) e, portanto, acesso a uma escala de tempo mais ampla de troca. Esses experimentos de ressonância extra fornecem informações adicionais para kex, como população do estado animado (conformr alternativo), pES, bem como informações de mudança química muito valiosas na forma de Δω (a diferença de mudança química do estado terrestre e do estado animado).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo apresentado. Preparação antes da produção real de amostras em larga escala, consistindo na preparação do modelo e confirmação da transcrição in vitro bem sucedida e do decote RNase H. Produção em larga escala, incluindo purificação hplc, enchimento do tubo NMR e confirmação de dobramento de RNA. Em caso de síntese rotulada por isótopos, deve ser realizada uma purificação sem rótulo para otimização de gradiente no mesmo dia. Caracterização nMR da dinâmica conformacional com experimentos R1ρ. Cada etapa pode ser realizada de forma independente, por exemplo,a análise RD de 1H R1ρ pode ser aplicada a qualquer amostra de RNA adequada produzida com outro método. Abreviaturas: IVT = transcrição in vitro; HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho; NMR = ressonância magnética nuclear; RD = dispersão de relaxamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O objetivo deste protocolo é fornecer detalhes práticos e parâmetros críticos para o estudo da dinâmica conformacional com dispersão de relaxamento de 1H R1ρ em moléculas de grampos de RNA. Depois de fornecer um protocolo detalhado do design, síntese e purificação hplc de troca de íons de um RNA de destino que pode ser realizado usando todos, alguns ou nenhum NTPs como versões com 13C/15N, foi descrito o fluxo de trabalho de finalizar a amostra NMR e confirmar a troca conformacional com espectroscopia NMR. Finalmente, são descritos os detalhes para a configuração de experimentos 1H R1ρ RD em um espectrômetro Bruker NMR(Figura 1). O protocolo dá cada passo para configurar a versão 1D para amostras rotuladas e comentários adicionais e uma tabela para ajustar para a configuração da versão SELOPE (Tabela 2). Após o protocolo, são discutidas etapas críticas e rotas alternativas para a preparação da amostra e a configuração RD de1 H R1ρ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

O RNA é uma biomolécula altamente flexível, onde as mudanças nas estruturas desempenham papéis cruciais nas funções que as moléculas de RNA executam como mensageiros e moduladores celulares. Embora esses estados dinâmicos permaneçam ocultos à maioria dos métodos estruturais, a espectroscopia de dispersão de relaxamento R1ρ (RD) permite o estudo da dinâmica conformacional no regime micro-a milissegundo na resolução atômica. O uso de 1H como núcleo observado expande ainda mais o regime de tempo coberto e dá acesso direto a ligações de hidrogênio e emparelhamento de base.
Os passos desafiadores em tal estudo são a preparação de amostras de alta pureza e de alto rendimento, potencialmente com 13C e 15N rotulados, bem como a configuração de experimentos e a montagem de dados para extrair população, taxa de câmbio e estrutura secundária do estado anteriormente invisível. Este protocolo fornece etapas práticas cruciais na preparação da amostra para garantir a preparação de uma amostra de RNA adequada e a configuração de experimentos de 1H R1ρ com amostras de RNA isototicamente rotuladas e sem rótulo.

O protocolo para produção de RNA facilita a purificação através da geração de transcrições de alta pureza. A Figura 3A mostra os resultados de várias reações de decote de transcrições tandem, fornecendo reações bem sucedidas e mal sucedidas. A faixa 1 mostra o caso ideal de uma transcrição totalmente cortada com apenas traços fracos de produtos laterais. A pista 2a mostra decote incompleto, que pode ser resolvido re-annealing e a adição de mais RNase H (Lane 2b, passo 2.1.2). As construções RNA das pistas 1, 2a e 2b são as mesmas. A amostra na faixa 3 mostra decote mal sucedido. A solução de problemas nesta reação envolveria uma verificação da sequência do guia de decote, pureza do modelo de DNA e temperaturas de ressarcial. Potencialmente, o decote RNase H terá que ser realizado após T7 IVT, como mostrado para a amostra 2.
A amostra na faixa 4 mostra uma quantidade significativa de produtos laterais de decote, que são difíceis de remover via HPLC de troca de íons. A solução de problemas como essa amostra pode envolver (a) redução da temperatura, quantidade de RNase H ou tempo de reação, (b) reduzir o gradiente de elução e o volume de injeção e tentar separar as frações-alvo dos produtos laterais. Mais informações sobre como aumentar a resolução na purificação do HPLC de intercâmbio de íons foram discutidas por Karlsson et al.31. O HPLC separa o RNA alvo de ácidos nucleicos mais longos ou mais curtos e contaminantes de proteínas ou pequenas moléculas. A Figura 3B mostra o resultado ideal para a purificação HPLC de troca de íons. O gradiente de elução deve ser escolhido de tal forma que a espécie RNA alvo elutes pelo menos um volume de coluna (neste exemplo: 35 mL) após as próximas espécies menores e um volume de coluna antes da próxima espécie maior.
Espécies menores neste método incluem nucleotídeos únicos, produtos abortivos (8-12 nt), sequências espaçadoras de 3' e 5' (5-14 nt) e guia de decote (ácido nucleico quimérico de 12 nt), enquanto sequências mais longas são potencialmente impuros e o plasmídeo. Quando um pico de elução bem separado é alcançado, a purificação pode ser dimensionada até o equivalente a ~20 mL de reação IVT por injeção. A dobra correta de uma amostra de RNA é crucial para experimentos rd e deve ser confirmada antes de cada medição. A Figura 4 mostra um RNA de 22-mer com rótulo A antes que o protocolo de dobramento na etapa 2.4 (azul) seja aplicado, e a mesma amostra após a dobra correta tenha sido alcançada (vermelho). Uma previsão de estrutura secundária mc-fold(Figura 4C) propõe a estrutura de grampos apresentado com 4 pares de base resultando em 5 sinais imino.
Ambos os espectros na Figura 4A confirmam esses sinais previstos, embora com intensidades relativas ligeiramente diferentes, o que indica que alguma estrutura desdobrada (aqui, um dimer) pode ser problemática para avaliar com apenas 1H 1D espectros. Um espectro aromático de 1H,13C-HSQC (Figura 4B),no entanto, mostra apenas 3 dos sinais aromáticos para a amostra antes do protocolo de dobramento (azul), mas todos os 4 sinais para a amostra que foi dobrado de acordo com a etapa 2.4 (vermelho). A amostra mostrada em azul provavelmente formou um homodimer (estrutura proposta na Figura 4D) que resultaria nos mesmos sinais iminos que o grampo de cabelo. O sinal do A13H2 parece ampliado. Esses resultados ajudam a destacar a importância da confirmação dobrável com experimentos de impressão digital imino e aromática antes de cada experimento rd. As sequências de pulso 1H R1ρ descritas neste protocolo permitem a detecção de dinâmicas no regime de troca intermediária. Inicialmente é registrada uma curva de ressonância e, se houver dinâmica para um resíduo específico, uma dispersão é visível dentro dos valores R 2+REX obtidos, enquanto esta curva é plana para resíduos sem troca.
A Figura 5 mostra curvas representativas de ressonância obtidas para dois átomos H8 diferentes em um grampo de RNA sintético(Figura 5A),em que as experiências G6H8 trocam(Figura 5C),enquanto A4H8 não(Figura 5B). Como a troca é relativamente lenta nesta amostra (kEX = 292 ± 40 Hz), a vantagem do experimento SELOPE para alcançar baixos pontos fortes de SL foi explorada, e as duas curvas de ressonância foram registradas usando a versão 1D da sequência de pulso. A mesma sequência de pulso foi então usada para obter dados de ressonância para o resíduo mostrando dispersão no perfil de ressonância. A Figura 5D mostra os valores R1ρ obtidos versus deslocamento em que uma ligeira assimetria da curva já indica o sinal de Δω.
Isso se torna ainda mais evidente no lote R2+REX onde a contribuição R1 é removida(Figura 5E). A coluna direita da mesma figura mostra curvas representativas de ressonância obtidas para dois átomos H8 diferentes em um grampo de RNA sintético ligeiramente diferente com troca mais rápida, em que as experiências G6H8 trocam(Figura 5G),enquanto A4H8 não(Figura 5F). A taxa de câmbio mais rápida (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) permitiu o registro rd de todos os prótons aromáticos de uma só vez usando a versão SELOPE 2D para obter dados de ressonância contínua e externa (dados G6H8 exibidos na Figura 5H,I).
Identificadores gerais para resultados positivos e negativos Resultados positivos no tandem IVT e RNase H decote podem ser identificados da seguinte forma: 1) A banda alvo é a banda mais forte no gel PAGE desnaturação. 2) Não há bandas fracas ou apenas fracas ao redor da banda principal. 3) Não existem ou apenas espécies de peso molecular mais fracas. 4) O cromatógrafo HPLC mostra um pico bem separado do RNA alvo. 5) Quando o pico principal é amostrado, apenas uma banda aparece em um gel PAGE desnaturado.
Resultados negativos no tandem IVT e RNase H decote presente da seguinte forma: 1) Não ou apenas uma faixa principal fraca é visível em um gel PAGE desnaturando. 2) Um padrão de espécies de alto peso molecular de RNA tandem repete é visível. 3) Embora a banda principal esteja presente, bandas de intensidade semelhante estão acima ou abaixo da faixa principal dentro de ± 3 nt.
Uma amostra bem dobrada pode ser identificada da seguinte forma: 1) O número de prótons imino observados corresponde ao número de prótons imino esperados de uma simulação de estrutura secundária (por exemplo,Mc-Fold39, Figura 4A). 2) O par de bases de oscilação syn G-U em um loop UUCG (se presente) é visível a ~9,5 ppm, às vezes apenas visível em temperatura mais baixa. Outras impressões digitais do loop UUCG foram descritas por Fürtig e colegas40. 3) A impressão digital aromática concorda com uma amostra previamente atribuída que foi confirmada para dobrar corretamente(Figura 4C).
Uma amostra descasada ou degradada pode ser identificada da seguinte forma: 1) Há mais sinais de imino do que uma simulação de estrutura secundária prevê (NOTA: menos sinais imino não implicam necessariamente dobras erradas, pois os pares de base de fechamento muitas vezes não são visíveis, e a troca conformacional amplia as linhas). 2) Ausência de sinais imino. 3) Sinais estreitos de alta intensidade na região aromática, indicando produtos de degradação de nucleotídeos únicos. 4) Divergência entre sinais iminos ou aromáticos a uma amostra de referência de dobramento confirmado(Figura 4C).
Um átomo que não mostra nenhuma troca na escala de tempo detectável pode ser identificado da seguinte forma: 1) a partir de um perfil RD plano (devido à contribuição REX ausente variando com a potência SL aplicada) (Figura 5B e Figura 5F). 2) É preciso ter cuidado para o caso de troca lenta-intermediária quando kEX e Δω são da mesma magnitude. Nesse caso, a contribuição sobre ressonância pode ser muito pequena como pode ser visto na Figura 5C (neste caso os parâmetros montados são kEX = 292 ± 40 Hz e Δω = 112 ± 4 Hz). Em caso de dúvida, uma curva de baixa ressonância SL pode ser registrada para verificação.
Um átomo mostrando troca na escala de tempo intermediário pode ser identificado 1) a partir de um perfil de dispersão de relaxamento não plano em um experimento RD de ressonância(Figura 5B e Figura 5F); 2) uma largura de linha mais ampla no experimento HSQC ou SELOPE também pode ser um indicador de troca.
Os valores de potência SL bem selecionados para curvas fora da ressonância(Figura 5E,F): 1) têm uma contribuição considerável kEX na curva de ressonância (os valores de potência SL selecionados são indicados na Figura 5C e Figura 5G). 2) À medida que as curvas de ressonância são medidas para pelo menos 3 valores de potência SL, os valores de energia SL selecionados devem ser espalhados sobre a região da curva de ressonância com contribuição kEX. 3) Leve a curvas não planas R2+REX após o ajuste de Laguerre (por exemplo, Figura 5D: Pontos fortes SL 25, 50 e 75 Hz; Figura 5E).
Valores de potência SL mal selecionados para curvas fora de ressonância(Figura 5E,F) levam a curvas planas R2+REX após o ajuste de Laguerre. Um exemplo é mostrado na Figura 5E, onde a curva de 100 Hz fora de ressonância é muito plana e, portanto, não fornece informações significativas sobre Δω.
Indicações para artefatos nucleares de overhauser de quadro rotativo (ROE): 1) Δω obtidos a partir de curvas de ressonância fora correspondem a mudanças químicas de prótons nas proximidades espaciais / prótons, que mostram um pico cruzado com o pico de interesse no espectro nuclear de espectro de efeito Overhauser (NOESY). (por exemplo,a Figura 5I mostra curvas largas fora de ressonância como esperado para troca rápida-intermediária, mas as curvas também têm características mais nítidas, por exemplo,a -3000 Hz e +1500 Hz. Estes são muito prováveis devido a um artefato ROE em vez de uma mudança química para este H8 em um conformr diferente). 2) Laguerre fit funciona, mas não funciona bem (dá altos erros ou valores fisicamente impossíveis) para uma ressonância on-resonance e pelo menos 3 curvas fora de ressonância, embora os exponenciais tenham sido obtidos a partir de experimentos com alto SINO (>20) (por exemplo, kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Muitas vezes cada SL se encaixa individualmente bem, mas encaixá-los em conjunto dá um erro muito maior; o comportamento oposto é esperado para um verdadeiro estado animado.
Indicações para troca "verdadeira" Δω: 1) Δω obtidas a partir de curvas fora de ressonância não correspondem a mudanças químicas de prótons em proximidade espacial/prótons, que mostram um pico cruzado com o pico de interesse no espectro NOESY (por exemplo, Figura 5E). 2) O ajuste de Laguerre dá baixos erros para uma ressonância on-resonance e pelo menos 3 curvas fora de ressonância (por exemplo, Figura 5E vs. Figura 5I, veja legenda para resultados adequados).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Figura 3: Produção amostral por T7 tandem IVT e RNase H reação de decote. (A) Desnaturação PAGE de resultados positivos e negativos de tandem IVT e RNase H decote. A altura da escada refere-se às referências de RNA, 12* refere-se ao guia quimérico de decote. Raia 1: Geração bem sucedida de um RNA alvo de 20 nt. Poucos produtos mais curtos e longos estão presentes. Faixa 2a: Decote incompleto da transcrição tandem. Embora a purificação do HPLC seja possível, muito material seria desperdiçado. Pista 2b: O decote RNase H continuado da Faixa 2 produz uma amostra limpa pronta para injeção HPLC (idêntica à Faixa 1). Lane 4: O decote RNase H não teve sucesso, e nenhuma banda alvo foi produzida. A transcrição em conjunto ainda é visível a 600 nt. Lane 5: Uma banda alvo foi produzida, mas uma banda forte -1 está presente. Embora o HPLC possa ser realizado, é necessária uma remoção cuidadosa do produto lateral. (B) Exemplo de uma injeção hplc bem sucedida. O pico em 38 min contém RNA puro do comprimento alvo, enquanto produtos mais longos e mais curtos são bem separados do RNA alvo. O painel B foi modificado a partir de 21. Abreviaturas: IVT = transcrição in vitro; HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho; nt = nucleotídeos; UA = unidades arbitrárias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Figura 4: Exemplo de um grampo de RNA antes (azul) e depois (vermelho) da etapa dobrável 2.4 (ver protocolo) em NMR. (A) região Imino de um espectro 1H-1D de um RNA de 22-mer rotulado A. As regiões esperadas para a identidade do par de bases de sinais imino são indicadas em cinza abaixo. (B) 1H,13C-HSQC espectro das ressonâncias aromáticas do RNA do painel A. A amostra após a dobra (vermelho) mostra 4 sinais como esperado, enquanto a amostra antes de dobrar (azul) mostra apenas 3 sinais. (C) Previsão mc-fold do RNA 22-mer como um grampo de cabelo. Cinco sinais imino são esperados a partir desta estrutura secundária, que pode ser encontrada em ambas as amostras no painel A. (D) Estrutura proposta de um homodimer formado pelo RNA de 22-mer, resultando nos mesmos 5 pares de base que a estrutura do grampo de cabelo. Abreviaturas: NMR = ressonância magnética nuclear; 1D = unidimensional; HSQC = correlação quântica única heteronuclear; ppm = partes por milhão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Figura 5: 1H R1ρ RD resultados representativos para duas construções diferentes baseadas em um grampo de cabelo RNA. (A) A coluna esquerda mostra os resultados obtidos no RNA com um par de base C-G acima do U abaulado, enquanto a coluna direita mostra os resultados obtidos em uma amostra onde o par base foi trocado para G-C em vez disso. (B) e (F) apresentam perfis de dispersão plana obtidos para A4H8 para as duas construções, indicando nenhuma troca conformacional. (C–E) mostrar sobre ressonância, off-resonance e dados instalados obtidos para G6 na construção (G-C). O fit laguerre leva ao seguinte resultado: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) mostram sobre ressonância, off-resonance, e dados instalados obtidos para G6 na construção (G-C). O fit de Laguerre leva ao seguinte resultado: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43.502 ± 38.478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Este número foi modificado a partir de 20. Abreviação: SL = trava de giro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Apresentamos um protocolo para medir a dinâmica micro a milissegundo em 13C/15N rotulado e sem rótulo RNA com 1H R1ρ de dispersão nuclear de ressonância magnética (NMR). O foco deste protocolo está na preparação e configuração de amostras de alta pureza de experimentos de RMN.

Aspectos práticos da preparação e configuração da amostra de 1H R1ρ Experimentos de dispersão de relaxamento do RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Este protocolo descreve a preparação da amostra de RNA e a configuração de RMR para medições de dispersão de relaxamento de prótons R1rho para examinar a troca de confirmação em moléculas de RNA. Uma vez que os prótons são sondados, o método não precisa de rotulagem isotópica e pode acessar recursos estruturais como emparelhamento de base deslocado diretamente. A pipeta é bastante modular no sentido de que a dispersão de relaxamento R1rho pode ser medida mesmo que a amostra seja produzida com um método diferente.Comece preparando a amostra plasmida e configurando uma transcrição in vitro e reação de decote, conforme descrito no manuscrito do texto. Incubar a reação a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, dilua um microliter da amostra dez vezes na solução de carregamento.E executar um microliter em um gel PAGE desnaturing. Se a reação do decote for bem sucedida, dimensione a reação ao volume desejado e execute-a durante a noite. Em seguida, execute outro gel PAGE desnaturação e avalie se a reação do decote foi concluída.Em caso de decote incompleto, aqueça a solução de reação em um micro-ondas convencional a 450 watts por 15 segundos. Em seguida, esfrie a solução lentamente a 37 graus Celsius por 40 minutos para reanneal o RNA e o guia de decote. E note a formação de um novo precipitado.Adicione mais pirofosfatase inorgânica e RNase H.Incubar a reação por uma a três horas a 37 graus Celsius. Em seguida, confirme a conclusão da reação do decote com a DEsnaturação PAGE. Quando a reação de decote RNase H estiver completa, sacie a reação adicionando EDTA a uma concentração final de 50 mililitros.E vórtice completamente. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,2 míingo. E concentrar a solução em um volume injetável em um sistema HPLC para purificação.Antes de adicionar a amostra concentrada e purificada ao tubo NMR, limpe o tubo lavando com água abundante. Em seguida, rnase reagente descontaminação, água e 95% etanol. Depois da lavagem final com água, deixe-a secar.Enxágüe o êmbolo com água e use um lenço sem fiapos para limpar com reagente de descontaminação RNase e 95% de etanol. Depois de secar o tubo e o êmbolo, adicione 10% D2O à amostra de RMN. Use uma grande ponta de pipeta para transferir a amostra de RNA para o tubo NMR, fluindo-a ao longo da lateral da parede do tubo.Insira o êmbolo no tubo empurrando-o para baixo com um movimento de torção rápida para remover bolhas de ar, em seguida, puxe o êmbolo lentamente sem criar novas bolhas de ar. E conserte com filme de cera de parafina. Crie um novo conjunto de dados baseado em um conjunto de dados HSQC de carbono de próton aromático usado em amostras de RNA totalmente rotuladas para atribuição de RNA.Defina os parâmetros gerais e parâmetros específicos do RD. Em seguida, defina a potência de bloqueio de giro de prótons para 1,2 kilohertz para testes. Gere uma lista vd de teste com apenas uma entrada, zero milissegundos, defina TDF1 para um e atualize o D30 para executar um espectro de teste.Depois de configurar uma lista vd de teste, atualize D30 e TDF1. E plote a intensidade do pico para diferentes comprimentos de bloqueio de giro. Identifique o comprimento do bloqueio de rotação no qual a intensidade do pico original diminui para um terço.A partir do resultado dos testes, crie a lista final de vds a ser usada no experimento. Selecione o número de varreduras para que o pico mais fraco da lista tenha uma relação sinal/ruído de pelo menos 10. Os resultados de várias reações de decote de transcrições tandem são mostrados aqui.Um RNA de alvo de nucleotídeo de 20 nucleotídeos foi gerado em uma reação bem sucedida. Reações mal sucedidas resultaram em decote incompleto e falha da amostra. A injeção de HPLC da amostra de RNA revelou um pico para RNA de alvo puro em 38 minutos.Enquanto produtos mais longos e mais curtos foram bem separados do pico de interesse. A análise do grampo de cabelo do RNA mostrou que o número de prótons imino observados correspondia ao número de prótons imino esperados a partir de uma simulação de estrutura secundária. O espectro de carbono de prótons HSQC das ressonâncias aromáticas do RNA mostrou quatro sinais após a dobra.E apenas três sinais antes de dobrar. No representante em curvas de ressonância obtidas para dois átomos H8 diferentes e dois grampos sintéticos diferentes de RNA, o G6H8 experimenta troca de confirmação. Enquanto o A4H8 não.Para g6H8, os poderes de bloqueio de giro colorido foram selecionados e os dados de ressonância foram registrados. Na construção CG onde a troca é lenta, os valores da linha R1rho versus o gráfico offset já apresentavam uma leve assimetria da curva, indicando o sinal da diferença de mudança química delta ômega. Isso se torna ainda mais evidente no gráfico R2 plus REX onde a contribuição R1 é removida.Por outro lado, a construção do GC experimenta troca mais rápida e os valores R1rho versus parcela offset apresentaram uma curva mais ampla onde a extração de delta ômega torna-se menos óbvia mesmo na trama R2 plus REX. Uma vez que a dinâmica do RNA tenha sido elucidada, os estados podem ser caracterizados e presos. Esses estados presos podem, por exemplo, ser testados em ensaios biológicos.Este método nos permite observar mudanças de pareamento de base funcionais e relevantes em um complexo ativo de microRNA miRNA, rearranjos de loop no RNA ribossômico e estabilidade do par base de protuberâncias de nucleotídeos únicos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Bioquímica

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG Relaxation Dispersão para a Investigação da Dinâmica Conformacional de Proteínas na escala de tempo μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...