Мы благодарим научно-протеиновый научный центр (PSF) в Каролинском институте за экспрессию и очистку РНК-полимеразы Т7 и RNase H E. coli, Мартина Хелльберга за щедрый дар неорганической фосфатазы и всю Лабораторию Петцольда за ценные дискуссии. Мы благодарим Луку Ретаттино за подготовку конструкций U-bulge, а также Эмили Штайнер и Каролину Фонтану за их вклад в макросы и примерку сценариев. Мы выражаем признательность Каролинского института и Департаменту медицинской биохимии и биофизики за поддержку покупки спектрометра 600 МГц и позиционное финансирование (KI FoAss и KID 2-3707/2013). Мы благодарны за финансовый вклад от Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 и FFL15-0178) и The Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 и 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 и M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. признает финансирование через Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF project No 747446).

К.П. является консультантом Arrakis Therapeutics, компании, которая обнаруживает небольшие молекулы, нацеленные на РНК.

РНК выполняют множество регуляторных1,каталитических2и структурных3 функций в клетке, многие из которых коррелируют с гибкой молекулярной структурой и сложными изменениями этих структур4,5,6,7. Малонаселенные состояния остаются невидимыми для большинства методов определения структуры или не позволяют изучать эти скрытые состояния при высоком атомном разрешении. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) сочетает в себе оба аспекта, предоставляя доступ к отдельным атомным ядрам, а также предлагая большой набор инструментов экспериментов, нацеленных на динамику через все временные режимы8. Эксперименты RD ЯМР обеспечивают доступ к конформационному обмену в промежуточной шкале времени, в которой можно ожидать изменения в паттернах спаривания оснований и локальных структурных перестроек5,9,10,11,12,13,14. Эксперименты RD выполняются в виде длинных измерений R2 в виде импульсного поезда Карра-Перселла-Мейбума-Гилла15 или в виде релаксационных измерений во вращающейся рамке, называемых экспериментами R1ρ RD16.
Хотя оба могут быть использованы для извлечения популяции и разницы обменного курса и химического сдвига в минорное состояние, эксперименты R1ρ RD также дают знак разности химического сдвига возбужденного состояния. Это позволяет сделать вывод о вторичной структуре, которая сильно коррелирует с химическим сдвигом в структурах РНК17. Химический сдвиг является хорошим показателем еликности в случае ароматических протоонов и атомов углерода на нуклеосах, партнеров по спариванию оснований для протоонов имино и сахарных шайб на атомах C4' и C1'18,19. Следует отметить, что недавно эксперимент по переносу насыщения химическим обменом (CEST) с использованием более высокой мощности спинового замка (SL), тем самым смещая применимость эксперимента CEST к более быстрым временным шкалам обмена, был опубликован в качестве альтернативы эксперименту R1ρ RD для систем с одним возбужденным состоянием.
Хотя изотопы 13C и 15N часто использовались для доступа к структурному обмену, недавняя работа из этой лаборатории использовала ароматические протоны и имино в качестве зондов для конформационного обмена9,10. Использование 1H в качестве наблюдаемого ядра приносит несколько преимуществ, например, доступ к обмену на более быстрых и медленных временных масштабах, более высокую чувствительность и более короткое время измерения. Этому также способствует подход SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), обеспечивающий доступ к ароматическим протонам путем декообразования одномерного (1D) спектра с использованием гомоядерных скалярных связей вместо гетероядерного переноса намагниченности и устраняющий необходимость в изотопных метках20. Этот протокол предназначен для измерения в экспериментах 1H R1ρ RD однородно 13C /15N-меченых и немаркированных образцов. Таким образом, в данной статье представлен метод подготовки образцов, который был признан наиболее универсальным для различных потребностей в подготовке образцов21, и обсуждаются альтернативы в последнем разделе этой статьи(рисунок 1).
На этом этапе читатель должен отметить, что другие методы пробоподготовки приемлемы для экспериментов 1H R1ρ RD, и что другие методы структурного и функционального анализа могут быть выполнены с образцами, синтезированными с помощью представленной методики. 1 1 Эксперименты H R1ρ RD требуют высоких концентраций РНК (в идеале >1 мМ), а также высокой однородности, как по длине РНК, так и по структурной конформации для обеспечения надежной характеристики молекулярной динамики. Транскрипция in vitro (IVT) является методом выбора для многих исследователей для получения 13C /15N-меченых образцов РНК из-за наличия меченых нуклеозидтрифосфатов (NTL) и легкого включения в ферментативную реакцию22. Однако широко используемая T7 РНК-полимераза (T7RNAP)23,24,25 страдает низкой однородностью 5' в случае определенных последовательностей инициации26,27 и часто также 3' однородности во время транскрипционногостока 28. Очистка целевого вида РНК становится более дорогостоящей и трудоемкой из-за необходимости больших количеств ~200 нмоль. Метод, используемый здесь, был представлен ранее, где преимущества обсуждались на расширенном21. Короче говоря, он решает описанные проблемы путем транскрибирования более крупного тандемного транскрипта, который затем специально расщепляется Escherichia coli RNase H, руководствуясь химерным олигонуклеотидом29,30 (см. Рисунок 2 для деталей).
Включение спейсерной последовательности на концах 5' и 3' тандемного транскрипта позволяет использовать высокопроизводительную последовательность инициации и удаление концевых свесов вблизи места линеаризации плазмидного шаблона соответственно(рисунок 2B). Было показано, что метод значительно улучшает урожайность, одновременно снижая затраты и трудозатраты, с оговоркой о более сложном синтезе шаблона и необходимости дополнительного фермента и олигонуклеотида. Высокая специфичность расщепления РНКазы Н облегчает очистку из-за отсутствия видов РНК в аналогичном диапазоне размеров. В настоящем протоколе используется ионообменная высокопроизводительная жидкая хроматография (ВЭЖХ), которая была опубликована этой лабораторией недавно31,хотя другие методы являются возможными альтернативами. 1 1 H R1ρ RD может, как правило, быть получен на меченых или немаркированных образцах с двумя соответствующими последовательностями импульсов, «меченым» 1H R1ρ гетероядерной одиночной квантовой корреляции (HSQC) на основе эксперимента с 13C косвенной размерностью10 и «немаркированного» 1H R1ρ ЭКСПЕРИМЕНТ НА основе SELOPE с 1H косвенной размерностью20. 
Эти двумерные (2D) эксперименты могут служить первой проверкой, независимо от того, присутствует ли в образце динамика на временной шкале R1ρ. Можно получить обзор RD для всех разрешенных пиков в спектрах, и определить пики, представляющие интерес для более тщательного анализа RD. Это означает, что даже немаркированные образцы могут быть проверены до принятия решения о производстве более дорогого, маркированного образца. После того, как пик с конформационным обменным вкладом выбран для более тщательного изучения, лучше всего переключиться на 1D-версии вышеуказанных экспериментов (если пик все еще может быть разрешен) для проведения так называемых внерезонансных экспериментов. Для маркированной версии перенос HSQC на 13C заменяется селективным шагом гетероядерной кросс-поляризации (HCP), как используется в экспериментах 13C R1ρ 32,33,34,35,в то время как в случае эксперимента SELOPE эксперимент просто запускается как 1D, что особенно полезно для сигналов H8 и H2, которые лежат на диагонали в 2D в любом случае. Одним из критериев того, какую последовательность использовать, при условии, что доступны как помеченный, так и немаркированный образец, является то, насколько хорошо изолирован пик интереса в двух экспериментах.
В целом, эксперимент SELOPE рекомендуется для образцов РНК до 50 нуклеотидов. Для более крупных РНК перекрытие будет больше; однако структурно интересные нуклеотиды часто появляются в областях химического сдвига, которые менее перекрываются и все еще могут быть доступны в еще более крупных РНК. Другим аргументом может быть то, что в немаркированных образцах J-связь не происходит между 1H и 12C. Однако, поскольку минимальная мощность блокировки спина определяется минимальной мощностью, используемой для разъедименения этих двух спинов (~ 1 кГц) в меченом эксперименте, немаркированный эксперимент позволяет использовать более широкий диапазон сильных сторон спин-блокировки (SL) и, следовательно, доступ к более широкой временной шкале обмена. Эти внерезонансные эксперименты предоставляют дополнительную информацию для kex,такую как популяция возбужденного состояния (альтернативный конформер), pES, а также очень ценную информацию о химическом сдвиге в виде Δω (разность химического сдвига основного состояния и возбужденного состояния).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Рисунок 1:Рабочий процесс представленного протокола. Подготовка перед фактическим крупномасштабным производством образца, состоящая из подготовки шаблона и подтверждения успешной транскрипции in vitro и расщепления RNase H. Крупномасштабное производство, включая очистку ВЭЖХ, заполнение ямр-трубки и подтверждение сворачивания РНК. В случае синтеза с мечеными изотопами в тот же день должна быть выполнена немаркированная очистка для оптимизации градиента. ЯМР-характеристика конформационной динамики с помощью экспериментов R1ρ. Каждый этап может быть выполнен независимо, например,анализ RD 1H R1ρможетбыть применен к любому подходящему образцу РНК, полученному другим способом. Сокращения: IVT = транскрипция in vitro; ВЭЖХ = высокоэффективная жидкостная хроматография; ЯМР = ядерный магнитный резонанс; RD = дисперсия релаксации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Целью данного протокола является предоставление практических деталей и критических параметров для изучения конформационной динамики с релаксационной дисперсией 1HR1ρ в молекулах РНК шпильки. После предоставления подробного протокола проектирования, синтеза и очистки ионообмонной ВЭЖХ целевой РНК, которая может быть выполнена с использованием всех, некоторых или ни одного НТП в виде 13C /15N-меченых версий, был описан рабочий процесс завершения образца ЯМР и подтверждения конформационного обмена с ЯМР-спектроскопией. Наконец, описаны детали установки экспериментов 1H R1ρ RD на ЯМР-спектрометре Bruker(рисунок 1). Протокол дает каждый шаг для настройки версии 1D для помеченных образцов и дополнительных комментариев, а также таблицу для настройки настройки версии SELOPE(таблица 2). После протокола обсуждаются критические этапы и альтернативные пути подготовки образцов и настройки RD 1H R1ρ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

РНК представляет собой очень гибкую биомолекулу, в которой изменения в структурах играют решающую роль в функциях, которые молекулы РНК выполняют в качестве клеточных мессенджеров и модуляторов. Хотя эти динамические состояния остаются скрытыми для большинства структурных методов, спектроскопия релаксационной дисперсии R1ρ (RD) позволяет изучать конформационную динамику в микро-миллисекундном режиме при атомном разрешении. Использование 1H в качестве наблюдаемого ядра еще больше расширяет охватываемый временной режим и дает прямой доступ к водородным связям и спаривающим основаниям.
Сложными этапами в таком исследовании являются высокочистая и высокопроизводительная пробоподготовка, потенциально 13C- и 15N-меток, а также установка экспериментов и подгонка данных для извлечения популяции, обменного курса и вторичной структуры ранее невидимого состояния. Этот протокол обеспечивает важнейшие практические этапы в подготовке образцов для обеспечения подготовки подходящего образца РНК и установки экспериментов 1H R1ρ как с изотопно мечеными, так и с немаркированных образцами РНК.

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Представлен протокол измерения микро-миллисекундной динамики на 13C/15N-меченой и немаркированной РНК с 1H R1ρ релаксационной дисперсионной ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопии. Основное внимание в этом протоколе уделяется высокочистой пробоподготовке и настройке экспериментов ЯМР.

Практические аспекты пробоподготовки и настройки экспериментовпо релаксационной дисперсии РНК 1 H R1ρ

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Этот протокол описывает подготовку образца РНК и установку ЯМР для измерения дисперсии релаксации протона R1rho для изучения подтверждаемого обмена в молекулах РНК. Поскольку протоны исследуются, метод не нуждается в изотопной маркировке и может напрямую обращаться к структурным особенностям, таким как смещенное спаривание оснований. Пипетка является довольно модульной в том смысле, что дисперсия релаксации R1rho может быть измерена, даже если образец получен другим методом.Начните с подготовки образца плазмиды и создания реакции транскрипции и расщепления in vitro, как описано в текстовой рукописи. Инкубируют реакцию при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем разбавляют один микролитр образца в десятикратном загружаемом растворе.И запустите один микролитр на денатурирующий гель PAGE. Если реакция расщепления прошла успешно, масштабируйте реакцию до нужного объема и запустите ее на ночь. Затем запустите еще один денатурирующий гель PAGE и оцените, была ли завершена реакция расщепления.В случае неполного расщепления нагревают реакционный раствор в обычной микроволновой печи на 450 Вт в течение 15 секунд. Затем медленно охладите раствор до 37 градусов Цельсия в течение 40 минут, чтобы повторно восхитить РНК и направляющую расщепления. И отметим образование нового осадка.Добавьте больше неорганической пирофосфатазы и РНКазы H.Инкубируют реакцию в течение одного-трех часов при 37 градусах Цельсия. Затем подтвердите завершение реакции расщепления денатурированием PAGE. Когда реакция расщепления РНКазы Н завершена, утушить реакцию, добавив ЭДТА к конечной концентрации 50 миллимоляров.И вихрь основательно. Процедить раствор через шприцевой фильтр длительности 0,2 мкм. И сконцентрируйте раствор в объеме, впрыскиваемом в систему ВЭЖХ для очистки.Перед добавлением концентрированного и очищенного образца в ЯМР-трубку очистите трубку, промыв обильной водой. Затем реагент для обеззараживания РНКазы, воды и 95% этанола. После окончательного смыва водой оставьте его сохнуть.Промойте поршень водой и используйте безворсовую салфетку для очистки реагентом обеззараживания РНКазы и 95% этанолом. После сушки трубки и плунжера добавьте 10% D2O в образец ЯМР. Используйте большой наконечник пипетки для переноса образца РНК в ЯМР-трубку, протекая его вдоль боковой части стенки трубки.Вставьте плунжер в трубку, толкнув его вниз быстрым скручивающим движением, чтобы удалить пузырьки воздуха, а затем медленно потяните плунжер вверх, не создавая новых пузырьков воздуха. И зафиксируйте его парафиновой восковой пленкой. Создайте новый набор данных на основе набора данных ароматического протонного углерода HSQC, используемого на полностью меченых образцах РНК для присвоения РНК.Задайте общие параметры и параметры, специфичные для RD. Затем установите мощность блокировки протона на 1,2 килогерца для тестирования. Создайте список тестов vd только с одной записью, ноль миллисекунд, установите TDF1 равным единице и обновите D30 для запуска тестового спектра.После настройки тестового списка vd обновите D30 и TDF1. И построить график интенсивности пика для разных длин блокировки спина. Определите длину блокировки спина, при которой интенсивность исходного пика уменьшается до одной трети.На итоге тестовых запусков создайте окончательный список vd для использования в эксперименте. Выберите количество сканирований таким образом, чтобы самый слабый пик списка имеет отношение сигнал/шум не менее 10. Здесь показаны результаты нескольких реакций расщепления тандемных транскриптов.В успешной реакции была сгенерирована 20 нуклеотидная целевая РНК. Неудачные реакции привели к неполному и неудачному расщеплению образца. Инъекция ВЭЖХ образца РНК показала пик чистой целевой РНК через 38 минут.В то время как более длинные и короткие продукты были хорошо отделены от пика интереса. Анализ шпильки РНК показал, что количество наблюдаемых протоонов имино соответствовало количеству протоонов имино, ожидаемому от моделирования вторичной структуры. Протонный углеродный спектр HSQC ароматических резонансов РНК показал четыре сигнала после сворачивания.И только три сигнала перед складыванием. В репрезентативном на резонансных кривых, полученных для двух разных атомов H8 и двух разных синтетических шпишек РНК, G6H8 испытывает подтверждающий обмен. В то время как A4H8 этого не делает.Для G6H8 были выбраны цветные мощности блокировки спина и записаны данные о внерезонансе. В конструкции CG, где обмен медленный, значения строки R1rho против графика смещения уже отображали небольшую асимметрию кривой, указывающую на признак разницы химических сдвигов дельта омега. Это становится еще более очевидным на графике R2 плюс REX, где вклад R1 удаляется.С другой стороны, конструкция GC переживает более быстрый обмен, а значения R1rho против офсетного графика представляют собой более широкую кривую, где извлечение дельта-омега становится менее очевидным даже на графике R2 плюс REX. После того, как динамика РНК была выяснена, состояния могут быть охарактеризованы и пойманы в ловушку. Эти захваченные состояния могут, например, быть проверены в биологических анализах.Этот метод позволяет наблюдать функциональные, релевантные сдвиги спаривания оснований в активном комплексе микроРНК миРНК, перегруппировки петли в рибосомальной РНК и стабильность пары оснований на одиночных нуклеотидных выпуклостях.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 15 N CPMG Релаксационная дисперсия для исследования конформационной динамики белка на шкале времени мкс-мс

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Пробоподготовка и относительное количественное определение с использованием восстановительного метилирования аминов для исследований пептидомики

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Усиление парамагнитной релаксации для обнаружения и характеристики самоассоциаций внутренне неупорядоченных белков

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...