Vi tackar proteinvetenskapsanläggningen (PSF) vid Karolinska Institutet för uttryck och rening av T7 RNA-polymeras och E. coli RNase H, Martin Hällberg för den oorganiska fosfatasens generösa gåva och hela Petzoldlab för värdefulla diskussioner. Vi tackar Luca Retattino för förberedelserna av U-bulge-konstruktionerna och Emilie Steiner och Carolina Fontana för deras bidrag till makron och passande manus. Vi bekräftar Karolinska Institutet och Institutionen för medicinsk biokemi och biofysik för att stödja inköp av en 600 MHz spektrometer- och positionsfinansiering (KI FoAss och KID 2-3707/2013). Vi är tacksamma för ekonomiska bidrag från Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 och FFL15-0178) och Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS201400 09), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 och 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 och M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. erkänner finansiering genom en Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF projekt nr 747446).

K.P. är konsult till Arrakis Therapeutics, ett företag som upptäcker små molekyler riktade mot RNA.

Protokollet som presenteras häri är en syntes av flera protokoll som publicerats tidigare i form av forskningsartiklar10,20,21,31. Därför kan segment av protokollet tillämpas, medan andra kan bytas till läsarens önskemål. Till exempel kan R1ρ-mätningarna utföras på ett RNA-prov som produceras med vilken metod som helst, med tanke på att vikning och homogenitet av längden antas. Dessutom innehåller protokollet inte information om resonanstilldelning av RNA-sekvensen -ett steg som krävs för RD-experiment - eftersom detta har täckts mycket i tidigarelitteratur 19,37,38. Partiella, segmentala eller platsspecifika märkningssystem36,41,42,43,44 är metoder för att underlätta resonanstilldelning eller minska överlappningen av resonanser som är av intresse för RD-experiment och har beskrivits länge i litteraturen. Denna metod tillåter användning av enhetlig märkning av alla nukleotididentiteter, vilket redan kan förenkla resonanstilldelningen avsevärt.
IVT-metoden som presenteras här övervinner kända problem med sekvenser och märkning, ökar avkastningen och minskar kostnader och arbetstid jämfört med andra metoder. Användningen av den virala initieringssekvensen minskar behovet av reaktionsoptimering, vilket är ett känt problem inom området som kan vara tidskrävande att utföra och ger bara några kopior av avskriften vid icke-G-initiering. Tandemavskriftens T7 IVT- och RNase H-klyvning kan utföras samtidigt i samma kärl. Ett mönster av multimeriska tandemrepetitioner kan ses på en denaturerande PAGE-gel under reaktionen, som sammanförs till ett enda band på mål-RNA efter slutförandet av RNase H-reaktionen (Figur 3A, körfält 1 och 2b). Typiska utbyten med denna metod varierar mellan 30 och 70 nmol RNA per 1 ml IVT. Ändå kommer metoden baserad på RNase H klyvning av tandemrepetitioner inte utan vissa egna problem. RNase H-klyvningsreaktionen slutförs ofta inte när den körs samtidigt med T7-transkription (Figur 3A, körfält 2a).
Separationen av tandemenheter kan slutföras genom att klyvningsguiden glödgas till avskriften och lägga till fler RNase H (Figur 3A, körfält 2b, steg 2.1.2). Eftersom uppvärmningen av stora volymer är långsam och leder till Mg2 +-katalyserad hydrolys av RNA användes en konventionell mikrovågsugn, vilket värmer provet till >95 °C på 10-15 s. Negativa effekter på de producerade proverna har hittills inte observerats. Vissa konstruktioner visar ett mindre andra band som inte kunde elimineras genom optimering av reaktionsförhållandena (Figur 3A, körfält 4). Vanligtvis är dessa ganska tydligt synliga som en axel i HPLC-kromatogrammet, om en väloptimerad elueringsgradient används och kan tas bort (steg 2.2.5). Följande diskussion syftar till att belysa kritiska steg i protokollet, särskilt när det gäller att erhålla högkvalitativa data som möjliggör en tolkning av konformationsdynamiken.
RNase förorening Extracellulära RNases är allestädes närvarande, mycket stabila och utgör det största hotet för långsiktig stabilitet hos NMR-prover. Därför är det viktigt att arbeta i en RNase-fri miljö och hålla alla reagenser och plastartiklar RNase-fria. Användningen av filterspetsar och kanske till och med ansiktsmasker rekommenderas. Detta är särskilt viktigt efter HPLC-rening. NMR-prover som är förorenade med RNases uppvisar vanligtvis smala toppar synliga i 1H-1D-spektra efter dagar eller veckor på grund av enkärniga nedbrytningsprodukter. Ett sådant prov är inte lämpligt för R1ρ-mätningar. 
NMR-prov På grund av sin mycket laddade natur kan RNA användas i höga koncentrationer utan nederbörd jämfört med de flesta proteiner. Användningen av Shigemi NMR-rör (se materialtabellen)är fördelaktig eftersom de tillåter centrering av det högkoncentrerade provet i mitten av spolen samtidigt som det ger idealiska shimming- och låsförhållanden på grund av den känslighetsmatchade glasbotten och kolven. På så sätt reduceras B1-inhomogenitet, vilket ger upphov till smalare linjer. Den typiska provvolymen i ett NMR-rör är 250 μL och den typiska koncentrationen är 1-2 mM. Prover under 500 μM rekommenderas inte för RD-experiment eftersom experimentet skulle ta för lång tid och en bra shim. På samma sätt rekommenderas inte provvolym under 200 μL eftersom en god shim och fältstabilitet (lås) krävs. Vid insättning av kolven är det viktigt att undvika bildandet av bubblor i provet (steg 2.4.5). Om kolven inte är korrekt fastsatt kan den glida ner i provet, vilket minskar den detekterbara volymen. Dessutom kan snabba temperaturförändringar leda till bildandet av nya bubblor i provet. Därför bör försiktighet vidtas vid transport av provet och vid ändring av sondtemperaturen i NMR-spektrometern. Kontrollera provet för bubblor när du mäter igen efter en längre period.
RNA-vikning Dynamiska RNA-molekyler kan finnas i flera konformationer när de inte viks ordentligt. Även om smälttemperaturer i sekundära strukturer endast kan vara något över rumstemperaturen, rekommenderas ett grundligt uppvärmnings- och snäppkylningsförfarande före mätning. Högkoncentrerade hårnålsprover som viks under kinetisk kontroll (uppvärmning och snapkylning) kan bilda homodimers över tid, vilket kräver rigorös kontroll av RNA-vikning före varje NMR-mätning. Om det uppmätta RNA inte är en hårnålsstruktur utan en RNA-duplex, bör långsam vikning under termodynamisk kontroll appliceras.
I detta fall bör kylprocessen efter uppvärmning vara inom intervallet timmar, medan RNA används vid sin slutliga volym och koncentration i NMR-provet. En första räkning av förväntade imino och aromatiska resonanser kan ge insikt om provets homogenitet. Om provet inte ser ut som förväntat bör det vikas om. Mg2+ (tillsatt som kloridsalt) kan hjälpa till med vikbara RNA-strukturer45. I praktiken fungerar vikningskontrollen som en jämförelse med ett prov som har använts för att åtminstone delvis tilldela NMR-resonanserna och för att lösa den sekundära strukturen experimentellt.
Spinnlåskraft och värmeöverväganden Vid körning av 1H R1ρ RD-experiment som 2D-översiktsexperiment bör SL-kraften inte vara lägre än 1,2 kHz. Radiofrekvensen ska placeras i mitten av ppm-området i de bästa topparna (t.ex. 7,5ppm för aromatiska protoner). Bandbredden på 1,2 kHz kommer då att vara tillräckligt stor för att spinna dessa protoner utan några större off-resonanseffekter. Sådana effekter kan identifieras i RD-profilen. Om de inträffar ökar R2+REX-värden istället för att minska med ökande SL-effektvärden, särskilt för låg SL-effekt. Kontrollera om de beräknade SL-effektvärdena motsvarar den effekt som levereras till provet. I praktiken kan beräknad SL-effekt användas om 1H 90° hårdpulsen kalibrerades noggrant på nyare spektrometrar; Detta kan dock kontrolleras genom att kalibrera SL-ström för varje önskad bandbredd.
Utbudet av SL-effekt, som kan användas i 1H R1ρ RD-experiment, är mycket brett, vilket leder till varierande provuppvärmning (1,2 kHz till 15 kHz för HSQC för HCP-baserade sekvenser och 50 Hz till 15 kHz för SELOPE-experiment). Ojämn provuppvärmning kan detekteras som en liten förändring i kemiskt skifte när man jämför 1D:er som erhållits för lågeffekts-SLs jämfört med. hög effekt SLs. Denna effekt beaktas vanligtvis inte i värmekompensationer i R1ρ experiment på heteronuclei. Värmekompensation i dessa experiment ställs vanligtvis in för att korrigera för olika uppvärmning på grund av de olika spinnlåslängder som anges i vd-listan för varje spinnlåskraftserie. Speciellt för SELOPE-experimentet bör en andra värmekompensation användas över alla tillämpade SL-styrkor enligt beskrivningen i20.
vd-lista överväganden Som nämnts tidigare bör vd-listan innehålla en tidspunkt som är tillräckligt lång för att erhålla ett betydande förfall av intensitet (helst ner till 30% av den ursprungliga signalen eller så låg som möjligt om det inte är möjligt att nå ett 70% förfall inom sondens specifikationer). Även om vd-listan var optimerad för en låg SL-effekt (1,2 kHz), bör denna vd-lista också testas med den högstaSL-effektsom ska användas ( t.ex. 15 kHz). Detta beror på att för toppar med betydande REX-bidrag kommer förfallet att vara mycket långsammare vid hög SL-effekt. Så ett tillräckligt förfall bör också verifieras vid hög SL-effekt. Detsamma måste övervägas för förfall vid höga förskjutningar i off-resonans experiment. Den idealiska maximala tidspunkten för vd-listan kan vara betydligt annorlunda för de olika regionerna i spridningsexperimentet. I så fall kan fler punkter ingå i vd-listan, och ju längre vd-listpunkter för högre SL-effekt eller högre förskjutningar under analysen, baserat på den låga SINO de kommer att leda till, kan kasseras. I allmänhet bör 5-8 vd-listpunkter anses kunna upptäcka potentiella artefakter som leder till icke-exponentiella förfall som J-koppling (se nedan).
1D-HCP selektivitet överväganden Särskild försiktighet måste vidtas när du kör den HCP-baserade 1D-versionen om det finns en annan topp som överlappar med toppen av intresset för 1H-dimensionen i det 2D HSQC-baserade experimentet. HCP-baserade överföringar är mycket, men aldrig 100% selektiva, och det kan därför hända att en annan topp bidrar till intensiteten och förfallsbeteendet hos toppen av intresset för 1D. En indikation på detta skulle vara en skillnad i värdena R1ρ som erhålls med hjälp av 1D- och 2D-versionerna av det märkta experimentet.
ROE överväganden: För off-resonanskurvor av atomer med långsam mellanliggande utbyte, ROE artefakter kan identifieras baserat på en jämförelse av den erhållna Δω med en NOESY eller ROESY spektrum. Om en korstopp kan identifieras vid en kemisk skiftskillnad motsvarande Δω, kan det observerade upphetsade tillståndet i själva verket vara en ROE-artefakt (t.ex.hittades ROEs mellan aromatiska protoner, som alla ligger i samma kemiska skiftområde och därför omfattas av dessa off-resonanskurvor20). Av erfarenhet ledde detta alltid också till dåliga anfall med stora fel, möjligen på grund av att ROE inte följer samma mönster som REX med ökande SL-kraft. Situationen blir svårare för mellansnabbt utbyte. Medan resonanskurvan är (från jämförelse med 13C-data som erhållits på grannkärnan) fortfarande representativ för utbytesprocessen mellan GS och ES, påverkas off-resonanskurvan av flera ROE-artefakter.
I så fall är SL-kraften för att upptäcka utbytesprocessen större (>1,5 kHz) och sträcker sig därför över ett större antal protoner eftersom off-resonanskurvor sträcker sig över kemiska skiftskillnader mellan olika ROE-kandidater (för H8 skulle dessa vara: aminoprotoner vid ca. ±1000 Hz, H5/H1 är på ca -1200 Hz, imino protoner vid ca 3500 Hz). Hittills har det inte visat sig att någon metod för att undertrycka dessa ROE-artefakter (annat än att använda delvis avuteröjda nukleotider46),och data från annan än resonans bör inte registreras för snabb mellanliggande utbyte, eftersom ingen tillförlitlig information om den faktiska Δω kan extraheras med denna metod, om NOE/ROE-bidraget inte kan uteslutas via NOESY-spektra.
J-Koppling (Hartmann-Hahn) överväganden Även om on-resonanskurvor för homonukleära J-kopplade protoner, såsom H6, framgångsrikt registrerades10,20, måste särskild försiktighet tas för off-resonansmätningar, särskilt för låg SL-kraft eftersom Hartmann-Hahn matchande villkor kan sträcka sig över ett brett spektrum av de undersökta förskjutningarna. Hartmann-Hahn artefakter kan identifieras som svängningar på det exponentiella förfallet eller ökande R2+REX-värden med ökande SL-styrkor i on-resonans RD-tomter20.

RNAs utför en mängdreglerande 1,katalytiska2, och strukturella3 funktioner i cellen, varav många är korrelerade till en flexibel molekylär struktur och invecklade förändringar av dessa strukturer4,5,6,7. Lågbefolkade tillstånd förblir osynliga för de flesta metoder för strukturbestämning eller tillåter inte studier av dessa dolda tillstånd med hög atomupplösning. Lösningstillstånd kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) kombinerar båda aspekterna genom att ge tillgång till enskilda atomkärnor samt erbjuda en stor verktygslåda med experiment som riktar sig mot dynamik genom alla tidsregimer8. RD NMR-experiment ger tillgång till konformationsutbyte i mellantidsskalan, där förändringar i basparningsmönster och lokala strukturella omorganiseringar kan förväntas5,9,10,11,12,13,14. RD-experiment utförs som långa R2-mätningar i form av ett Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulståg15 eller som avslappningsmätningar i den roterande ramen, kallade R1ρ RD-experiment16.
Även om båda kan användas för att extrahera population av och växelkurs och kemisk skiftskillnad till det mindre tillståndet, ger R1ρ RD-experiment också tecknet på den kemiska skiftskillnaden i det upphetsade tillståndet. Detta möjliggör en slutsats om sekundär struktur, vilket starkt korrelerar till kemisk förändring i RNA-strukturer17. Det kemiska skiftet är en bra indikator på helicitet när det gäller aromatiska protoner och kol på kärnkärnorna, basparningspartners för iminoprotoner och sockerpuckers på C4' och C1' atomer18,19. Det bör noteras att nyligen ett experiment för överföring av kemiska utbytesmättnad (CEST) med högre spinnlåskraft (SL), vilket flyttade tillämpligheten av CEST-experimentet till snabbare växelkurstidsskalor, publicerades som ett alternativ till R1ρ RD-experimentet för system med ett upphetsad tillstånd.
Även om 13C och 15N isotoper ofta har använts för att få tillgång till strukturellt utbyte, använde nyligen arbete från detta laboratorium aromatiska och imino protoner som sonder för konformationsutbyte9,10. Användningen av 1H som observerad kärna ger flera fördelar, till exempel tillgång till utbyte på snabbare och långsammare tidsskalor, högre känslighet och kortare mättider. Detta underlättas ytterligare av SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE) strategi, ger tillgång till aromatiska protoner genom dekrowding av det endimensionella (1D) spektrumet med hjälp av homonukleära skalär kopplingar, istället för en heteronukleär magnetisering överföring, och eliminera behovet av isotop etiketter20. Detta protokoll behandlar mätningen i 1H R1ρ RD-experiment med enhetliga 13C/15N-märkta och omärkta prover. Därför presenterar detta dokument en provberedningsmetod som konstaterades vara den mest mångsidiga för olika provberedningsbehov21 och diskuterar alternativ i det sista avsnittet i denna artikel (figur 1).
Vid denna tidpunkt bör läsaren notera att andra provberedningsmetoder är godtagbara för 1H R1ρ RD-experiment och att andra metoder för strukturell och funktionell analys kan utföras med proverna syntetiserade med den presenterade tekniken. 1 (på 1) H R1ρ RD-experiment kräver höga RNA-koncentrationer (helst >1 mM) samt hög homogenitet, både i RNA-längd och strukturell konformation för att säkerställa tillförlitlig karakterisering av molekylär dynamik. In vitro-transkription (IVT) är den metod som många forskare väljer för att producera 13C/15N-märkta RNA-prover på grund av tillgången på märkta nukleosid triphosphates (NTPs) och underlätta införlivande i den enzymatiska reaktionen22. Emellertid lider den allmänt använda T7 RNA-polymerasen (T7RNAP)23,24,25 från låg 5' homogenitet vid vissa initieringssekvenser26,27 och ofta också 3' homogenitet under transkriptionavrinning 28. Rening av mål RNA-arten blir dyrare och mödosam på grund av behovet av stora mängder ~ 200 nmol. Metoden som används här har presenterats tidigare där fördelar diskuterades i stort21. Kort sagt löser det beskrivna problem genom att transkribera en större tandemavskrift som sedan specifikt klyvs av Escherichia coli RNase H, vägledd av en chimerisk oligonukleotid29,30 (se figur 2 för detaljer).
Införlivande av en distanssekvens i tandemavskriftens ändar på 5' respektive 3" gör det möjligt att använda en initieringssekvens med hög avkastning och avlägsnande av terminalöverhäng nära linjäriseringsplatsen för plasmidmallen (figur 2B). Metoden visade sig förbättra avkastningen avsevärt, samtidigt som kostnaderna och arbetet minskade, med förbehållet för en mer komplex mallsyntes och behovet av ett ytterligare enzym och oligonukleotid. Den höga specificiteten hos RNase H klyvning underlättar rening på grund av bristen på RNA arter i ett liknande storleksintervall. Det nuvarande protokollet använder ett jonutbyte högpresterande vätskekromatografi (HPLC) steg som har publicerats av detta laboratorium nyligen31, även om andra metoder är möjliga alternativ. 1 (på 1) H R1ρ RD kan i allmänhet förvärvas på märkta eller omärkta prover med två respektive pulssekvenser, det "märkta" 1H R1ρ heteronukleära enskilda kvantkorrelationsprovet (HSQC)-baserat experiment med en indirekt dimension på 13C10 och det "omärkta" 1H R1ρ SELOPE-baserade experimentet med en indirekt dimension20på 1H.
Dessa tvådimensionella (2D) experiment kan fungera som en första kontroll, oavsett om dynamiken på R1ρ-tidsskalan finns i provet. En översikt över rd för alla lösta toppar i spektra kan erhållas, och toppar av intresse för en mer grundlig RD-analys kan identifieras. Detta innebär att även omärkta prover kan kontrolleras innan ett beslut om att ta fram ett dyrare, märkt prov görs. När en topp med konformationsutbytesbidrag har valts ut för att studeras mer noggrant är det bäst att byta till 1D-versionerna av ovanstående experiment (om toppen fortfarande kan lösas) för att utföra så kallade off-resonansexperiment. För den märkta versionen HSQC-överföringen till 13C ersätts med ett selektivt heteronukleärt korspolariseringssteg (HCP) som används i 13C R1ρ experiment32,33,34,35, medan experimentet i fallet med SELOPE-experimentet helt enkelt körs som en 1D, vilket är särskilt användbart för H8- och H2-signaler som ligger på diagonalen i 2D ändå. Ett kriterium för vilken sekvens som ska användas, förutsatt att både ett märkt och omärkt prov finns tillgängligt, är hur väl isolerad toppen av intresset är i de två experimenten.
I allmänhet rekommenderas SELOPE-experimentet för RNA-prover på upp till 50 nukleotider. För större RNAs kommer överlappningen att vara större; Strukturellt intressanta nukleotider förekommer dock ofta i kemiska skiftregioner som är mindre överlappande och fortfarande kan vara tillgängliga i ännu större RNAs. Ett annat argument skulle vara att i omärkta prover sker ingen J-koppling mellan 1H och 12C. Eftersom minsta spinnlåseffekt definieras av den minsta effekt som används för att frikoppla dessa två spinn (~1 kHz) i det märkta experimentet, tillåter det omärkta experimentet användningen av ett bredare utbud av spinnlås (SL) styrkor och därmed tillgång till en bredare tidsskala för utbyte. Dessa off-resonans experiment ger ytterligare information till kex, såsom populationen av det upphetsade tillståndet (alternativ konformator), pES, liksom mycket värdefull kemisk skiftinformation i form av Δω (den kemiska skiftskillnaden mellan marktillståndet och det upphetsade tillståndet).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Figur 1: Arbetsflöde för det presenterade protokollet. Förberedelse före den faktiska storskaliga provproduktionen, bestående av mallberedning och bekräftelse av framgångsrik in vitro-transkription och RNase H-klyvning. Storskalig produktion inklusive HPLC-rening, fyllning av NMR-rör och bekräftelse av RNA-vikning. Vid isotopmärkt syntes bör en omärkt rening utföras för gradientoptimering samma dag. NMR karakterisering av konformationsdynamik med R1ρ experiment. Varje steg kan utföras självständigt, t.ex. 1H R1ρ RD-analysen kan tillämpas på alla lämpliga RNA-prov som produceras med en annan metod. Förkortningar: IVT = in vitro-transkription; HPLC = högpresterande vätskekromatografi; NMR = kärnmagnetisk resonans; RD = avslappningsspridning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Syftet med detta protokoll är att ge praktiska detaljer och kritiska parametrar för studier av konformationsdynamik med 1H R1ρ avslappningsdispersion i RNA-hårnålsmolekyler. Efter att ha tillhandahållit ett detaljerat protokoll över design, syntes och jonutbyte HPLC-rening av ett mål-RNA som kan utföras med alla, vissa eller inga NTPs som 13C /15N-märkta versioner, har arbetsflödet för att slutföra NMR-provet och bekräfta konformationsutbytet med NMR-spektroskopi beskrivits. Slutligen beskrivs detaljerna för installationen av 1H R1ρ RD-experiment på en Bruker NMR-spektrometer (figur 1). Protokollet ger varje steg för att ställa in 1D-versionen för märkta prover och ytterligare kommentarer och en tabell för att justera för inställningen av SELOPE-versionen (tabell 2). Efter protokollet diskuteras kritiska steg och alternativa vägar till prov förberedelse och 1H R1ρ RD setup.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA är en mycket flexibel biomolekyl, där förändringar i strukturer spelar avgörande roller i de funktioner som RNA-molekyler utför som cellulära budbärare och modulatorer. Medan dessa dynamiska tillstånd förblir dolda för de flesta strukturella metoder, R1ρ avslappning dispersion (RD) spektroskopi gör det möjligt att studera konformationsdynamik i mikro-till millisekunder regim vid atomupplösning. Användningen av 1H som observerad kärna utökar ytterligare den tidsordning som omfattas och ger direkt tillgång till vätebindningar och basparning.
De utmanande stegen i en sådan studie är hög renhet och hög avkastning provberedning, potentiellt 13C- och 15N-märkta, samt installation av experiment och montering av data för att extrahera befolkning, växelkurs och sekundär struktur i det tidigare osynliga tillståndet. Detta protokoll ger viktiga praktiska steg i provberedning för att säkerställa beredning av ett lämpligt RNA-prov och installation av 1H R1ρ experiment med både isotopiskt märkta och omärkta RNA-prover.

Protokollet för RNA-produktion underlättar rening genom generering av hög renhetsavskrifter. Figur 3A visar resultaten av flera klyvningsreaktioner av tandemavskrifter, vilket ger både framgångsrika och misslyckade reaktioner. Körfält 1 visar det optimala fallet med en helt klyvd transkription med endast svaga spår av sidoprodukter. Lane 2a visar ofullständig klyvning, som kan lösas genom omglödgning och tillägg av mer RNase H (Lane 2b, steg 2.1.2). RNA-konstruktionerna av körfält 1, 2a och 2b är desamma. Provet i körfält 3 visar misslyckad klyvning. Felsökning av denna reaktion skulle innebära en kontroll av klyvningsguidesekvensen, renheten i DNA-mallen och glödgningstemperaturer. Eventuellt måste RNase H klyvning utföras efter T7 IVT som visas för prov 2.
Provet i körfält 4 visar en betydande mängd klyvning sidoprodukter, som är svåra att ta bort via jonbyte HPLC. Felsökning av ett sådant prov kan innebära a) sänkning av temperaturen, mängden RNase H eller reaktionstid, (b) minska elueringsgradienten och injektionsvolymen och försöka separera målfraktionerna från sidoprodukterna. Ytterligare information om hur man kan öka upplösningen i jonutbyte HPLC-rening har diskuterats av Karlsson et al.31. HPLC separerar mål-RNA från längre eller kortare nukleinsyror och protein- eller småmolekylsföroreningar. Figur 3B visar det optimala resultatet för jonbytet HPLC-rening. Elueringsgradienten bör väljas så att mål-RNA-arten eluerar minst en kolumnvolym (i detta exempel: 35 ml) efter nästa mindre art och en kolumnvolym före nästa större art.
Mindre arter i denna metod inkluderar enstaka nukleotider, abortiva produkter (8-12 nt), 3' och 5' distanssekvenser (5-14 nt) och klyvningsguide (12 nt chimerisk nukleinsyra), medan längre sekvenser är potentiellt uncleaved tandemrepetitioner och plasmiden. När en väl separerad elueringstopp uppnås kan reningen skalas upp till motsvarande ~20 ml IVT-reaktion per injektion. Den korrekta vikningen av ett RNA-prov är avgörande för RD-experiment och måste bekräftas före varje mätning. Figur 4 visar ett A-märkt 22-mer RNA innan vikningsprotokollet i steg 2.4 (blått) tillämpades, och samma prov efter att rätt vikning har uppnåtts (röd). En Mc-Fold sekundär struktur förutsägelse (Figur 4C) föreslår den presenterade hårnålsstrukturen med 4 baspar vilket resulterar i 5 imino signaler.
Båda spektra i figur 4A bekräftar dessa förväntade signaler, om än med något olika relativa intensiteter, vilket indikerar att vissa felveckade strukturer (här, en dimer) kan vara problematiska att bedöma med endast 1H 1D-spektra. Ett aromatiskt 1H,13C-HSQC-spektrum (figur 4B), visar dock endast 3 av de aromatiska signalerna för provet före vikningsprotokollet (blått), men alla 4 signaler för provet som har vikts enligt steg 2.4 (rött). Provet som visas i blått bildade sannolikt en homodimer (struktur som föreslås i figur 4D)som skulle resultera i samma iminosignaler som hårnålen. Signalen från A13H2 verkar börsför breddad. Dessa resultat hjälper till att belysa vikten av vikbar bekräftelse med både imino och aromatiska fingeravtrycksexperiment före varje RD-experiment. De 1H R1ρ pulssekvenser som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att upptäcka dynamik i mellanväxlingsregimen. Inledningsvis registreras en on-resonanskurva, och om det finns dynamik för en viss resthalt syns en dispersion inom de erhållna R2+REX-värdena, medan denna kurva är platt för rester utan utbyte.
Figur 5 visar representativa resonanskurvor som erhållits för två olika H8-atomer i en syntetisk RNA-hårnål (figur 5A), där G6H8 upplever utbyte (figur 5C), medan A4H8 inte gör det (figur 5B). Eftersom utbytet är relativt långsamt i detta prov (kEX = 292 ± 40 Hz) utnyttjades fördelen med SELOPE-experimentet för att uppnå låga SL-styrkor och de två on-resonanskurvorna registrerades med hjälp av 1D-versionen av pulssekvensen. Samma pulssekvens användes sedan för att erhålla data från avsonans för resterna som visade spridning i resonansprofilen. Figur 5D visar de erhållna R1ρ-värdena jämfört med förskjutningen där en liten asymmetri i kurvan redan anger tecknet på Δω.
Detta blir ännu tydligare i R2+REX-tomten där R1-bidraget tas bort ( figur5E). Den högra kolumnen i samma figur visar representativa resonanskurvor som erhållits för två olika H8-atomer i en något annorlunda syntetisk RNA-hårnål med snabbare utbyte, där G6H8 upplever utbyte (Figur 5G), medan A4H8 inte gör det (Figur 5F). Den snabbare växelkursen (kEX = 43 502 ± 38 478 Hz) gjorde det möjligt att omedelbart registrera alla aromatiska protoner på land med selope 2D-versionen för att erhålla både on- och off-resonansdata (G6H8-data som visas i figur 5H,I).
Allmänna identifierare för positiva och negativa resultat Positiva resultat i tandem IVT och RNase H klyvning kan identifieras enligt följande: 1) Målbandet är det starkaste bandet i denaturering PAGE gel. 2) Det finns inga eller bara svaga band runt huvudbandet. 3) Det finns inga eller endast svaga arter med högre molekylvikt. 4) HPLC-kromatogrammet visar en väl separerad topp av mål-RNA. 5) När huvudtoppen provtas visas endast ett band på en denaturerande PAGE-gel.
Negativa resultat i tandem IVT och RNase H klyvning närvarande enligt följande: 1) Nej eller bara ett svagt huvudband är synligt på en denaturerande PAGE gel. 2) Ett mönster av arter med hög molekylvikt från RNA tandemrepetitioner är synligt. 3) Även om huvudbandet är närvarande, är band med liknande intensitet över eller under huvudbandet inom ± 3 nt.
Ett välvikt prov kan identifieras enligt följande: 1) Antalet observerade iminoprotoner matchar antalet iminoprotoner som förväntas av en sekundär struktursimulering (t.ex.Mc-Fold39, figur 4A). 2) Syn G-U wobble basparet i en UUCG-slinga (om sådan finns) är synlig vid ~9,5 ppm, ibland endast synlig vid lägre temperatur. Fürtig och kollegorna 40 har beskrivit ytterligare fingeravtryck avUUCG-slingan. 3) Det aromatiska fingeravtrycket överensstämmer med ett tidigare tilldelat prov som har bekräftats vikas korrekt(figur 4C).
Ett felaktigt eller försämrat prov kan identifieras enligt följande: 1) Det finns fler iminosignaler än en sekundär struktursimulering förutsäger (OBS: färre iminosignaler innebär inte nödvändigtvis felkning, eftersom stängning av baspar ofta inte är synliga och konformationsutbyte breddar linjer). 2) Frånvaro av iminosignaler. 3) Smala signaler med hög intensitet i det aromatiska området, vilket indikerar produkter för nedbrytning av enstaka nukleotider. 4) Skillnader mellan imino- eller aromatiska signaler till ett referensprov med bekräftad vikning(figur 4C).
En atom som inte visar något utbyte i den påvisbara tidsskalan kan identifieras enligt följande: 1) från en platt RD-profil (på grund av det saknade REX-bidraget som varierar med den applicerade SL-kraften) (figur 5B och figur 5F). 2) Försiktighet måste vidtas vid långsam mellanbörs när kEX och Δω är av samma storlek. I så fall kan resonansbidraget vara mycket litet, vilket kan ses i figur 5C (i detta fall är de monterade parametrarna kEX = 292 ± 40 Hz och Δω = 112 ± 4 Hz). Om du är osäker kan en låg SL-avsonanskurva registreras för verifiering.
En atom som visar utbyte i mellantidsskalan kan identifieras 1) från en icke-platt avslappningsdispersionsprofil i ett rd-experiment på resonans (figur 5B och figur 5F). 2) en bredare linje i HSQC- eller SELOPE-experimentet kan också vara en indikator för utbyte.
Väl valda SL-effektvärden för off-resonanskurvor (Figur 5E, F): 1) har ett betydande k EX-bidrag i resonanskurvan (valda SL-effektvärden anges i figur 5C och figur 5G). 2) Eftersom off-resonanskurvor mäts för minst 3 SL-effektvärden bör de valda SL-effektvärdena spridas ut över regionen i resonanskurvan med kEX-bidrag. 3) Leda till icke-planA R2+REX-kurvor efter Laguerre-passformen(t.ex. figur 5D:SL-styrkor 25, 50 och 75 Hz; Figur 5E).
Dåligt valda SL-effektvärden för off-resonanskurvor (Bild 5E, F) leder till planA R2+REX-kurvor efter Laguerre-passformen. Ett exempel visas i figur 5E, där 100 Hz off-resonanskurvan är mycket platt och därför inte ger någon signifikant information om Δω.
Indikationer för roterande ram nukleära Overhauser effekt (ROE) artefakter: 1) Δω erhålls från off resonans kurvor matchar kemiska förskjutningar av protoner i rumslig närhet / protoner, som visar en korstopp med toppen av intresse för kärnämnet Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) spektrum. (t.ex.visar figur 5I breda off-resonanskurvor som förväntat för snabb mellanliggande utbyte, men kurvorna har också skarpare egenskaper, t.ex.vid -3000 Hz och +1500 Hz. Dessa beror mycket sannolikt på en ROE-artefakt snarare än en kemisk förändring för denna H8 i en annan konformator). 2) Laguerre fit fungerar, men fungerar inte bra (ger höga fel eller fysiskt omöjliga värden) för en on-resonans och minst 3 off-resonanskurvor, även om exponentiella medel erhölls från experiment med hög SINO (>20) (t.ex., kEX = 43,502 ± 38,478 Hz). Ofta passar varje SL individuellt bra, men att passa ihop dem ger ett mycket högre fel; det motsatta beteendet förväntas för ett verkligt upphetsad tillstånd.
Indikationer för "äkta" utbyte Δω:1) Δω som erhålls från off-resonanskurvor matchar inte kemiska förskjutningar av protoner i rumslig närhet/protoner, som visar en korstopp med toppen av intresset för NOESY-spektrumet (t.ex. figur 5E). 2) Laguerre fit ger låga fel för en resonans och minst 3 off-resonanskurvor(t.ex. figur 5E vs. Bild 5I, se bildtext för passformsresultat).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Figur 3: Provproduktion av tandem IVT och RNase H-klyvningsreaktion. (A) Denatureringssida av positiva och negativa resultat av tandem IVT- och RNase H-klyvning. Steghöjd avser RNA-referenser, 12* hänvisar till den chimeriska klyvningsguiden. Lane 1: Framgångsrik generation av ett 20 nt mål RNA. Få kortare och längre produkter finns. Lane 2a: Ofullständig klyvning av tandemavskriften. Även om HPLC-rening är möjlig, skulle mycket material slösas bort. Lane 2b: Fortsatt RNase H-klyvning av Lane 2 ger ett rent prov redo för HPLC-injektion (identisk med körfält 1). Lane 4: RNase H klyvning var i hög grad mislyckad, och inget upp i mål musikband producerades. Tandemavskriften i full längd är fortfarande synlig på 600 nt. Lane 5: Ett målband producerades, men ett starkt -1-band är på plats. Även om HPLC kan utföras, är noggrann borttagning av sidoprodukten nödvändig. (B) Exempel på en lyckad HPLC-injektion. Toppen på 38 min innehåller rent RNA av mållängden, medan längre och kortare produkter är väl åtskilda från mål-RNA. Panel B har ändrats från 21. Förkortningar: IVT = in vitro-transkription; HPLC = högpresterande vätskekromatografi; nt = nukleotider; AU = godtyckliga enheter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Figur 4: Exempel på en RNA-hårnål före (blå) och efter (röd) det vikbara steg 2.4 (se protokoll) i NMR. (A) Imino-regionen i ett 1H-1D-spektrum av ett A-märkt 22-mer RNA. Förväntade regioner för basparidentitet för iminosignaler anges i grått nedan. B) 1H,13C-HSQC-spektrum av RNA:s aromatiska resonanser från panel A. Provet efter vikning (rött) visar 4 signaler som förväntat, medan provet före vikning (blått) endast visar 3 signaler. Mc-Folds förutsägelse av 22-mer-RNA som hårnål. Fem iminosignaler kan förväntas från denna sekundära struktur, som finns i båda proverna i panel A. (D) Föreslagen struktur av en homodimer bildad av 22-mer RNA, vilket resulterar i samma 5 baspar som hårnålsstrukturen. Förkortningar: NMR = kärnmagnetisk resonans; 1D = endimensionell; HSQC = heteronukleär enda kvantkorrelation; ppm = delar per miljon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Figur 5: 1H R1ρ RD representativa resultat för två olika konstruktioner baserade på en RNA-hårnål. (A) Den vänstra kolumnen visar resultat som erhållits på RNA med ett C-G-baspar ovanför det utbuktade U, medan den högra kolumnen visar resultat som erhållits på ett prov där basparet byttes till G-C istället. BochF visardeplatta spridningsprofiler som erhållits för A4H8 för de två konstruktionerna, vilket inte tyder på något konformationsutbyte. (C–E) visa on-resonans, off-resonans och monterade data som erhållits för G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-passformen leder till följande resultat: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) visa on-resonans, off-resonans och monterade data som erhållits för G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-passformen leder till följande resultat: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43 502 ± 38 478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Denna siffra ändrades från 20. Förkortning: SL = spinnlås. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃÂ Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Vi presenterar ett protokoll för att mäta mikro- till millisekekunder dynamik på 13C /15N-märkta och omärkta RNA med 1H R1ρ avslappning dispersion kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Fokus för detta protokoll ligger i hög renhetsprovberedning och installation av NMR-experiment.

Praktiska aspekter av provberedning och installation av 1H R 1ρ avslappningsdispersionsexperiment av RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Detta protokoll beskriver RNA prov förberedelse och NMR setup för proton R1rho avslappning dispersion mätningar för att undersöka konfirmationsutbyte i RNA molekyler. Eftersom protoner undersöks behöver metoden inte isotopisk märkning och kan komma åt strukturella funktioner som förskjuten basparning direkt. Pipetten är ganska modulär i den meningen att R1rho avslappningsspridning kan mätas även om provet produceras med en annan metod.Börja med att förbereda plasmidprovet och ställa in en in vitro-transkription och klyvningsreaktion enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Inkubera reaktionen vid 37 grader Celsius i en timme. Späd sedan ut en mikroliter av provet tiofaldigt i lastlösningen.Och kör en mikroliter på en denaturerande PAGE-gel. Om klyvningsreaktionen lyckas, skala reaktionen till önskad volym och kör den över natten. Kör sedan en annan denaturerande PAGE-gel och utvärdera om klyvningsreaktionen har slutförts.Vid ofullständig klyvning, värm reaktionslösningen i en konventionell mikrovågsugn vid 450 watt i 15 sekunder. Kyl sedan lösningen långsamt till 37 grader Celsius i 40 minuter för att reanneal RNA och klyvningsguiden. Och notera bildandet av en ny fällning.Tillsätt mer oorganiskt pyrofosfatas och RNase H.Inkubera reaktionen i en till tre timmar vid 37 grader Celsius. Bekräfta sedan slutförandet av klyvningsreaktionen med denatureringssidan. När RNase H-klyvningsreaktionen är klar, släcker du reaktionen genom att tillsätta EDTA till en slutlig koncentration på 50 millimolär.Och virvel ordentligt. Filtrera lösningen genom ett 0,2 mikron sprutfilter. Och koncentrera lösningen till en volym som kan injiceras i ett HPLC-system för rening.Rengör röret genom att spola med rikligt med vatten innan du tillsätter det koncentrerade och renade provet i NMR-röret. Sedan RNase dekontaminering reagens, vatten och 95%etanol. Efter den slutliga sköljningen med vatten, låt det torka.Skölj kolven med vatten och använd en luddfri våtservett för att rengöra med RNase dekontamineringsreagens och 95% etanol. Efter torkning av röret och kolven, tillsätt 10% D2O till NMR-provet. Använd en stor pipettspets för att överföra RNA-provet till NMR-röret och flöda det längs sidan av rörväggen.Sätt in kolven i röret genom att trycka ner den med en snabb vridande rörelse för att ta bort luftbubblor och dra sedan upp kolven långsamt utan att skapa nya luftbubblor. Och fixa det med paraffin vaxfilm. Skapa ett nytt dataset baserat på en aromatisk protonkol HSQC-datauppsättning som används på helmärkta RNA-prover för RNA-tilldelning.Ange allmänna parametrar och rd-specifika parametrar. Ställ sedan protonspinnlåskraften på 1,2 kilohertz för testning. Generera en test-VD-lista med bara en post, noll millisekunder, ställ in TDF1 på en och uppdatera D30 för att köra ett testspektrum.När du har konfigurerat en test-vd-lista uppdaterar du D30 och TDF1. Och plotta toppens intensitet för olika spinnlåslängder. Identifiera den rotationslåslängd med vilken intensiteten på den ursprungliga toppen minskar till en tredjedel.Från resultatet av testkörningarna skapar du den slutliga vd-listan som ska användas i experimentet. Välj antalet skanningar så att listans svagaste topp har ett signal-till-brus-förhållande på minst 10. Resultaten av flera klyvningsreaktioner av tandemavskrifter visas här.En 20 nukleotid mål RNA genererades i en framgångsrik reaktion. Misslyckade reaktioner resulterade i ofullständig och misslyckad klyvning av provet. HPLC injektion av RNA prov visade en topp för ren mål RNA vid 38 minuter.Medan längre och kortare produkter var väl åtskilda från toppen av intresset. Analys av RNA hårnål visade att antalet observerade imino protoner matchade antalet imino protoner förväntas från en sekundär struktur simulering. Protonkol HSQC spektrum av aromatiska resonanser av RNA visade fyra signaler efter vikning.Och bara tre signaler innan viker. I representanten på resonans kurvor erhålls för två olika H8 atomer och två olika syntetiska RNA hårnålar, G6H8 upplever konfirmationsutbyte. Medan A4H8 inte gör det.För G6H8 valdes de färgade spinnlåskrafterna och resonansdata registrerades. I CG-konstruktionen där utbytet är långsamt visade R1rho-radvärdena kontra offsetdiagrammet redan en liten asymmetri i kurvan, vilket indikerar tecknet på den kemiska skiftskillnaden delta omega. Detta blir ännu tydligare i R2 plus REX-tomten där R1-bidraget tas bort.Å andra sidan upplever GC-konstruktionen snabbare utbyte och R1rho-värdena kontra offsetdiagram presenterade en bredare kurva där utvinningen av delta omega blir mindre uppenbar även i R2 plus REX-tomten. När RNA-dynamiken har bebelysts kan tillstånden karakteriseras och fångas. Dessa fångade tillstånd kan till exempel testas i biologiska analyser.Denna metod gör det möjligt för oss att observera funktionella, relevanta basparningsförskjutningar i ett aktivt microRNA miRNA-komplex, slinga omorganiseringar i ribosomal RNA och basparstabilitet på enkärna bulges.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 (på 5) N CPMG Avslappningsdispersion för undersökning av proteinkonformationsdynamik på tidsskalan μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Provberedning och relativ mängd med reduktiv metylering av aminer för peptidomikstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Provberedning med lipidmonalayermetod för elektronkristallkroografiska studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Paramagnetisk avslappningsförbättring för att upptäcka och karakterisera självassociationer av inneboende oordnade proteiner

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...