Name: modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle at JoVE.com

De ontwikkeling van het hier gedemonstreerde model werd ondersteund door DOD-subsidie W81XWH-12-1-0163, NIH-subsidies R21 CA179981 en R21 CA196202 en het Sato Metastasis Research Fund.

1. Celvoorbereiding
<ol><li>Laat cellen vrij uit weefselkweekschaal wanneer 70-90% samenvloeit door de aanbevolen richtlijnen voor de gebruikte cellijn te volgen.<ol>
<li>Aspireer bijvoorbeeld het groeimedium voor PC-3-cellen en was de schaal van 10 cm cellen met 5 ml calcium- en magnesiumvrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Aspireer de PBS voordat u 1 ml 0,25% trypsine toevoegt volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Voeg na het observeren van de loslating van de cellen onder een omgekeerd...

<ol>
	<li>Dillek&#229;s, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+90%+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases.">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells.">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li><li>Labelle, M., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+hours+of+metastasis:+the+importance+of+cooperative+host-tumor+cell+interactions+during+hematogenous+dissemination.">The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).</li><li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment.">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li><li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+inefficiency.">Metastatic inefficiency.</a> Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).</li><li>Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+number+of+tumor+metastases;+experiments+with+a+transplantable+mouse+tumor.">Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor.</a> Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+quantitative+analysis+of+distribution+and+fate+of+tumor+embolilabeled+with+125+I-5-iodo-2'-deoxyuridine.">Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine.</a> Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).</li><li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+metastasis+in+lung:+cell+survival,+dormancy,+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency.">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li><li>Luzzi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+nature+of+metastatic+inefficiency:+dormancy+of+solitary+cells+after+successful+extravasation+and+limited+survival+of+early+micrometastases.">Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.</a> American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+circulating+tumor+cell+capture+ability+of+a+slit+filter-based+method+in+comparison+to+a+selection-free+method+in+multiple+cancer+types.">Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types.</a> International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).</li><li>Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+metastasis--integrating+intravasation,+circulation+and+end-organ+colonization.">Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+fluid+shear+stress+is+a+conserved+biophysical+property+of+malignant+cells.">Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells.</a> PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Brass, L. F., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+physics+and+biorheology+in+the+setting+of+hemostasis+and+thrombosis.">Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).</li><li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulent+blood+flow+in+the+ascending+aorta+of+humans+with+normal+and+diseased+aortic+valves.">Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).</li><li>Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+shear+stress+and+hemodynamic+factors+in+a+model+of+coronary+artery+stenosis+and+thrombosis.">Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis.</a> The American Journal of Physiology. 265 (5), 1787-1796 (1993).</li><li>Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing,+aeration+and+cell+damage,+30++years+later:+what+we+learned,+how+it+affected+the+cell+culture+industry+and+what+we+would+like+to+know+more+about.">Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).</li><li>Vennin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trsient+tissue+priming+via+ROCK+inhibition+uncouples+pancreatic+cancer+progression,+sensitivity+to+chemotherapy,+and+metastasis.">Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.</a> Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).</li><li>Mitchell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+reduces+circulating+tumor+cell+resistance+to+fluid+shear+stress.">Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).</li><li>Ortiz-Otero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+confer+shear+resistance+to+circulating+tumor+cells+during+prostate+cancer+metastatic+progression.">Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression.</a> Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).</li><li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA/actomyosin-dependent+mechano-adaptation.">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li><li>Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tumour+cell+composition+in+tumours+composed+of+paired+mixtures+of+mammary+tumour+cell+lines.">Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines.</a> British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).</li><li>Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cancer+cell+mechanical+properties+after+fluid+shear+stress+exposure:+a+micropipette+aspiration+study.">Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study.</a> Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).</li><li>Gensbittel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+adaptability+of+tumor+cells+in+metastasis.">Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis.</a> Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).</li><li>O'Leary, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+ascorbate+inhibits+pancreatic+cancer+metastases+via+a+peroxide-mediated+mechanism.">Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).</li><li>Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolysis+near+a+transversely+oscillating+wire.">Hemolysis near a transversely oscillating wire.</a> Science. 169 (3948), 871-873 (1970).</li><li>Rooney, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolysis+near+an+ultrasonically+pulsating+gas+bubble.">Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble.</a> Science. 169 (3948), 869-871 (1970).</li><li>Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+inertial+positions+and+viability+of+cells+in+suspension+under+different+in+vivo+flow+conditions.">The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).</li><li>Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biorheology+of+tumor+cells.">The biorheology of tumor cells.</a> Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).</li><li>Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+induces+cancer+stem+cell-like+phenotype+in+MCF7+breast+cancer+cell+line+without+inducing+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition.</a> Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).</li><li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+shear+flow+alters+the+viability+and+proliferation+of+circulating+colon+cancer+cells.">Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 27073 (2016).</li><li>Fu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+MnSOD+promotes+survival+of+circulating+breast+cancer+cells+and+increases+their+resistance+to+doxorubicin.">High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin.</a> Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways.">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival/chemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow.">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li></ol>

Dit artikel demonstreert de toepassing van FSS op kankercellen in suspensie met behulp van een spuit en naald. Met behulp van dit model is aangetoond dat kankercellen beter bestand zijn tegen korte pulsen van fss op hoog niveau ten opzichte van niet-getransformeerde epitheelcellen15,22,24. Bovendien resulteert blootstelling aan FSS met behulp van dit model in een snelle toename van celstijfheid, activering van RhoA en verhoogde ...

Metastase, of de verspreiding van kanker buiten de oorspronkelijke tumorplaats, is een belangrijke factor die ten grondslag ligt aan kankersterfte1. Tijdens uitzaaiingen gebruiken kankercellen de bloedsomloop als een snelweg om zich te verspreiden naar verre locaties in het hele lichaam2,3. Terwijl op weg naar deze plaatsen, circulerende tumorcellen (CTC's) bestaan binnen een dynamische vloeibare micro-omgeving in tegenstelling tot die van hun oorspronkelijke primaire tumor3,4,5. Er is voorgesteld dat deze vloeibare micromilieu een van de vele barrières voor metastaseis 4. Er bestaat brede overeenstemming in het concept van gemetastaseerde inefficiëntie, d.w.z. dat de meeste CTC 's die in omloop komen, ofwel vergaan of geen productieve gemetastaseerde kolonies vormen6,7,8. Waarom metastase echter inefficiënt is vanuit het perspectief van een individuele CTC is minder zeker en blijft een actief onderzoeksgebied. CTC's worden losgemaakt van de extracellulaire matrix, beroofd van oplosbare groei- en overlevingsfactoren die aanwezig kunnen zijn in de primaire tumor, en op een veel andere manier blootgesteld aan het immuunsysteem en de hemodynamische krachten dan in de primaire tumor4. Elk van deze factoren kan bijdragen tot de slechte overleving van CTC's, maar hun relatieve bijdragen zijn onduidelijk. Dit artikel gaat in op de vraag hoe hemodynamische krachten CTC's beïnvloeden.
Het bestuderen van de effecten van hemodynamische krachten op CTC's is behoorlijk uitdagend. Momenteel zijn er geen in vitro systemen die de volledige spatiotemporale dynamiek (hart tot haarvaten) en reologische eigenschappen van het menselijk vasculaire systeem kunnen repliceren. Bovendien is niet helemaal duidelijk hoe CTC's de bloedsomloop ervaren. Experimenteel bewijs geeft aan dat de meeste kankercellen niet continu circuleren zoals bloedcellen. Vanwege hun relatief grote omvang (10-20 μm in diameter) raken de meeste CTC's eerder in capillaire bedden (6-8 μm in diameter) voor variabele tijdslengten (s tot dagen) waar ze kunnen sterven, extravaseren of worden verplaatst naar het volgende capillaire bed8,9,10,11. Er is echter enig bewijs dat de CTC-grootte in vivo heterogeener kan zijn en dat kleinere CTC's detecteerbaar zijn12. Daarom, op basis van afstand en bloedstroomsnelheid, kunnen CTC's slechts enkele seconden vrij circuleren tussen deze perioden van beknelling, hoewel een kwantitatieve beschrijving van dit gedragontbreekt 13.
Bovendien kunnen ze, afhankelijk van waar CTC's in de bloedsomloop terechtkomen, door meerdere capillaire bedden in de longen en andere perifere plaatsen en door zowel het rechter- als linkerhart gaan voordat ze hun eindbestemming bereiken. Onderweg worden CTC's blootgesteld aan verschillende hemodynamische spanningen, waaronder vloeistofschaarspanning (FSS), drukkrachten tijdens hun beknelling in de microcirculatie en mogelijk tractiekrachten onder omstandigheden waarin ze leukocytenachtig langs de wanden van bloedvaten kunnen rollen14. Zo is zowel het vermogen om de circulatie te modelleren als het begrip van het te modelleren CTC-gedrag beperkt. Vanwege deze onzekerheid moeten alle bevindingen van in vitro modelsystemen worden gevalideerd in een experimenteel gewerveld organisme en uiteindelijk bij kankerpatiënten.
Met de bovengenoemde kanttekeningen toont dit document een relatief eenvoudig model om FSS toe te passen op cellen in suspensie om de effecten van FSS op CTC's te onderzoeken die voor het eerst werden beschreven in 201215. FSS is het gevolg van wrijving van de bloedstroom tegen de vaatwand, die een parabolische snelheidsgradiënt produceert onder omstandigheden van laminaire stroming in grotere vaten. Cellen ervaren hogere niveaus van FSS in de buurt van vaatwanden en lagere niveaus in de buurt van het centrum van het bloedvat. Vloeibare viscositeit, debiet en afmetingen van de leiding waardoor de stroom optreedt, beïnvloeden FSS, zoals beschreven door de Hagen-Poiseuille-vergelijking. Dit geldt voor bloedstromen die zich gedragen als Newtoniaanse vloeistoffen, maar houdt geen stand voor de microcirculatie. Fysiologische FSS varieert over verschillende ordes van grootte met de laagste niveaus in de lymfeklieren (<1 dyn/cm2) en de hoogste in regio's rond hartkleppen en atherosclerotische plaques (>500 dyn/cm2)5. Gemiddelde wandschaar stress in slagaders is 10-70 dyn/cm2 en 1-6 dyn/cm2 in aderen16,17.
In het hart kunnen cellen worden blootgesteld aan turbulente stromen rond klepbijsluiters waar fss op zeer hoog niveau, maar zeer korte duur kan worden ervaren18,19. Hoewel het bioprocessingveld de effecten van FSS op zoogdiercellen in suspensie lang heeft bestudeerd, kan deze informatie van beperkte waarde zijn voor het begrijpen van de effecten van FSS op CTC's, omdat het zich over het algemeen richt op veel lagere fss-niveaus die gedurende een lange duur worden toegepast20. Zoals hieronder beschreven, kan men met behulp van een spuit en naald relatief hoge (tientallen tot duizenden dyn/cm2)FSS gedurende een relatief korte (milliseconden) duur toepassen op een celsuspensie. Sinds de eerste beschrijving van dit model15hebben anderen het gebruikt om de effecten van FSS op kankercellen21 , 22,23te bestuderen . Meerdere "pulsen" van FSS kunnen in korte tijd op celsuspensingen worden toegepast om downstream experimentele analyses te vergemakkelijken. Dit model kan bijvoorbeeld worden gebruikt om het vermogen van cellen te meten om mechanische vernietiging door FSS te weerstaan door de levensvatbaarheid van cellen te meten als functie van het aantal toegepaste pulsen. Als alternatief kunnen de effecten van FSS-blootstelling op de biologie van kankercellen worden onderzocht door cellen te verzamelen voor een verscheidenheid aan downstream-analyses. Belangrijk is dat een deel van de celophanging is gereserveerd als een statische regeling om de effecten van FSS te vergelijken met die welke kunnen worden geassocieerd met celloslating en de tijd die in de suspensie wordt vastgehouden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black bottom plate</td>
			<td>Costar - Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence detector</td>
			<td>AMI</td>
			<td>AMI HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Titer Blue</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>D-LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle

Tijdens uitzaaiingen krijgen kankercellen uit vaste weefsels, waaronder epithelia, toegang tot de lymfe- en hematogene circulatie waar ze worden blootgesteld aan mechanische stress als gevolg van hemodynamische stroming. Een van deze spanningen die circulerende tumorcellen (CTC's) ervaren, is fluid shear stress (FSS). Terwijl kankercellen lage niveaus van FSS in de tumor kunnen ervaren als gevolg van interstitiële stroom, worden CTC's, zonder extracellulaire matrixaanhechting, blootgesteld aan veel grotere niveaus van FSS. Fysiologisch varieert FSS over 3-4 ordes van grootte, met lage niveaus aanwezig in lymfeklieren (<1 dyne/cm2) en de hoogste niveaus die kort aanwezig zijn als cellen door het hart en rond hartkleppen gaan (>500 dynes/cm2). Er zijn een paar in vitro modellen ontworpen om verschillende reeksen fysiologische schuifspanning over verschillende tijdsbestekken te modelleren. Dit artikel beschrijft een model om de gevolgen van korte (milliseconde) pulsen van fss op hoog niveau op kankercelbiologie te onderzoeken met behulp van een eenvoudig spuit- en naaldsysteem.

Eerder is aangetoond dat verhoogde resistentie tegen fss-geïnduceerde mechanische vernietiging een geconserveerd fenotype is over meerdere kankercellijnen en kankercellen die vers geïsoleerd zijn van tumoren ten opzichte van niet-getransformeerde epitheelcelvergelijkers15,24. Hier werden aanvullende kankercellijnen van verschillende weefseloorsprongen (tabel 2) getest om aan te tonen dat de meerderheid van deze cellen levensvatbaarheid ≥ 20% ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle at JoVE.com

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Hier demonstreren we een methode om vochtscheringsspanning toe te passen op kankercellen in suspensie om de effecten van hemodynamische stress op circulerende tumorcellen te modelleren.

Modelleren van de effecten van hemodynamische stress op circulerende tumorcellen met behulp van een spuit en naald

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Dit protocol stelt kankercellen in een suspensie bloot aan korte pulsen van vloeistofschaarspanning om bepaalde aspecten na te bootsen van hoe gemetastaseerde kankercellen worden blootgesteld aan hemodynamische krachten terwijl ze zich in de bloedsomloop bevinden. Het is een relatief eenvoudige techniek om korte pulsen van hoge vloeistofschaarspanning toe te passen. Let bij het proberen van dit protocol op ongeappte naalden en buig ze niet, omdat dit de toegepaste krachtschaarspanning zal veranderen.Deze procedure kan aërosolen produceren, dus gebruik passende veiligheidsmaatregelen. Laat om te beginnen 70 tot 90% samenvloeiende PC3-cellen uit de weefselkweekschaal vrij door het groeimedium aan te spireren en de schaal van 10 centimeter te wassen met vijf milliliter calcium- en magnesiumvrije PBS. Aspireer vervolgens de PBS en voeg een milliliter van 0,25% trypsine toe.Observeer na de trypsinisatie de loslating van de cellen onder een omgekeerde microscoop. Om de trypsine te remmen, voegt u vijf milliliter DMEM/F12-medium toe dat 10% FBS bevat. Plaats vervolgens de celsuspensie in een conische buis en bepaal de celconcentratie en het totale celnummer.Centrifugeer de celsuspensie gedurende drie minuten op 300 x g, aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in een serumvrij weefselkweekmedium. Snijd rond de bodem van 14 milliliter polystyreen buis op de zeven milliliter lijn en plaats de gemengde cel suspensie in de snijbuis. Verzamel afzonderlijk statische controlemonsters van cellen voordat de vloeistofschaarspanning wordt blootgesteld aan gebruik voor het uitvoeren van assays.Om het resterende celsuspensiemonster bloot te stellen aan vloeistofschuivingsspanning, trekt u de celsuspensie in een spuit van vijf milliliter en bevestigt u een 30 gauge halve inch naald. Plaats en bevestig de spuit met een ongeappte naald op een spuitpomp en stel het debiet in om het gewenste niveau van vloeistofschaarspanning te bereiken. Laat de spuitpomp draaien en verzamel het geschoren monster in de snijbuis onder een hoek van ongeveer 45 graden om schuimvorming te verminderen.Verwijder de spuit voorzichtig uit de spuitpomp en gebruik een tang om de naald te verwijderen, zorg ervoor dat u deze niet aanraakt. Herhaal de procedure totdat de celsuspensie is blootgesteld aan het gewenste aantal pulsen van vloeistofschaarspanning. Voer levensvatbaarheidstesten uit met de statische monsters voordat u de cellen blootstelt aan vloeistofschaarspanning.Breng voor enzymatische assays 100 microliter aliquots uit de statische monsters in tweevoud over in een 96-putplaat. Verzamel vervolgens 100 microliters monsters na blootstelling aan vloeistofschaarspanning en plaats ze in een plaat met 96 putten. Voeg 20 microliter van een resazurin-oplossing van 0,15 milligram per milliliter toe aan elk monsterput en aan putten die alleen al 100 microliter medium bevatten.Incubeer de putplaten in de weefselkweek-incubator van 37 graden Celsius gedurende twee uur, meet vervolgens de fluorescentie en absorptie met behulp van een plaatlezer en verkrijg het percentage levensvatbare cellen door het gemiddelde signaal van elk van de blootgestelde monsters van de vloeistofschaarspanning te vergelijken met het gemiddelde tot het statische controlemonster. Verzamel ook aliquots uit statische monsters om flowcytometrie en clonogene assays uit te voeren zoals beschreven in het teksthandschrift. In de representatieve analyse werd de levensvatbaarheid van syngenetische biopsie borstepitheelkankercellen beoordeeld met behulp van resazurineconversie na het blootstellen van cellen aan een aantal fluid shear stress pulsen.Hoewel elke cellijn verschillende weerstandsprofielen vertoonde, was er geen significant verschil in levensvatbaarheid na 10 pulsen van blootstelling aan vloeistofschaarspanning. Extra kankercellijnen van verschillende weefseloorsprongen toonden de levensvatbaarheid van meer dan 20% aan na 10 pulsen van vloeistofschaarspanning, met uitzondering van MIA PaCa-2-cellen, die een levensvatbaarheid van minder dan 10% vertoonden als gevolg van gevoeligheid voor mechanische vernietiging door vloeistofschaarspanning. Let er bij het verzamelen van het statische monster voorafgaand aan het aanbrengen van afschuifspanning voor vloeistoffen op dat de celsuspensie homogeen wordt gemengd.Verwijder de naald voorzichtig met een tang en buig of raak de naald niet aan. Naast het meten van de levensvatbaarheid van cellen, kan men veranderingen in genexpressie, celsignalering, proliferatie en migratie evalueren. Met behulp van dit als een model van blootstelling aan vloeistofschaar stress, kan men zowel bestuderen hoe kankercellen weerstaan vernietiging door vloeistofschaar stress en evalueren van de effecten van vloeistofschaar stress op de biologie van kankercellen.Deze techniek is gebruikt door ons laboratorium en anderen om de effecten van vloeistofschaarspanning op circulerende tumorcellen te onderzoeken. Deze studies hebben aangetoond dat vloeistofschaarstress snel de mechanische eigenschappen van kankercellen verandert en dat dit bijdraagt aan het vermogen van kankercellen om vernietiging door vloeistofschaarstress te weerstaan.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Een methode om de effecten van milieu verrijking op de dikke darm Microbiome biodiversiteit in een muismodel van het Colon-Tumor definiëren

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...